專利名稱：一種多層結(jié)構(gòu)的復(fù)雜組織器官前體的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物組織和器官的人工制造技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及利用合成高分子材料、細胞 一基質(zhì)材料制備組織器官前體的工藝方法，屬于生物組織工程技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
世界上每年患有組織缺損或器官衰竭的病人數(shù)逾千萬，僅美國每年以外科手術(shù)治療此類 病人約800萬。然而，活體供體器官有限，現(xiàn)有的機械裝置不具備器官的所以功能，不能防 止患者的病情進一步惡化。據(jù)此，以提高此類疾患治療水平為宗旨的組織工程(Tissue Engineering)技術(shù)應(yīng)運而生。組織工程是一門由生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、材料學(xué)、工程學(xué)等多學(xué)科交 叉產(chǎn)生的高新技術(shù)學(xué)科。其含義是應(yīng)用生命科學(xué)與工程學(xué)的原理與技術(shù)，在正確認識哺乳動 物的正常及病理兩種狀態(tài)下的組織結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系的基礎(chǔ)上，研究、開發(fā)用于修復(fù)、維護、 促進人體各種組織或器官損傷后的功能和形態(tài)的生物替代物[Merem RM. Med &Biol Eng &Comput. 1992;30:8-12]。近十年來，科學(xué)家們運用組織工程技術(shù)，利用人體殘余器官的少 量正常細胞進行體外繁殖，獲得患者所需的、具有相同功能的器官，又不存在排斥反應(yīng)，已 取可喜的成果，不少新近成立的生物技術(shù)公司正準備正在投入巨資實現(xiàn)商品化。在美國，已 形成價值40億美元的產(chǎn)業(yè)，并以每年25%的速度遞增。如Pro Osteon珊瑚骨移植材料產(chǎn)值 超過1000萬美元[Miller M, Biotech Bioeng， 1996:50:4347-4348]。但現(xiàn)存的組織工程技 術(shù)面臨許多困難和限制，組織工程應(yīng)用研究所取得的成功均是在那些結(jié)構(gòu)與生理功能較為簡 單的組織器官如骨骼、軟骨、皮膚。傳統(tǒng)組織工程方法一般先制備結(jié)構(gòu)支架，在進行細胞培 養(yǎng)過程中由于上層細胞消耗大部分的氧氣和營養(yǎng)，限制了這些組分向底層擴散，從而限制了 細胞向支架深層的遷移等。這種先制備支架，再培養(yǎng)細胞的方法，耗時又費力，細胞在向支 架內(nèi)遷移的過程中很可能就已經(jīng)變型、老化，達不到及時治療臨床病人的要求。傳統(tǒng)的支架 制備技術(shù)很難形成具有分支貫通的營養(yǎng)供應(yīng)通道。同時傳統(tǒng)的組織工程技術(shù)不能滿足將不同 的細胞在空間準確定位與定點放置，構(gòu)建復(fù)雜組織器官的功能梯度結(jié)構(gòu)的需求。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種復(fù)雜組織器官前體的制備方法，旨在前人工作的基礎(chǔ)上，利用 分步模具/萃取法，實現(xiàn)細胞和支架材料在空間的準確定位，利用模具組合、高分子凝固成形 等原理實現(xiàn)復(fù)雜組織器官的重建，克服組織工程存在的在三維支架中誘導(dǎo)培養(yǎng)細胞需要時間 長、細胞分布不均勻，細胞很難滲入到深層結(jié)構(gòu)中等缺點，從而達到修復(fù)再生的目的。
本發(fā)明的技術(shù)方案如下
一種多層結(jié)構(gòu)的復(fù)雜組織器官前體的制備方法，其特征在于該方法按如下步驟進行1) 將合成高分子材料溶于有機溶劑中制成質(zhì)量百分濃度為1% 30%的合成高分子溶
液；
2) 將動物體細胞懸浮液:^質(zhì)量百分濃度為10% 30%的天然高分子溶液按1 9: 9 1 體積比混合制成細胞基質(zhì)溶液；
3) 將合成高分子溶液罐注到預(yù)先設(shè)計的內(nèi)模具中，形成單層合成高分子材料內(nèi)支架， 通過水溶液將內(nèi)支架中的有機溶劑萃取掉；
4) 預(yù)先設(shè)計好不同直徑的中間模具，將至少兩個中間模具套在單層合成高分子材料內(nèi) 支架的外部，將細胞基質(zhì)溶液罐注到內(nèi)支架和中間模具之間，以及中間模具和中間模具之間 的縫隙中，形成細胞基質(zhì)中間層；再經(jīng)物理或化學(xué)交聯(lián)方法，使細胞基質(zhì)溶液中的天然高分 子交聯(lián)，形成穩(wěn)定的合成高分子材料內(nèi)支架與細胞基質(zhì)中間層的雙層結(jié)構(gòu)；
5) 將細胞基質(zhì)中間層的雙層結(jié)構(gòu)裝入預(yù)先設(shè)計好的外模具中，再將合成高分子溶液灌 入雙層結(jié)構(gòu)與外模具的縫隙中，形成外層合成高分子材料層；
6) 用細胞培養(yǎng)液萃取外層合成高分子材料層中的溶劑，去除模具，即制成多層結(jié)構(gòu)的 復(fù)雜組織器官前體。
本發(fā)明所述的合成高分子材料采用聚氨酯、乳酸與乙醇酸共聚物、聚乳酸和聚酯中的一 種或兩種材料的復(fù)合物。所述的天然高分子材料采用明膠、纖維蛋白原、膠原、殼聚糖、海 藻酸鈉、透明質(zhì)酸和纖粘連蛋白中的至少一種。用于溶解所述合成高分子材料的有機溶劑采 用四乙二醇、乙二醇、異丙醇或l， 4-二氧六環(huán)；用于溶解所述天然高分子材料的溶劑采用 水、生理鹽水、PBS溶液、pH-6 8的0.09M氯化鈉、3—羥甲基氨基甲垸鹽酸溶液或細胞培 養(yǎng)液。
本發(fā)明的技術(shù)特征還在于在細胞基質(zhì)溶液中還可加入體積百分比為1% 30%的凍存 保護劑甘油、二甲基亞砜、乙二醇和葡聚糖中的一種或兩種材料的混合物。還可在細胞基質(zhì) 溶液中加入體積百分比為0.001% 0.1%細胞生長因子。如內(nèi)皮細胞生長因子、細胞轉(zhuǎn)移 因子或肝細胞生長因子。
本發(fā)明所制備的復(fù)雜組織器官前體中合成高分子支架材料具備優(yōu)異的機械性能，可以與 體內(nèi)的管道系統(tǒng)相連接。其中細胞基質(zhì)溶液具有優(yōu)異的生物相容性，多種細胞可以在其中形 成多種組織。本發(fā)明可以實現(xiàn)不同細胞/天然高分子材料與合成高分子支架材料在空間的準確 定位，克服了組織工程目前存在的在三維支架中誘導(dǎo)培養(yǎng)細胞需要時間長，細胞在支架中分 布不均勻，細胞很難滲入到深層結(jié)構(gòu)中等缺點。本發(fā)明利用分步模具/萃取法、高分子凝固成 形等原理可以達到復(fù)雜器官中不同部位不同細胞類型及結(jié)構(gòu)類型的要求，實現(xiàn)復(fù)雜組織器官 的重建，從而達到修復(fù)再生的目的。
具體實施例方式
本發(fā)明提供的一種多層結(jié)構(gòu)的復(fù)雜組織器官前體的制備方法，其具體工藝步驟如下
41) 將合成高分子材料溶于有機溶劑中制成質(zhì)量百分濃度為1% 30%的合成高分子溶液; 所述的合成高分子材料采用聚氨酯、乳酸與乙醇酸共聚物、聚乳酸和聚酯中的一種或兩種材 料的復(fù)合物；用于溶解所述合成高分子材料的有機溶劑采用四乙二醇、乙二醇、異丙醇或l， 4-二氧六環(huán)；
2) 將動物體細胞懸浮液與質(zhì)量百分濃度為10% 30%的天然高分子溶液按1 9: 9 1體積比混合制成細胞基質(zhì)溶液；所述的天然高分子采用明膠、纖維蛋白原、膠原、殼聚糖、 海藻酸鈉、透明質(zhì)酸和纖粘連蛋白中的一種或兩種以上的復(fù)合物；其中所述的明膠與殼聚糖、 明膠與纖維蛋白原或明膠與海藻酸鈉的混合溶液中明膠與殼聚糖、纖維蛋白原或明膠與海藻
酸鈉的質(zhì)量比0.5 100: 1;用于溶解所述天然高分子材料的溶劑采用水、生理鹽水、PBS
溶液、pH二6 8的0.09M氯化鈉、3—羥甲基氨基甲烷鹽酸溶液或細胞培養(yǎng)液。，
3) 將合成高分子溶液罐注到預(yù)先設(shè)計的內(nèi)模具中，形成單層人工合成高分子材料內(nèi)支 架，通過水溶液將支架中的有機溶劑萃取掉；
4) 預(yù)先設(shè)計好不同直徑的中間模具，將至少兩個中間模具套在單層人工合成高分子材 料內(nèi)支架的外部，將細胞基質(zhì)溶液罐注到內(nèi)支架和中間模具之間，以及中間模具和中間模具 之間的縫隙中，形成細胞基質(zhì)中間層；再經(jīng)物理或化學(xué)交聯(lián)方法使細胞基質(zhì)溶液中的天然高 分子交聯(lián)，利用濃度為0. 1 1%的戊二醛溶液、凝血酶、1 20%乳酸鈣、氯化鈣或三磷酸鈉 水溶液交聯(lián)形成，穩(wěn)定的人工合成高分子材料內(nèi)支架與細胞基質(zhì)中間層的雙層結(jié)構(gòu)；；
5) 將雙層結(jié)構(gòu)裝入預(yù)先設(shè)計好的外模具中，再將合成高分子溶液灌入雙層結(jié)構(gòu)與外模 具的縫隙中，形成外層合成高分子材料層，用細胞培養(yǎng)液萃取外層合成高分子材料層中的溶 劑，去除模具，即制成多層結(jié)構(gòu)的復(fù)雜組織器官前體。
本發(fā)明的優(yōu)選方案是所述天然高分子溶液中還可加入體積百分比為1% 30%的凍存保 護劑甘油、二甲基亞砜、乙二醇和葡聚糖中的一種或兩種材料的混合物，或同時或單獨加入 體積百分比為0. 001% 0. 1%細胞生長因子如內(nèi)皮細胞生長因子、細胞轉(zhuǎn)移因子重量百分 比為1%的溶液。
下面通過幾個具體的實施例對本發(fā)明作進步的說明
實施例1: (1)制備一系列口徑不等的圓柱形模具；(2)配備濃度為10% (W/V)的PLGA/ 四乙二醇(Tetraglycol)溶液，加入1% (W/W)的肝素。在封閉式內(nèi)模具中注入復(fù)合肝素的 PLGA/四乙二醇溶液，然后在蒸餾水中萃取溶劑形成PLGA內(nèi)支架；(3)配制纖維蛋白原溶液， 將第一中間模具套在PLGA內(nèi)支架外部。在第一中間模具與PLGA支架中注入纖維蛋白原/脂肪 干細胞混合物(細胞密度為1X10S個/ mL)，加入肝細胞生長因子(HGF0.5 ng/mL)、人血小 板衍化生長因子(BB或PDGF-BB 50 ng/mL)、轉(zhuǎn)化生長因子ei (TGFP1 10 ng/mL)和堿性 成纖維細胞生長因子(b-FGF 2.5 ng/mL)。把附著PLGA支架的細胞/基質(zhì)材料置于外模具中， 使細胞天然高分子材料分布均勻，注入凝血酶溶液(20IU/mL)使細胞/天然高分子材料層形成穩(wěn)定結(jié)構(gòu)；(4)將第二中間模具套在上述雙層結(jié)構(gòu)外部，在雙層結(jié)構(gòu)與第二中間模具間注 入明膠/纖維蛋白原與內(nèi)皮細胞的混合物，細胞密度為lXl(^個/mL，用凝血酶溶液(20IU/mL) 浸泡成形物2分鐘；(5)將外模具套在上述三層結(jié)構(gòu)外部，在三層結(jié)構(gòu)與外模具間注入 PLGA/Tetraglycol溶液，然后按照(1)相同的方法成形外層PLGA層，經(jīng)過PBS萃取后完成 人工血管前體的制備。
實施例2: (1)用硅橡膠制備帶分支管道的內(nèi)模具、中間模具及外模具；(2)在內(nèi)模具 中注入5%的聚氨酯/乙二醇溶液，經(jīng)過PBS萃取形成內(nèi)支架；(3)將第一中間模具套在PLGA 內(nèi)支架外部，在內(nèi)支架與第一中間模具中注入含1°/。紫杉醇的纖維蛋白原/內(nèi)皮細胞混合物(細 胞密度為1X107個/ mL)，形成雙層結(jié)構(gòu)材料；(4)將第二中間模具套在上述雙層結(jié)構(gòu)外部， 在第二中間模具與雙層結(jié)構(gòu)材料中注入明膠/纖維蛋白原與脂肪干細胞的混合物，細胞密度為 1Xl(f個/mL，形成三層結(jié)構(gòu)材料；(5)將第三中間模具套在上述三層結(jié)構(gòu)外部，在第三中 間模具與三層結(jié)構(gòu)材料中注入纖維蛋白原/肝細胞混合物(細胞密度為1X1(T個/ mL)，用凝 血酶溶液(10IU/mL)浸泡成形物l分鐘，形成四層結(jié)構(gòu)材料；(6)將外模具套在上述三層結(jié) 構(gòu)外部，在外模具與四層結(jié)構(gòu)材料間注入5%的聚氨酯/乙二醇溶液，加入5%的紫杉醇，攪拌 均勻，然后按照(1)相同的方法成形外層聚氨酯層，經(jīng)過PBS萃取后完成可植入型人工肝臟 前體的制備。
實施例3: (1)制備一系列口徑不等的圓柱形模具；(2)在內(nèi)模具中注入30%的聚乳酸/ 異丙醇溶液，經(jīng)過PBS萃取形成內(nèi)支架；(3)將第一中間模具套在內(nèi)支架外部，在內(nèi)支架與 第一模具間注入1%檸檬酸鈉的膠原/內(nèi)皮細胞混合物(細胞密度為1X107個/mL)， 37t:下放 置10分鐘，使膠原/內(nèi)皮細胞混合物結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，去掉模具；(4)將第二中間模具套在上述內(nèi) 支架外部，在內(nèi)支架與第一中間模具間注入膠原/內(nèi)皮細胞混合物；(5)將第三中間模具套在 上述在內(nèi)支架與膠原/內(nèi)皮細胞混合物雙層結(jié)構(gòu)外部，在第三中間模具與雙層結(jié)構(gòu)間中注入膠 原/平滑肌細胞混合物(細胞密度為1X107個/ mL); 37'C下放置10分鐘，使膠原/平滑肌細 胞混合物結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，去掉模具；(6)將第四中間模具套在上述內(nèi)支架與膠原/內(nèi)皮細胞混合物、 膠原/平滑肌細胞混合物三層結(jié)構(gòu)外部，并在內(nèi)支架與膠原/內(nèi)皮細胞混合物、膠原/平滑肌細 胞混合物與第四中間模具間中注入膠原與脂肪干細胞/乳鼠心肌細胞(1: 1)的混合物，細胞 密度為1X106個/mL， 37t:孵箱中放置10分鐘，使其四層材料結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，去掉模具；(7)將 外模具套在上述內(nèi)支架與膠原/內(nèi)皮細胞混合物、膠原/平滑肌細胞混合及膠原與脂肪干細胞/
乳鼠心肌細胞混合物外部，在四層材料與外模具間注入濃度為30%的聚乳酸/異丙醇溶液，加 入30%的檸檬酸鈉，攪拌均勻，然后按照(1)相同的方法成形外層聚乳酸層，經(jīng)過PBS萃取 后完成可植入型人工心臟前體的制備。
實施例4: (1)用聚四氟乙烯制備帶分支管道的內(nèi)模具、中間模具及外模具，在內(nèi)模具 中間模具間注入30y。PU/四乙二醇溶液，經(jīng)過PBS萃取形成內(nèi)支架；(2)將第一中間模具套在內(nèi)支架外部，在內(nèi)支架及第一中間模具間注入下列溶液。纖維蛋白原和明膠兩種天然生物材 料分別溶于磷酸緩沖液(PBS)溶液中制成10%和30%的高分子溶液，再按l:l (v/v)比例混 合均勻。然后按體積比加入10%的二甲基亞砜、5%葡聚糖；將脂肪干細胞與腎小球細胞按l: l比例混合均勻，加入高分子溶液中，得到脂肪干細胞一腎小球細胞-明膠一纖維蛋白原-二 甲基亞砜-葡聚糖混合物(細胞密度為1X104個/ mL);在內(nèi)支架與第一中間模具間注入上述 混合物并用凝血酶溶液(30IU/mL)固定2分鐘；(3)將第一中間模具套在上述雙層結(jié)構(gòu)外部， 在雙層結(jié)構(gòu)與第一中間模具間注入30y。PU/四乙二醇溶液，經(jīng)過PBS萃取溶劑，形成三層結(jié)構(gòu)； (4)將上述三維結(jié)構(gòu)體在4。C下放置半小時，然后-2(TC冰箱中辦小時，最后放入-70°C低 溫冰箱液氮中低溫保存，使用時快速復(fù)溫，培養(yǎng)以備使用。
實施例5: (1)制備一系列口徑不等的橢圓形模具，在內(nèi)模具中注入含3%紫杉醇的30% 聚酯/四異二醇溶液，蒸溜水萃取溶劑，形成內(nèi)支架；(2)將第一中間模具套在內(nèi)支架外部， 在內(nèi)支架及第一中間模具間注入下列混合物。將纖維蛋白原溶于磷酸緩沖液(PBS)溶液中制 成10%高分子溶液。然后按體積比加入體積百分比為20%的甘油、5%葡聚糖；將脂肪干細胞與 胰島細胞按2: l比例混合均勻，加入高分子混合溶液中(細胞密度為1X1()7個/ mL)，得到 脂肪干細胞一胰島細胞、明膠一纖維蛋白原-二甲基亞砜-葡聚糖混合物；將上述混合物注入 到內(nèi)支架與第一中間模具中，用凝血酶溶液(10IU/mL)固定2分鐘，形成雙層結(jié)構(gòu)材料；(3) 將上述雙層材料放入外模具中，注入含3%紫杉醇的30%聚酯/四異二醇溶液，經(jīng)過蒸溜水萃取 溶劑，形成三層結(jié)構(gòu)材料；(4)將三層結(jié)構(gòu)材料在4t:下放置半小時，然后-2(TC冰箱中辦小 時，最后放入-196。C液氮中低溫保存，使用時快速復(fù)溫，加入培養(yǎng)液于37。C、 5%0)2條件下 培養(yǎng)備用。
權(quán)利要求
1.一種多層結(jié)構(gòu)的復(fù)雜組織器官前體的制備方法，其特征在于該方法按如下步驟進行1)將合成高分子材料溶于有機溶劑中制成質(zhì)量百分濃度為1％～30％的合成高分子溶液；2)將動物體細胞懸浮液與質(zhì)量百分濃度為10％～30％的天然高分子溶液按1～9∶9～1體積比混合制成細胞基質(zhì)溶液；3)將合成高分子溶液罐注到預(yù)先設(shè)計的內(nèi)模具中，形成單層合成高分子材料內(nèi)支架，通過水溶液將內(nèi)支架中的有機溶劑萃取掉；4)預(yù)先設(shè)計好不同直徑的中間模具，將至少兩個中間模具套在單層合成高分子材料內(nèi)支架的外部，將細胞基質(zhì)溶液罐注到內(nèi)支架和中間模具之間，以及中間模具和中間模具之間的縫隙中，形成細胞基質(zhì)中間層；再經(jīng)物理或化學(xué)交聯(lián)方法，使細胞基質(zhì)溶液中的天然高分子交聯(lián)，形成穩(wěn)定的合成高分子材料內(nèi)支架與細胞基質(zhì)中間層的雙層結(jié)構(gòu)；5)將細胞基質(zhì)中間層的雙層結(jié)構(gòu)裝入預(yù)先設(shè)計好的外模具中，再將合成高分子溶液灌入雙層結(jié)構(gòu)與外模具的縫隙中，形成外層合成高分子材料層；6)用細胞培養(yǎng)液萃取外層合成高分子材料層中的溶劑，去除模具，即制成多層結(jié)構(gòu)的復(fù)雜組織器官前體。
2. 按照權(quán)利要求1所述的一種多層結(jié)構(gòu)的復(fù)雜組織器官前體的制備方法，其特征在于 所述的合成高分子材料采用聚氨酯、乳酸與乙醇酸共聚物、聚乳酸和聚酯中的一種或兩種材 料的復(fù)合物。
3. 按照權(quán)利要求1所述的一種多層結(jié)構(gòu)的復(fù)雜組織器官前體的制備方法，其特征在于 所述的天然高分子材料采用明膠、纖維蛋白原、膠原、殼聚糖、海藻酸鈉、透明質(zhì)酸和纖粘 連蛋白中的至少一種。
4. 按照權(quán)利要求1所述的一種多層結(jié)構(gòu)的復(fù)雜組織器官前體的制備方法，其特征在于步驟l)中用于溶解所述合成高分子材料的有機溶劑采用四乙二醇、乙二醇、異丙醇或l，4-二氧六環(huán)；步驟2)中用于溶解所述天然高分子材料的MM采用水、生理鹽水、PBS溶液、 pH=6 8的0. 09M氯化鈉、3—羥甲基氨基甲烷鹽酸溶液或細胞培養(yǎng)液。
5. 按照權(quán)利要求1所述的一種多層結(jié)構(gòu)的復(fù)雜組織器官前體的制備方法，其特征在 于在細胞基質(zhì)溶液中還加入體積百分比為1% 30%的凍存保護劑甘油、二甲基亞砜、乙 二醇和葡聚糖中的一種或兩種材料的混合物。
6. 按照權(quán)利要求1或5所述的一種多層結(jié)構(gòu)的復(fù)雜組織器官前體的制備方法，其特征 在于在細胞基質(zhì)溶液中加入體積百分比為0. 001% 0. 1%細胞生長因子。
7.按照權(quán)利要求6所述的一種多層結(jié)構(gòu)的復(fù)雜組織器官前體的制備方法，其特征在于: 所述的細胞生長因子采用內(nèi)皮細胞生長因子、細胞轉(zhuǎn)移因子或肝細胞生長因子。
全文摘要
一種多層結(jié)構(gòu)的復(fù)雜組織器官前體的制備方法，該方法首先制備合成高分子溶液和細胞基質(zhì)溶液，將合成高分子溶液罐注到內(nèi)模具中形成內(nèi)支架；將至少兩個中間模具套在內(nèi)支架外部，將細胞基質(zhì)溶液罐注到內(nèi)支架和中間模具之間，形成細胞基質(zhì)中間層；經(jīng)物理或化學(xué)交聯(lián)形成內(nèi)支架與細胞基質(zhì)的雙層結(jié)構(gòu)，將雙層結(jié)構(gòu)裝入外模具中，將細胞基質(zhì)溶液灌入雙層結(jié)構(gòu)與外模具的縫隙中，形成外層合成高分子材料層，用細胞培養(yǎng)液萃取外層合成高分子材料層中的溶劑，去除模具即可。本發(fā)明可實現(xiàn)不同細胞基質(zhì)材料與合成高分子支架在空間的準確定位，克服了組織工程存在的在三維支架中誘導(dǎo)培養(yǎng)細胞需要時間長、細胞分布不均勻，細胞很難滲入到深層結(jié)構(gòu)中等缺點。
文檔編號A61L27/40GK101623515SQ200910089999
公開日2010年1月13日 申請日期2009年7月31日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月31日
發(fā)明者張人佶, 王小紅, 隋少春, 顏永年 申請人:清華大學(xué)