專利名稱：類人膠原蛋白及注射型類人膠原蛋白軟組織填充材料的制作方法
類人膠原蛋白及注射型類人膠原蛋白軟組織填充材料技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于蛋白質(zhì)工程、生物醫(yī)用材料領(lǐng)域，具體涉及類人膠原蛋白、注射型類人膠原蛋白軟組織填充材料及其制備方法。
背景技術(shù)：
整形美容行業(yè)正隨著人們生活水平的不斷提高而快速發(fā)展，隆胸、隆鼻、除皺、臉部整形等都受人追捧。目前面部整形的需求包括祛除皺紋，改善面部輪廓，填平凹陷瘢痕或唇部，修復(fù)受傷的組織等。因此，軟組織填充材料市場(chǎng)需求量大。
在19世紀(jì)90年代至今，人們先后研究了白蠟、脂肪移植、硅樹脂、凝膠植入體等材料用于軟組織整形，臨床應(yīng)用發(fā)現(xiàn)都存在著硬化，瘤狀腫塊、吸收過快、慢性炎癥等問題。 近些年來，美國(guó)FDA相繼批準(zhǔn)了幾個(gè)用于軟組織填充的產(chǎn)品，其主要成分為牛膠原、透明質(zhì)酸鈉、PMMA小球等，已經(jīng)有了較好的效果，對(duì)于部分使用者仍然存在著使用部位紅腫、過敏及降解過快等情況。
膠原蛋白，又稱為膠原，是脊椎動(dòng)物體內(nèi)含量最豐富、分布最廣泛的一組硬蛋白， 是脊椎動(dòng)物身體結(jié)構(gòu)的重要材料，也是在哺乳動(dòng)物中含量最豐富的蛋白。膠原由多糖蛋白分子組成，是結(jié)締組織的主要蛋白成分，占機(jī)體總蛋白的20 30%。機(jī)體中大約一半的膠原蛋白存在于皮膚中，膠原蛋白占真皮和筋腱干重的70%，相當(dāng)于體重的6%。類人膠原蛋白是將人體已知序列膠原蛋白的一段mRNA逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA后，經(jīng)過特定序列重復(fù)和修飾， 轉(zhuǎn)化于大腸桿菌中，并經(jīng)過高密度發(fā)酵、分離提取及純化而得，由西安巨子生物基因技術(shù)股份有限公司發(fā)明并獨(dú)家生產(chǎn)(中國(guó)發(fā)明專利號(hào)ZL. 01106757. 8)。它從根本上解決了動(dòng)物提取膠原蛋白的水不溶性和病毒隱患(瘋牛病、豬瘟疫、禽流感)。
透明質(zhì)酸鈉是廣泛存在于動(dòng)物和人體的生理活性物質(zhì)，在人皮膚、關(guān)節(jié)滑膜液、臍帶、房水及眼玻璃體中均有分布。其溶液具有高黏彈性及仿形性，是目前公認(rèn)的生物相容性極好的生物醫(yī)用材料，為眼科手術(shù)的輔助劑，并有保護(hù)角膜內(nèi)皮細(xì)胞及眼內(nèi)組織，減少手術(shù)并發(fā)癥，促進(jìn)傷口愈合的作用。
羥基磷灰石，又稱羥磷灰石，是鈣磷灰石(Qi5(PCM)3(OH))的自然礦物化。但是經(jīng)常被寫成(Qiici(PO4)6(OH)2)的形式以突出它是由兩部分組成的羥基與磷灰石。羥基磷灰石具有良好的理化性質(zhì)和生物學(xué)性質(zhì)，使它廣泛地應(yīng)用于許多領(lǐng)域。羥基磷灰石作為無機(jī)材料的涂層和復(fù)合材料的無機(jī)基體的使用材料，賦予了材料良好的生物學(xué)性質(zhì)和一定的機(jī)械力學(xué)性質(zhì)而廣泛應(yīng)用于生物材料，現(xiàn)在廣泛應(yīng)用于人工骨等產(chǎn)品的開發(fā)。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種注射型類人膠原蛋白軟組織填充材料及其制備方法，該材料制備工藝簡(jiǎn)單，所制備的類人膠原蛋白軟組織填充材料穩(wěn)定新好、生物相容性優(yōu)異，無病毒隱患，軟組織填充及修復(fù)效果好。
本發(fā)明人經(jīng)過深入研究發(fā)現(xiàn)類人膠原蛋白、透明質(zhì)酸鈉和羥基磷灰石均具有良好的生物相容性，三者以適當(dāng)?shù)呐浔冗M(jìn)行復(fù)合，制備得到的類人膠原蛋白軟組織填充材料具有無病毒隱患、生物相容性好，可刺激手術(shù)部位細(xì)胞適量增殖等特點(diǎn)，具有良好的軟組織填充效果，從而完成了本發(fā)明。
SP，本發(fā)明如下
1. 一種重組膠原蛋白，其由SEQ ID NO 1所示的氨基酸序列組成。
2.編碼項(xiàng)1所述的重組膠原蛋白的核酸。
3.導(dǎo)入了項(xiàng)2所述的核酸的載體。
4.用項(xiàng)3的載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞而得到的轉(zhuǎn)化體。
5. 一種注射型類人膠原蛋白軟組織填充材料的制備方法，其特征在于包括以下步驟
1)將類人膠原蛋白用注射用水溶解成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1. 0% 5. 0%的溶液；
2)將醫(yī)用透明質(zhì)酸鈉用注射用水溶解成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0. 5% 2. 0%的溶液；
1)將上述兩種溶液按一定比例混合后再加入一定量的醫(yī)用級(jí)羥基磷灰石，混合攪拌，在攪拌的過程中添加適量的醫(yī)用級(jí)甘油，混合均勻后真空脫泡，得到成品。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的注射型類人膠原蛋白軟組織填充材料的制備方法，其特征在于所述類人膠原蛋白是權(quán)利要求1所述的重組膠原蛋白。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的注射型類人膠原蛋白軟組織填充材料的制備方法，其特征在于所述醫(yī)用透明質(zhì)酸鈉的分子量為100萬 250萬。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的注射型類人膠原蛋白軟組織填充材料的制備方法，其特征在于所述醫(yī)用級(jí)羥基磷灰石為球形，其直徑是20 80 μ m。
9.根據(jù)權(quán)利要求5所述的注射型類人膠原蛋白軟組織填充材料的制備方法，其特征在于所述類人膠原蛋白溶液與透明質(zhì)酸鈉溶液的體積比為1 1 10。
10.根據(jù)權(quán)利要求5所述的注射型類人膠原蛋白軟組織填充材料的制備方法，其特征在于所述醫(yī)用羥基磷灰石的質(zhì)量占成品總質(zhì)量的3% 20%。
11.根據(jù)權(quán)利要求5所述的注射型類人膠原蛋白軟組織填充材料的制備方法，其特征在于所用的醫(yī)用甘油質(zhì)量占成品總質(zhì)量的0. 5% 2%。
12.根據(jù)權(quán)利要求5 11中任一項(xiàng)所述一種注射型類人膠原蛋白軟組織填充材料的制備方法，其還包括下述步驟
4)將所述成品在無菌條件下灌裝于一次性玻璃注射器中并完成外包裝。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的注射型類人膠原蛋白軟組織填充材料的制備方法，其特征在于步驟4)中，所用的注射器可以根據(jù)臨床需求做出任意規(guī)格。
14.通過權(quán)利要求5 13中任一項(xiàng)所述的注射型類人膠原蛋白軟組織填充材料的制備方法得到的注射型類人膠原蛋白軟組織填充材料。
本發(fā)明提供的軟組織填充材料具有適宜粘度，具有優(yōu)良的生物相容性和可控的降解速率，對(duì)于各種軟組織缺損和老化有一定的修復(fù)效果。與目前臨床廣泛應(yīng)用的軟組織填充材料相比，類人膠原蛋白軟組織填充材料具有顯著的優(yōu)點(diǎn)它的免疫排異反應(yīng)更弱，而且徹底杜絕了動(dòng)物膠原蛋白所不可避免的病毒隱患，而且可在一定程度上刺激注射部位軟組織適量增生，具有較為顯著的填充和修復(fù)效果。


圖1注射型類人膠原蛋白軟組織填充材料注射小鼠皮下2周時(shí)的照片。
圖2注射型類人膠原蛋白軟組織填充材料注射小鼠皮下4周時(shí)的照片。
圖3注射型類人膠原蛋白軟組織填充材料注射小鼠皮下8周時(shí)的照片。
圖4注射型類人膠原蛋白軟組織填充材料注射小鼠皮下12周時(shí)的照片。
發(fā)明的具體實(shí)施方式
本說明書中提及的科技術(shù)語具有與本領(lǐng)域技術(shù)人員通常理解的含義相同的含義， 如有沖突以本說明書中的定義為準(zhǔn)。
_··· 、_、·_·Α
本發(fā)明的一個(gè)方面涉及一種重組膠原蛋白(簡(jiǎn)稱本發(fā)明的重組膠原蛋白)，其由 SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列組成。
SEQID NO:1
HDPVVLQRRDffENPGVTQLNRHLAHAHPPFASD
HPMGAPGPAGAPGPPGAPGPAGPPGSAGAPGPP
GAPGPAGPPGSAGAPGPPGAPGPAGPPGSAGAP
GPPGAPGPAGPPGSAGAPGPPGAPGPAGPPGSA
GAPGPPGAPGPAGPPGSAGAPGPPGAPGPAGPP
GSAGAPGPPGAPGPAGPPGSAGAPGPPGAPGPA
GSAGAPGPPGAPGPAGPPGSAGAPGPPGAPGPA
GSAGAPGPPGAPGPAGPPGSAGAPGPPGAPGPA
GPPGSAGAPGPPGAPGPAGPPGSAGAPGPPGAH
GPAGALGAHGPAGPLGPAGPPGSAGAPGAHGPA
GPLGAHGPAGPLGAHGPAGPLGAHGPAGPLGAP
GPAGPPGSAGAPGPPGAPGPAGPPGSAGAPGPP
GAPGPAGPPGSAGAPGPPGAPGPAGPPGSAGAP
GPPGAPGPAGPPGSAGAPGPPGAPGPAGPPGSA
GAPGPPGAPGPAGPPGSAGAPGPPGAPGPAGPP
GSAGAPGPPGAPGPAGPPGSAGAPGPPGAPGPA
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GPPGAPGPAGPPGSAGAPGPPGAPGPAGPPGSA
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GSAGAPGPPGAPGPAGPPGSAGAPGPPGAPGPA
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GPAGPPGSAGAPGPPGAPGPAGPPGSAGAPGPP
GAPGPAGPPGSAGAPGPPGAPGPAGPPGSAGAP
GPPGAHGPAGPLGAHGPAGPLGAHGPAGPLGAH
GPAGPLGAPGPAGPPGSAGAPGPPGAPGPAGPP
GAPGPPGAPGPAGPPGSAGAPGPPGAPGPAGPP
GSA GAP GPP GAP GPA GPP GSA GAP GPP GSA GAP
GPP GAP GPA GPP GSA GAP GPP GAP GPA GPP GSA
GAP GPP GAP GPA GPP GSA GAP GPP GAP GPA GPP
GSA GAP GPP GAP GPA GPP GSA GAP GPP GAH GPA
GPL GAH GPA GPL GAH GPA GPL GAM GAP GAT GLS
AGA THG LVT CGL
本發(fā)明的重組膠原蛋白是中國(guó)專利申請(qǐng)公開CN1371919A的權(quán)利要求1所述的類人膠原蛋白，其具有三鏈、三螺旋結(jié)構(gòu)，其可以采用例如該中國(guó)專利申請(qǐng)公開CN1371919A 中公開的基因工程表達(dá)方法來制備。本發(fā)明的重組膠原蛋白是由中國(guó)西北大學(xué)的范代娣教授發(fā)明的，因此又稱作范氏重組膠原蛋白或范氏類人膠原蛋白(Fan's Human-like Collagen，F(xiàn)HLC)。
此外，本發(fā)明還涉及編碼上述本發(fā)明的重組膠原蛋白的核酸。
此外，本發(fā)明還涉及導(dǎo)入了上述核酸的載體。
此外，本發(fā)明還涉及用上述載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞而得到的轉(zhuǎn)化體。
上述核酸、載體、轉(zhuǎn)化體可以基于本發(fā)明的重組膠原蛋白的氨基酸序列來制造，其制造方法是本技術(shù)領(lǐng)域公知的，例如可以參見分子克隆實(shí)驗(yàn)指南第三版[美]J.莎姆布魯克著黃培堂等譯科學(xué)出版社2002年9月。
以下，通過實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行更具體的說明，但本發(fā)明不受這些實(shí)施例的限制。
制備例1重組膠原蛋白的制備
按中國(guó)專利申請(qǐng)公開CN1371919A所述方法制備了類人膠原蛋白(由SEQ ID NO 1所示的氨基酸序列組成)，確認(rèn)其分子量為約90kD。這里，將該重組膠原蛋白簡(jiǎn)稱為類人膠原蛋白，并用于下面的實(shí)施例。
實(shí)施例1
將類人膠原蛋白用注射用水溶解成1. 0%的溶液，將分子量為250萬的透明質(zhì)酸鈉用注射用水溶解為1.0%的溶液，將二者按照體積比為1 1進(jìn)行混合，然后分別加入適量的醫(yī)用級(jí)羥基磷灰石(直徑40μπι)和少量的醫(yī)用甘油并攪拌均勻并真空脫泡即為成品， 使得最終醫(yī)用級(jí)羥基磷灰石在成品中所占的質(zhì)量比為10%，醫(yī)用甘油在成品中所占的質(zhì)量比為0. 5%。
實(shí)施例2:
將類人膠原蛋白用注射用水溶解成2. 0%的溶液，將分子量為200萬的透明質(zhì)酸鈉用注射用水溶解為1.5%的溶液，將二者按照體積比為1 3進(jìn)行混合，然后分別加入適量的醫(yī)用級(jí)羥基磷灰石(直徑60μπι)和少量的醫(yī)用甘油并攪拌均勻并真空脫泡即為成品， 使得最終醫(yī)用級(jí)羥基磷灰石在成品中所占的質(zhì)量比為12%，醫(yī)用甘油在成品中所占的質(zhì)量比為1. 0%。
實(shí)施例3
將類人膠原蛋白用注射用水溶解成3. 0%的溶液，將分子量為150萬的透明質(zhì)酸鈉用注射用水溶解為2.0%的溶液，將二者按照體積比為1 5進(jìn)行混合，然后分別加入適量的醫(yī)用級(jí)羥基磷灰石(直徑50μπι)和少量的醫(yī)用甘油并攪拌均勻并真空脫泡即為成品， 使得最終醫(yī)用級(jí)羥基磷灰石在成品中所占的質(zhì)量比為8%，醫(yī)用甘油在成品中所占的質(zhì)量比為1. 5%。
實(shí)施例4
將類人膠原蛋白用注射用水溶解成2. 5%的溶液，將分子量為100萬的透明質(zhì)酸鈉用注射用水溶解為2.0%的溶液，將二者按照體積比為1 8進(jìn)行混合，然后分別加入適量的醫(yī)用級(jí)羥基磷灰石(直徑20μπι)和少量的醫(yī)用甘油并攪拌均勻并真空脫泡即為成品， 使得最終醫(yī)用級(jí)羥基磷灰石在成品中所占的質(zhì)量比為15%，醫(yī)用甘油在成品中所占的質(zhì)量比為0. 5%。
實(shí)施例5
將類人膠原蛋白用注射用水溶解成4. 0%的溶液，將分子量為250萬的透明質(zhì)酸鈉用注射用水溶解為1.5%的溶液，將二者按照體積比為1 4進(jìn)行混合，然后分別加入適量的醫(yī)用級(jí)羥基磷灰石(直徑30μπι)和少量的醫(yī)用甘油并攪拌均勻并真空脫泡即為成品， 使得最終醫(yī)用級(jí)羥基磷灰石在成品中所占的質(zhì)量比為10%，醫(yī)用甘油在成品中所占的質(zhì)量比為0. 5%。
實(shí)施例6
將類人膠原蛋白用注射用水溶解成5. 0%的溶液，將分子量為150萬的透明質(zhì)酸鈉用注射用水溶解為2.0%的溶液，將二者按照體積比為1 10進(jìn)行混合，然后分別加入適量的醫(yī)用級(jí)羥基磷灰石(直徑80 μ m)和少量的醫(yī)用甘油并攪拌均勻并真空脫泡即為成品，使得最終醫(yī)用級(jí)羥基磷灰石在成品中所占的質(zhì)量比為6%，醫(yī)用甘油在成品中所占的質(zhì)量比為1.0%。
實(shí)施例7:
20只健康成年昆明小鼠用脫毛劑背部脫毛備皮，第二天先用水清潔皮膚后用碘酒對(duì)小鼠備皮皮膚消毒，用75%酒精脫碘。一次性注射器吸取實(shí)施例1中制備的注射型類人膠原蛋白軟組織填充材料。小鼠皮下每只注射0. 2mL·
將注射過的小鼠放在相同的環(huán)境下飼養(yǎng)，分別于2周，4周，8周，12周后處死，每次處死5只。處死采用斷頸法，然后取其背部注射處表皮，拍照，將注入部位皮膚手術(shù)刀切下中性甲醛中固定。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1、2、3、4所示，注射型類人膠原蛋白軟組織填充材料注射小鼠皮下 2周、4周、8周、12周以后，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，材料在皮下有輕微的降解，無明顯的炎癥反應(yīng)， 到12周時(shí)仍能在皮下實(shí)現(xiàn)填充目的，且周圍組織適量增生，是一種具有廣闊應(yīng)用前景的新型軟組織填充材料。由此可知，注射型類人膠原蛋白軟組織填充材料生物相容性好，在體內(nèi)降解較為緩慢，可以有效解決傳統(tǒng)軟組織填充材料生物相容性差，不能降解或降解過快的問題。
還需要說明的是，在可實(shí)施且不明顯違背本發(fā)明的主旨的前提下，在本說明書中作為某一技術(shù)方案的構(gòu)成部分所描述的任一技術(shù)特征或技術(shù)特征的組合同樣也可以適用于其它技術(shù)方案；并且，在可實(shí)施且不明顯違背本發(fā)明的主旨的前提下，作為不同技術(shù)方案的構(gòu)成部分所描述的技術(shù)特征之間也可以以任意方式進(jìn)行組合，來構(gòu)成其它技術(shù)方案。本發(fā)明也包含在上述情況下通過組合而得到的技術(shù)方案，并且這些技術(shù)方案相當(dāng)于記載在本說明書中。
以上通過具體實(shí)施方式
和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了說明，但本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，這些并非意圖對(duì)本發(fā)明的范圍進(jìn)行限定，本發(fā)明的范圍應(yīng)由權(quán)利要求書確定。
工業(yè)實(shí)用性
本發(fā)明提供了一種注射型類人膠原蛋白軟組織填充材料及其制備方法，該材料制備工藝簡(jiǎn)單，所制備的類人膠原蛋白軟組織填充材料穩(wěn)定新好、生物相容性優(yōu)異，無病毒隱患，軟組織填充及修復(fù)效果好。
權(quán)利要求
1.一種重組膠原蛋白，其由SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列組成。
2.編碼權(quán)利要求1所述的重組膠原蛋白的核酸。
3.導(dǎo)入了權(quán)利要求2所述的核酸的載體。
4.用權(quán)利要求3的載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞而得到的轉(zhuǎn)化體。
全文摘要
本發(fā)明涉及類人膠原蛋白及注射型類人膠原蛋白軟組織填充材料。與目前臨床廣泛應(yīng)用的同類軟組織填充材料相比，所制備的注射型類人膠原蛋白軟組織填充材料生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單、生物相容性好，徹底杜絕了動(dòng)物膠原蛋白所不可避免的病毒隱患，安全性高。且可以通過在一定范圍內(nèi)調(diào)整羥基磷灰石的尺寸和溶液的配比來控制降解時(shí)間。
文檔編號(hào)A61L27/46GK102492032SQ20111036312
公開日2012年6月13日 申請(qǐng)日期2011年11月16日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月16日
發(fā)明者嚴(yán)建亞, 范代娣, 馬曉軒 申請(qǐng)人:陜西巨子生物技術(shù)有限公司