專利名稱：槐杞黃顆粒復方制劑在治療腎病中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種中藥復方，具體涉及槐杞黃顆粒復方制劑，特別涉及槐杞黃顆粒復方制劑在治療腎病中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：
腎病嚴重的危害人類的生命健康，每年有數(shù)千萬的病人死于腎臟疾病，其中原發(fā)性腎病綜合征是兒科常見的泌尿系統(tǒng)疾病，臨床主要表現(xiàn)為蛋白尿、低蛋白血癥、高脂血癥和不同程度的水腫，每年因原發(fā)性腎病綜合征而死亡的兒童呈上升趨勢，目前治療原發(fā)性腎病綜合征主要以腎上腺糖皮質(zhì)激素為基礎(chǔ)藥物，且治療周期長，長期使用該類藥物會引起機體免疫功能的低下，從而影響疾病的治療，且長期使用糖皮質(zhì)激素藥物會帶來很多不良反應(yīng)。臨床及動物實驗研究顯示，原發(fā)性腎病綜合征的發(fā)病機制與機體免疫功能紊亂相關(guān)，同時，腎小球腎炎也是危害人類生命健康的主要疾病，每年因腎小球腎炎疾病死亡的人數(shù)逐年升高，目前治療腎小球腎炎主要以化學藥為主，但長期使用化學藥會產(chǎn)生多種不良反應(yīng)，且有些藥物通過腎臟排泄對腎臟產(chǎn)生嚴重的毒副作用?；辫近S顆粒復方制劑由槐耳菌質(zhì)、枸杞子和黃精三味藥組成，具有補益精氣、滋補潤養(yǎng)心肺和強壯筋骨之功效，臨床上主要應(yīng)用于治療呼吸道感染疾病。


發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明目的本發(fā)明的目的是為了充分利用中藥資源，在原有槐杞黃顆粒復方制劑的基礎(chǔ)上，開發(fā)其新的臨床用途，提供槐杞黃顆粒復方制劑在治療腎臟疾病中的應(yīng)用。
技術(shù)方案為實現(xiàn)以上目的，本發(fā)明提供的槐杞黃顆粒復方制劑由下列重量百分比的原料藥制成槐耳菌質(zhì)36-50％、枸杞子20-35％、黃精15-30％。
作為優(yōu)選方案，本發(fā)明提供的槐杞黃顆粒復方制劑由下列重量百分比的原料藥制成槐耳菌質(zhì)40-50％、枸杞子25-35％、黃精20-30％。
作為另一優(yōu)選方案本發(fā)明提供的槐杞黃顆粒復方制劑由下列重量百分比的原料藥制成槐耳46％、枸杞子30％、黃精24％。
本發(fā)明提供的槐杞黃顆粒復方制劑做成制劑時將各原料藥提取后得到的提取物和藥學上可接受的載體制備成口服液、顆粒劑、膠囊劑、片劑、粉針劑或注射液劑型的藥物。
將本發(fā)明提供的槐杞黃顆粒復方制劑制成口服液時，將各原料的提取物加蒸餾水溶解，過濾，加入糖漿，調(diào)節(jié)pH，制成口服液。
將本發(fā)明提供的槐杞黃顆粒復方制劑制成片劑時，把各原料和乳糖或玉米淀粉，需要時加入潤滑劑硬脂酸鎂，混合均勻，然后壓片制成片劑。
本發(fā)明提供的槐杞黃顆粒復方制劑制成膠囊劑時把各原料的提取物和載體乳糖或玉米淀粉混合均勻，整粒，然后裝膠囊制成膠囊劑。
本發(fā)明提供的槐杞黃顆粒復方制劑制成顆粒劑時，把各原料的提取物和稀釋劑乳糖或玉米淀粉混合均勻，整粒，干燥，制成顆粒劑。
本發(fā)明提供的槐杞黃顆粒復方制劑制成注射液時，取各原料的提取物加入生理鹽水溶解然后加入活性碳，攪拌均勻，80℃加熱30分鐘，過濾，調(diào)節(jié)pH值，用垂熔玻璃漏斗或其它濾器過濾至澄明，灌裝，在100至115℃滅菌30分鐘制成注射液。
以上提供的槐杞黃顆粒復方制劑在治療腎臟疾病中的應(yīng)用，也可以用于治療原發(fā)性腎病綜合癥藥物中的應(yīng)用，并且槐杞黃顆粒復方制劑也可以在治療腎小球腎炎藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明提供的槐杞黃顆粒復方制劑，根據(jù)中醫(yī)藥理論，采用辨證論治的理論制定成本方，經(jīng)藥理學研究顯示，方中槐耳富含槐耳菌質(zhì)多糖，為活性很高的生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑，能激發(fā)機體免疫系統(tǒng)的諸多環(huán)節(jié)，從而提高機體的免疫力，枸杞具有滋補作用、歸腎經(jīng)、能改善腎臟的生理功能，黃精具有滋陰作用，研究顯示也具有補腎的作用。
有益效果本發(fā)明在原有復方槐杞黃顆粒復方制劑的基礎(chǔ)上進行新的用途開發(fā)，實驗表明該中藥復方制劑具有很好的治療腎病的作用，尤其對原發(fā)性腎病綜合癥具有很好的治療作用，并且該中藥復方制劑對腎小球腎炎也有很好的治療作用，且不良反應(yīng)小，有望開發(fā)成為新一代的治療腎病的藥物，同時本發(fā)明涉及的三味中藥原料均為常用中藥，原藥材易得。

具體實施例方式 根據(jù)下述實施例，可以更好地理解本發(fā)明。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解，實施例所描述的具體的物料配比及其實驗結(jié)果僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)當也不會限制權(quán)利要求書中所詳細描述的本發(fā)明。
實施例1槐杞黃顆粒復方制劑對原發(fā)性腎病綜合征的藥理作用。
1、實驗材料 雄性清潔級SD系大鼠30只，體重160～180g，購自上海斯萊克動物中心。阿霉素(美國楷萊)、地塞米松注射液由南京兒童醫(yī)院提供，槐杞黃顆粒復方制劑由江蘇啟東蓋天力藥業(yè)有限公司提供，ED-1單克隆抗體購自英國serotec公司，F(xiàn)ITC標記的羊抗小鼠IgG購自北京中山生物技術(shù)公司。TNF-α和IL-1βELISA試劑盒分別購自晶美生物工程有限公司和美國invitrogen公司。
2、阿霉素腎病模型的構(gòu)造及實驗分組 SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，隨機分為5組每組6只大鼠①阿霉素腎病組阿霉素5mg/kg，尾靜脈單次注射；②正常對照組注射相等容量生理鹽水；③槐杞黃顆粒復方制劑(批號01至03)治療組尾靜脈單次注射阿霉素5mg/kg，次日起予槐杞黃顆粒復方制劑2mg/kg灌胃，1次/d；④地塞米松治療組尾靜脈單次注射阿霉素5mg/kg，次日起予地塞米松0.2mg/kg腹腔注射，1次/d；⑤聯(lián)合治療組注射阿霉素后，次日起同時給予槐杞黃顆粒復方制劑及地塞米松治療，2mg/kg、灌胃，1次/d。造模期間所有大鼠均自由飲水和進食，造模后第十五天，大鼠腹腔注射20％烏拉坦，5mg/kg；麻醉成功后經(jīng)心臟取血分離血清，并留取雙側(cè)腎組織行病理組織學等檢查。
3、實驗觀察指標 3.1一般情況及給藥后24小時尿蛋白含量的測定 造模期間觀察各組小鼠的飲食飲水量、體重改變、毛發(fā)、精神活動等一般情況。同時予造模前及開始后第7、14天將大鼠置于代謝籠中，收集24小時尿液，采用考馬斯亮藍法檢測尿蛋白含量。
3.2腎臟病理組織學檢查 光鏡所有標本于4％多聚甲醛固定、石蠟包埋、切片(3μm)，分別行蘇木素-伊紅(HE)和希夫氏(PAS)染色，光鏡下觀察腎組織。
電鏡戊二醛固定后，常規(guī)制作標本，用透射電鏡觀察腎組織。
3.3免疫熒光檢測 腎組織冰凍切片(5μm)于丙酮固定10min，PBS漂洗。加入ED-1單克隆抗體(1∶100)，37℃孵育1h，PBS漂洗后加入FITC標記二抗(1∶30)，37℃孵育45min，再用PBS漂洗后甘油封片，熒光顯微鏡下觀察。PBS液代替一抗做空白對照。
3.4血清TNF-α、IL-1β的含量測定 取大鼠新鮮血液，于4℃靜置8h，在4℃下、3000r/min離心10min分離血清。按照ELISA試劑盒說明，采用雙抗體夾心法測定血清中細胞因子TNF-α和IL-1β的含量。
3.5實驗結(jié)果 3.5.1造模第二天開始，大鼠出現(xiàn)不同程度的腹瀉、飲食和飲水量減少、毛發(fā)蓬松，尤以模型組顯著。正常對照組未出現(xiàn)明顯不適。如表一所示，阿霉素模型組于造模結(jié)束后體重明顯減輕，槐杞黃顆粒復方制劑組則部分緩解阿霉素造成的體重減輕，并顯著改善大鼠的一般情況。
表一各組別大鼠給藥后體重變化情況 3.5.2各組大鼠于造模前尿蛋白均低于15mg/24h，各組間無顯著差異。造模后第7天，阿霉鼠尿蛋白則于7天后開始下降，第14天與阿霉素腎病模型組相比具有顯著差異(P＜0.05)，具體實驗結(jié)果如表二所示。
表二各組別大鼠給藥后尿蛋白含量測定結(jié)果 3.5.3光鏡結(jié)果顯示阿霉素模型組的大鼠部分腎小球體積增大，系膜細胞及基質(zhì)局灶節(jié)段性輕度增多；槐杞黃顆粒復方制劑治療組、聯(lián)合治療組的腎小球較正常對照組無明顯改變。
電鏡結(jié)果示阿霉素模型組大鼠腎小球基底膜偶見增厚，腎小球臟層上皮細胞(即足細胞)足突廣泛融合、部分足突消失；槐杞黃顆粒復方制劑治療組、地塞米松治療組和聯(lián)合治療組的基底膜平滑，足細胞損傷則較模型組明顯緩解。
3.5.4槐杞黃顆粒復方制劑對腎小管間質(zhì)損傷的影響 阿霉素模型組的大鼠的腎小管上皮細胞出現(xiàn)灶性顆粒樣、空泡樣變性，部分管腔可見蛋白管型；間質(zhì)呈灶性炎性細胞浸潤并伴少量纖維組織增生。槐杞黃顆粒復方制劑治療組、地塞米松治療組和聯(lián)合治療組的腎間質(zhì)炎性細胞浸潤面積及范圍則均較阿霉素模型組明顯減少。
3.5.5免疫熒光結(jié)果顯示，阿霉素模型組可顯著誘導腎間質(zhì)單核、巨噬細胞活化、浸潤；槐杞黃顆粒復方制劑治療組能夠顯著的抑制阿霉素所誘導的腎間質(zhì)單核、巨噬細胞活化和浸潤。
3.5.6對血清細胞因子TNF-α和IL-1β的影響 實驗結(jié)果顯示阿霉素模型組能顯著上調(diào)大鼠血清中細胞因子TNF-α和IL-1β表達，和正常組比較具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。給予槐杞黃顆粒復方制劑、地塞米松或聯(lián)合治療后，大鼠血清中TNF-α、IL-1β的上調(diào)明顯受到抑制和正常組比較無有統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。
以上實驗結(jié)果均顯示本發(fā)明提供的槐杞黃顆粒復方制劑能顯著改善阿霉素誘導的原發(fā)性腎病綜合征，能顯著降低阿霉素腎病尿蛋白的排泄，保護腎小球足細胞，緩解腎小管間質(zhì)損傷，調(diào)節(jié)機體免疫紊亂，實驗結(jié)果顯示槐杞黃顆粒復方制劑對腎臟具有很好的保護作用，能增強機體的免疫功能，其藥理活性和地塞米松相近，且不良反應(yīng)較地塞米松低，有望開發(fā)成為新一代治療腎病的藥物，并且通過藥理實驗得出槐杞黃顆粒復方制劑和地塞米松聯(lián)合治療的效果也很好，不良反應(yīng)也降低，因此本發(fā)明提供的槐杞黃顆粒復方制劑和地塞米松的混合制劑也可以開發(fā)成為新一代治療原發(fā)性腎病綜合征的藥物。
實施例2槐杞黃顆粒復方制劑對腎小球腎炎的藥理作用。
1、實驗材料 健康雄性SD大鼠24只，4周齡，體重160g左右，購自江蘇省實驗動物中心；槐杞黃顆粒復方制劑由江蘇啟東蓋天力藥業(yè)有限公司提供；完全弗氏佐劑、FITC標記的羊抗兔IgG及Schiff試劑購自美國Sigma公司，轉(zhuǎn)化生長因子(TGF-β1)多克隆抗體購自美國Sant Cruz公司，增殖細胞核抗原(PCNA)單克隆抗體和單核細胞趨化因子-1(MCP-1)單克隆抗體購自武漢博士德生物工程有限公司，辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG、正常山羊血清封閉液、DAB顯色劑購自北京中山生物技術(shù)公司。
2、實驗方法和實驗分組 2.1抗大鼠胸腺細胞抗血清(ATS)的制備取4周齡SD大鼠，剝?nèi)∑湫叵俨⒅苽涑梢欢舛鹊膯涡叵偌毎麘乙?，與完全弗氏佐劑等體積混勻后，按5×107細胞皮下多點注射給免疫新西蘭大白兔，其后每隔2周按1×107胸腺細胞經(jīng)耳緣靜脈注射加強免疫3次。7周后頸動脈取血并分離血清，大鼠胸腺細胞涂片及大鼠腎組織冰凍切片測定ATS效價，間接免疫熒光法測抗體效價達1∶1280。
2.2大鼠抗Thy1.1系膜增生性腎小球腎炎模型的制備及實驗分組大鼠抗Thy-1.1的抗體腎炎(anti-thy-1.1 antibody induced glomerulonephritis)模型是一種經(jīng)典的系膜增生性腎小球腎炎模型。取SD大鼠24只，隨機分為4組，每組6只，對照組經(jīng)尾靜脈一次性注射10ml/kg的正常兔血清，模型組、槐杞黃顆粒復方制劑治療組經(jīng)尾靜脈一次性注射10ml/kg的ATS。從注射ATS當天起，槐杞黃顆粒復方制劑治療組每天灌服中藥復方制劑2mg/kg，1次/d；對照組和模型組分別灌服等量的生理鹽水。從ATS注射當天(第0天)起，用代謝籠隔日(分別為第1、3、5、7天)收集大鼠24h尿液，檢測24h尿蛋白總量，第8天集中處死所有大鼠，留取腎臟。
3、檢測指標 3.1大鼠24小時尿蛋白含量測定應(yīng)用Bradford法測定24h尿蛋白總量(mg/24h)。
3.2、腎臟病理形態(tài)學觀察所有標本于4％多聚甲醛固定、石蠟包埋、切片(3μm)，分別用蘇木素-伊紅(HE)和希夫氏(PAS)染色，光鏡下觀察腎組織，每張切片高倍鏡下隨機選取10個腎小球，對腎小球內(nèi)有核細胞進行計數(shù)，并采用捷達病理圖像分析系統(tǒng)軟件測定腎小球系膜區(qū)面積及腎小球面積。
3.3、腎組織PCNA、TGF-β1、MCP-1的表達腎組織中PCNA表達采用免疫組化方法檢測；腎組織中TGF-β1、MCP-1的表達采用Western Blot檢測。
4、統(tǒng)計學方法結(jié)果以均數(shù)±標準差表示，采用SPSS 11.5統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析。組間比較采用單因素方差分析，多個均數(shù)之間的比較采用q檢驗，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。
5、實驗結(jié)果 5.1槐杞黃顆粒復方制劑對大鼠MsPGN模型24h尿蛋白總量的影響模型組ATS注射后24h，尿蛋白隨即升高，至第3天含量達到最高值，尿蛋白總量達48.26mg/24h；治療組在灌服中藥復方制劑2天后對大鼠MsPGN模型有明顯降低大鼠尿蛋白排泄的作用(P＜0.05)具體實驗結(jié)果如表三所示。
表三各組大鼠24h尿蛋白總量變化(n＝6，mg/24h)
與對照組比較，*P＜0.01；與模型組相比較，◆P＜0.01。
5.2腎臟病理形態(tài)學觀察PAS染色光鏡下，正常對照組腎小球無明顯改變；模型組腎小球內(nèi)細胞數(shù)明顯增多，腎小球系膜細胞和系膜基質(zhì)彌漫性重度增生，系膜區(qū)明顯擴大，腎小球毛細血管腔廣泛受壓變窄、閉塞，部分小球可見球囊粘連、細胞性新月體形成及腎小球硬化，腎小管上皮細胞灶性顆粒樣、空泡樣變性，部分小管管腔內(nèi)見蛋白管型，間質(zhì)可見彌漫性炎性細胞浸潤；槐杞黃顆粒復方制劑治療組的大部分腎小球已基本接近正常，少數(shù)小球可見系膜細胞及系膜基質(zhì)節(jié)段性輕度增生，毛細血管管腔開放良好，偶見球囊粘連，未見新月體形成及腎小球硬化，偶見腎小管上皮細胞灶性顆粒樣變性，間質(zhì)內(nèi)無明顯炎性細胞浸潤。
圖像分析顯示模型組腎小球內(nèi)有核細胞總數(shù)、系膜區(qū)面積及腎小球面積均明顯高于對照組(P＜0.01)，治療組腎小球內(nèi)有核細胞總數(shù)、系膜區(qū)面積及腎小球面積均明顯低于模型組(P＜0.01)具體實驗結(jié)果如表四所示。
表四各組大鼠腎小球病理形態(tài)學指標變化(n＝6)
與對這種比較，*P＜0.01；與模型組比較，◆P＜0.01。
5.3腎組織中PCNA的表達變化免疫組化結(jié)果顯示，正常大鼠腎小球內(nèi)有少量固有細胞PCNA核陽性，與對照組相比，模型組腎小球內(nèi)PCNA核陽性細胞數(shù)目明顯增多，且PCNA主要表達于增生的系膜細胞核內(nèi)(P＜0.01)；槐杞黃顆粒復方制劑治療組腎小球內(nèi)PCNA核陽性細胞數(shù)較模型組有顯著下降(P＜0.01)具體實驗結(jié)果如表五所示。
表五各組大鼠腎小球內(nèi)PCNA核陽性細胞數(shù)比較
與對照組比較，*P＜0.01；與模型組比較，◆P＜0.01。
5.4腎組織中TGF-β1和MCP-1表達Western Blot檢測結(jié)果顯示，正常大鼠腎組織表達少量的TGF-β1和MCP-1。模型組大鼠腎組織中TGF-β1和MCP-1表達顯著增加，分別是對照組的2.14倍和3.62倍?；辫近S顆粒復方制劑治療后，大鼠腎組織中TGF-β1和MCP-1表達均顯著降低，其抑制率分別達到76％和84％。
通過以上研究結(jié)果顯示，本發(fā)明提供的槐杞黃顆粒復方制劑能阻止大鼠MsPGN疾病模型的進一步發(fā)展，給予大鼠槐杞黃顆粒復方制劑灌服2天后，大鼠24小時尿蛋白總量較模型組即有顯著下降，灌服7天后，槐杞黃顆粒復方制劑治療組的腎小球內(nèi)系膜細胞增殖及系膜基質(zhì)增生較模型組均有顯著減輕，間質(zhì)中炎性細胞浸潤程度較模型組明顯下降，證實槐杞黃顆粒復方制劑對MsPGN模型具有確切的保護作用，進一步的研究顯示，MsPGN模型組在第8天腎皮質(zhì)中TGF-β1和MCP-1表達明顯增強，槐杞黃顆粒復方制劑治療后，腎組織內(nèi)TGF-β1和MCP-1的含量均明顯減少，進一步證明本發(fā)明提供的槐杞黃顆粒復方制劑具有很好的防治腎小球腎炎的作用。
通過以上實驗表明槐杞黃顆粒復方制劑對腎臟具有明顯的保護作用，尤其對原發(fā)性腎病綜合征和腎小球腎炎具有很好的防治作用，因此，槐杞黃顆粒復方制劑有望用于治療腎臟疾病。
權(quán)利要求
1、槐杞黃顆粒復方制劑在治療腎病中的應(yīng)用。
2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的槐杞黃顆粒復方制劑在治療腎病中的應(yīng)用，其特征在于，槐杞黃顆粒復方制劑在治療原發(fā)性腎病綜合癥中的應(yīng)用。
3、根據(jù)權(quán)利要求1所述的槐杞黃顆粒復方制劑在治療腎病中的應(yīng)用，其特征在于，槐杞黃顆粒復方制劑在治療腎小球腎炎中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了槐杞黃顆粒復方制劑在治療腎病中的應(yīng)用，經(jīng)藥理實驗研究表明，槐杞黃顆粒復方制劑具有很好的保護腎臟的作用，對阿霉素誘導的原發(fā)性腎病綜合癥具有和糖皮質(zhì)激素相近的治療作用，并且該中藥復方制劑對腎小球腎炎也有很好的治療作用，且本發(fā)明提供的中藥復方制劑的原材料易得，藥理活性強，不良反應(yīng)低，有望成為新一代的治療腎病的藥物。
文檔編號A61K36/8969GK101623438SQ200910181580
公開日2010年1月13日 申請日期2009年7月28日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月28日
發(fā)明者黃松明, 張愛華, 朱春華, 陸正鑫 申請人:啟東蓋天力藥業(yè)有限公司