專利名稱：SCF-Fc融合蛋白的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種融合蛋白，具體地說，涉及一種SCF-Fc融合蛋白，屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
自1990年美國3個研究組幾乎同時報道干細胞因子(SCF)以來，世界各地進行了廣泛深入的研究。干細胞因子又稱肥大細胞生長因子(MGF)，c-Kit配體(c-Kit-L)及Steel因子(SLF)。它是由骨髓微環(huán)境中的基質(zhì)細胞產(chǎn)生的一種酸性糖蛋白。其糖基連在肽鍵的N和O基團上，由非共價結(jié)合的兩個相同亞基組成。SCF和其他細胞因子一起誘導(dǎo)干和祖細胞增生、延長其存活期及引起干和祖細胞 動員。雖然SCF的受體在祖細胞無顯著不同，但SCF誘導(dǎo)紅系祖細胞增生比粒-單祖細胞強，可能是其他特異性因素影響祖細胞對SCF的反應(yīng)性。給小鼠應(yīng)用SCF和粒細胞集落刺激因子(G-CSF)，外周血干細胞和祖細胞第I天即達高峰，6周后正常。骨髓中干和祖細胞第I天下降，第14天升高達10倍，6周后正常。表明最初外周血干和祖細胞升高是由骨髓中動員到外周血。Mauch等報道SCF和IL-Il合用增加長期骨髓增殖細胞(LTMRC)從骨髓動員到未切脾鼠的脾和切脾鼠的血液。Yonemura等認為SCF單獨在體外不能維持干細胞量，體內(nèi)作用是SCF和其他細胞因子相互作用的結(jié)果。在體外SCF和IL-7協(xié)同促進體B細胞增生。Takeda等認為體內(nèi)B細胞發(fā)育不是受體c_kit和SCF相互作用，而另一受體型酪氨酸激酶(FLK2)對B細胞發(fā)育比c-kit更重要。SCF在肥大細胞發(fā)育和存活中起關(guān)鍵作用。小鼠SCF的基因缺失導(dǎo)致結(jié)締組織和粘膜表面肥大細胞缺乏。由于SCF引起肥大細胞脫粒，應(yīng)用時一般以減少劑量為代價。Nocka等發(fā)現(xiàn)與二硫化物相聯(lián)系的二聚體SCF比普通SCF刺激細胞增生強10 20倍，但對肥大細胞脫粒并不比普通SCF強。SCF既有化學(xué)激動性，也有化學(xué)趨化性。膜結(jié)合型SCF促進造血祖細胞回到骨髓。靜脈輸注c-kit+造血祖細胞后其沿著SCF的梯度移動到骨髓，是由ckit粘附到骨髓基質(zhì)細胞表面的SCF引起的。Kim等認為基質(zhì)細胞源因子-I (SDF-I)只有化學(xué)趨化性，它作為生理抗移動因子抑制造血祖細胞移出骨髓。應(yīng)用SCF、促血小板生長因子(TPO)、IL-12、IL-3處理冷凍骨髓細胞移植給鼠，其恢復(fù)血小板和中性粒細胞比用未處理的骨髓移植早3 6 d。在鼠模型中，受者在應(yīng)用5-FU前和后給予SCF注射，可以使干細胞從靜止期進入細胞周期。這樣干細胞對5-FU敏感，易于殺死，為供者骨髓移入受者提供了穩(wěn)定的內(nèi)環(huán)境，有利于骨髓移植的成功。綜上所述，SCF有著廣泛的應(yīng)用前景，然而SCF應(yīng)用于臨床至今并沒有取得實質(zhì)性的、突破性的進展，而且很多體外實驗的明顯結(jié)果往往在體內(nèi)難以得到重復(fù)與驗證。究其原因，天然或重組SCF自身短暫的血漿循環(huán)半衰期是關(guān)鍵性障礙。大多數(shù)細胞因子因免疫刺激而分泌并發(fā)揮其調(diào)節(jié)作用。但它們的血漿半衰期都很短暫，從生理角度這是一種機體避免過度的免疫反應(yīng)的保護機制。其中以SCF為例,其體內(nèi)循環(huán)半衰期僅僅為數(shù)分鐘。因而使用天然或重組SCF于體內(nèi)，難以達到穩(wěn)定的有效的血漿濃度。本發(fā)明的干細胞生長因子與Fe融合蛋白(SCF-Fc )，不僅具有重組SCF的全部生物學(xué)活性，而且明顯延長了半衰期。特別，在器官移植方面，目前異體器官移植已成為挽救晚期器官衰竭患者生命的有效臨床手段，然而如何解決居高不下的中長期慢性移植器官排斥發(fā)生率，以及大劑量長期非特異免疫抑制藥物引發(fā)的嚴重合并癥，最終誘導(dǎo)受體對異體移植器官的免疫耐受，仍然是世界范圍異體器官移植界所面臨的嚴重挑戰(zhàn)。雖然近三十年來對異體移植免疫耐受的機理和實驗誘導(dǎo)方案的研究取的了很大進展，然而目前被證實的，能夠在多種不同種系動物模型，特別是在人的臨床腎移植的受體中，達到免疫耐受的僅有方法，是應(yīng)用供體骨髓細胞移植，誘導(dǎo)和維持長期的穩(wěn)定的嵌合體(MC)。
現(xiàn)行的成功的治療方案需要在移植前對受體使用大劑量放射治療合并多種細胞毒性藥物和免疫抑制藥物的誘導(dǎo)，達到對受體進行骨髓肅清(myeloablation)的效果。但是對大劑量放療和細胞毒性免疫抑制藥物安全性的顧慮，嚴重阻礙了這一方案在器官移植的臨床應(yīng)用。如何深入探索和掌握嵌合體介導(dǎo)的移植免疫耐受的機理，發(fā)展一種能夠在不對受體進行骨髓肅清(myeloablation)的條件下，成功誘導(dǎo)穩(wěn)定嵌合體狀態(tài)，以達到異體移植免疫耐受的目的，將是具有重大科學(xué)研究和臨床應(yīng)用意義的重要課題。近期對干細胞的研究提供顯著證據(jù)表明，骨髓造血干細胞(HSC)的維持和自身更新取決于其存在的微環(huán)境，稱之為誘導(dǎo)造血微環(huán)境或干細胞涅池(niche)。至今，大多數(shù)的研究最關(guān)注的是骨髓干細胞niche。這種特殊的在骨髓內(nèi)的niche,代表了一種和諧的微環(huán)境，在這個生理的微環(huán)境內(nèi)HSC和骨髓間充質(zhì)干細胞相互依存，共同維持這種平衡。骨髓HSC微環(huán)境對HSC功能的關(guān)鍵作用已得到充分的認識。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足之處，提供一種SCF-Fc融合蛋白。本發(fā)明的SCF-Fc融合蛋白，所說的SCF包括胞外區(qū)全部序列，所說的Fe片段包括鉸鏈區(qū)、CH2區(qū)和CH3區(qū)，所說的SCF與Fe序列之間為直接融合或通過連接序列融合，所說的SCF選自人、小鼠、大鼠或其他動物的SCF，所說的Fe片段選自人或動物的IgG、IgM、IgD、IgA或者它們的亞型，所說Fe片段選自天然型Fe或與受體和/或補體結(jié)合相關(guān)的氨基酸改變的突變型Fe。所說的SCF選自人、小鼠或大鼠SCF，其中人SCF具有如SEQ ID. I所示的氨基酸序列和如SEQ ID. 2所示的核苷酸序列，小鼠SCF具有如SEQ ID. 3所示的氨基酸序列和如SEQ ID. 4所示的核苷酸序列，大鼠SCF具有如SEQ ID. 5所示的氨基酸序列和如SEQ ID. 6所示的核苷酸序列。所說的Fe片段選自人或動物的IgG、IgM、IgD、IgA或者它們的亞型。所說的Fe片段選自人IgGl、小鼠IgG2a或大鼠IgG2a，其中人IgGl的氨基酸序列如SEQ ID. 7所示，小鼠IgG2a的氨基酸序列如SEQ ID. 8所示、大鼠IgG2a的氨基酸序列如SEQ ID. 9所示。所說的突變型Fe片段選自突變型人IgGl或小鼠IgG2a，其中突變型人IgGl的氨基酸序列如SEQ ID. 10所示，突變型小鼠IgG2a的氨基酸序列如SEQ ID. 11所示。本發(fā)明還包括一種SCF-Fc融合蛋白編碼DNA序列的載體，所說的載體為真核載、體。所說的真核載體為哺乳動物細胞表達載體。由于原核表達體系所表達的產(chǎn)物,缺乏糖基化修飾功能，蛋白功能不能保證，因此在此發(fā)明中，優(yōu)選哺乳動物細胞表達載體，如P Re-CMV ( Invitrogen 公司)。本發(fā)明還包括一種SCF-Fc融合蛋白編碼DNA序列的載體的宿主細胞，所說的宿主細胞選自真核細胞或原核細胞。所說的宿主細胞選自CHO細胞。本發(fā)明的SCF-Fc融合蛋白的用途，包括用于建立溶細胞性SCF-Fc融合蛋白，一過性的清除cKit表面受體陽性的造血干細胞，激活骨髓造血干細胞微環(huán)境一 Niche，促進造血干細胞歸宿至干細胞微環(huán)境，誘導(dǎo)和增強混合嵌合體的形成，以誘導(dǎo)移植免疫耐受，還可以應(yīng)用于對血液系統(tǒng)遺傳性細胞異常疾病的干細胞治療；用于建立非溶性的SCF-Fc融合 蛋白可以應(yīng)用于SCF的替代療法，以及用于標記和分離骨髓造血干細胞。本發(fā)明的所用術(shù)語“Fe”指免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)的羧基端或其中的一部分，例如免疫球蛋白Fe片段可包括重鏈CH1、CH2、CH3、CH4的兩個或更多結(jié)構(gòu)域與免疫球蛋白鉸鏈區(qū)的組合。已知免疫球蛋白有很多類別，如IgA、IgD、IgE、IgM及IgG(包括IgGl、IgG2、IgG3、IgG4)，從特定免疫球蛋白類別和亞類中選擇特定的免疫球蛋白Fe區(qū)，是在本領(lǐng)域技術(shù)人員所掌握的范圍之內(nèi)。免疫球蛋白是人類血液中最豐富的蛋白質(zhì)，它們的半衰期可高達21天。已經(jīng)報道和公布的專利將免疫球蛋白的Fe區(qū)域與其他蛋白質(zhì)(如各種細胞因子和可溶性受體)的區(qū)域融合，創(chuàng)制出融合蛋白。這類融合蛋白是通過IgG Fe鉸鏈區(qū)中的Cys殘基連接的同源二聚體蛋白，結(jié)構(gòu)類似于IgG分子但無CHl區(qū)域和輕鏈。這類融合蛋白維持有原功能蛋白質(zhì)的生物活性，同時大大延長了體內(nèi)半衰期(參見，如Nature，337:525-531. 1989;如 Trends Biotechnol.，14:52-60，1996;如美國專利 No. 5349053 與 6224867 及中國專利200510084233. 5)。在該方面幾個優(yōu)選的實施方案中，免疫球蛋白Fe片段分別選自人IgGl，小鼠IgG2a，大鼠IgG2a，包括其鉸鏈區(qū)、CH2、CH3區(qū)。實驗證明，本發(fā)明的SCF-Fc融合蛋白具有與重組SCF相比，半衰期明顯延長。SCF與免疫球蛋白Fe融合，可選擇多種連接序列，例如可以選擇一系列的甘氨酸和絲氨酸的組合，長度約為20個氨基酸殘基(參見美國專利NO 00/13827)，也可選擇SCF與免疫球蛋白Fe的鉸鏈區(qū)直接融合。在該方面的另一個優(yōu)選實施方式中，SCF與Fe鉸鏈區(qū)通過Gly-Asp連接序列融合。免疫球蛋白的Fe區(qū)域中消滅病原體的免疫防御中起重要作用。IgG的效應(yīng)功能由Fe介導(dǎo)通過兩種主要機制，即(I)與細胞表面Fe受體的結(jié)合，吞噬作用或殺傷細胞通過抗體依賴性細胞毒性途徑(ADCC)消化病原體；(2)與第一補體成分Cl的Clq部分結(jié)果，弓丨發(fā)依賴于補體的細胞毒性途徑(CDC)，從而裂解病原體。由于溶細胞性SCF-Fc融合蛋白，SPSCF與天然型免疫球蛋白Fe融合蛋白，由于其天然型Fe功能區(qū)的存在，所以其具有ADCC和⑶C效應(yīng)。在某些應(yīng)用方面，這兩種效應(yīng)是正向的，但在另一些應(yīng)用領(lǐng)域，這兩種效應(yīng)可能是反向的。因此，本發(fā)明還通過對Fe中與受體和(或)補體結(jié)合相關(guān)的氨基酸改變，提供了SCF-Fc融合蛋白的另一種形式，非溶細胞性SCF-Fc融合蛋白，即SCF與突變型免疫球蛋白Fe融合蛋白。


圖I為干細胞生長因子擴增電泳圖，其中，I :人干細胞生長因子PCR產(chǎn)物；2 :小鼠干細胞生長因子PCR產(chǎn)物；3 :大鼠干細胞生長因子PCR產(chǎn)物；M :DNA分子量標準(Marker);
圖2-1為表達純化的干細胞生長因子與Fe融合蛋白(SDS-PAGE)還原前電泳圖，其中，I :人干細胞生長因子與Fe融合蛋白(還原前)(Human SCF/Human IgGl-Fc++) ；2 :人干細胞生長因子與Fe變體融合蛋白(還原前)(Human SCF/Human IgGl-Fc—);3 :小鼠干細胞生長因子與Fe融合蛋白(還原前)(Mouse SCF/Mouse IgG2a_Fc++) ;4 :大鼠干細胞生長因子與Fe融合蛋白(還原前)(Rat SCF/Rat IgG2a_Fc++) ；5 :大鼠干細胞生長因子與小鼠Fe融合蛋白(還原前)(Rat SCF/Mouse IgG2a_Fc) M :蛋白分子量標準(Marker);
圖2-2為表達純化的干細胞生長因子與Fe融合蛋白(SDS-PAGE)還原后電泳圖，其中，
I:人干細胞生長因子與Fe融合蛋白(還原后)(Human SCF/Human IgGl-Fc++) ；2 :人干細胞生長因子與Fe變體融合蛋白(還原后)(Human SCF/Human IgGl-Fc—);3 :小鼠干細胞生長因子與Fe融合蛋白(還原后)(Mouse SCF/Mouse IgG2a_Fc++) ;4 :大鼠干細胞生長因子與Fe融合蛋白(還原后)(Rat SCF/Rat IgG2a_Fc++) ；5 :大鼠干細胞生長因子與小鼠Fe融合蛋白(還原后)(Rat SCF/Mouse IgG2a_Fc) M :蛋白分子量標準(Marker);
圖3為重組干細胞生長因子半衰期的測定曲線；
圖4-1為應(yīng)用SCF/Fc紅色熒光標記的骨髓造血干細胞；
圖4-2為應(yīng)用SCF/Fc (紅色)與抗ckit (白灰色)雙熒光標記的骨髓造血干細胞；
圖5為SCF-Fc熒光標記骨髓造血干細胞效果的流式細胞儀檢測結(jié)果；
圖6為應(yīng)用SCF/Fc分離骨髓造血干細胞的結(jié)果 圖7為應(yīng)用溶細胞性SCF/Fc增強混合嵌合體的建立以誘導(dǎo)移植免疫耐受結(jié)果圖。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明，應(yīng)理解，引用實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。實施例I干細胞生長因子與Fe融合蛋白表達質(zhì)粒的構(gòu)建 以人-干細胞生長因子與Fe融合蛋白的基因構(gòu)建為例
以購自 Thermo (Open Biosystems)公司的 cDNA 克隆(貨號MHS4426_99239430)為模板，擴增人SCF胞外區(qū)全序列(GenBank BC126166. 1)，上游引物引入NotI位點、Kozak序列
Pl: 5’ ATATGGCGGCCGCCGCCACCATGAAGAAGACACAAACTTG 3’ 下游引物引入 BamHI 位點 P2: 5’ ctctgGGATCCCAGTGTAGGCTGGAGTC 3’
反應(yīng)體系為50ul，其中濃度為50pM/ul引物各加O. 5ul，濃度為2. 5mM Each的dNTP加
O.8ul，所用DNA聚合酶為江蘇省弗泰生物科技有限公司生產(chǎn)的pfu DNA polymerase, 2. 5U/ul,加 O. 8ulο反應(yīng)條件為94°C 30秒、54°C 30秒、72°C 45秒，25個循環(huán)后，產(chǎn)物經(jīng)I. 5%瓊脂糖凝膠電泳分析，產(chǎn)物大小與預(yù)期大小(591bp)—致(圖3)。將得到的基因產(chǎn)物用江蘇省弗泰生物科技有限公司生產(chǎn)的DNA凝膠回收試劑盒純化后，用NotI和BamHI (Fermentas公司)酶切、回收、連接克隆至實驗室保存的pRc-CMV-Fc表達載體系統(tǒng)。
pRc-CMV-Fc表達載體系統(tǒng)是經(jīng)改造的帶有優(yōu)化的多克隆位點、信號肽序列、Fe片段系統(tǒng)(人、小鼠或大鼠天然型Fe，或相應(yīng)突變型Fe)。將Human SCF連接至pRc_CMV_ (Human IgGl-Fc)即得溶細胞性人SCF-Fc融合蛋白的表達構(gòu)建。同理，將Human SCF連接至pRc-CMV-(Mouse IgG2a_Fc)，即得溶細胞性人SCF-mFc融合蛋白的表達構(gòu)建；將Human SCF連接至pRc_CMV_(突變型Human IgGl-Fc),即得非溶細胞性Human SCF-Fc融合蛋白的表達構(gòu)建。將篩選、抽提得到的克隆質(zhì)粒測序(Genscript公司)，DNASTAR軟件比對，與預(yù)期序列完全一致，構(gòu)建即完成。同樣的方法，構(gòu)建小鼠-干細胞生長因子與Fe融合蛋白，大鼠-干細胞生長因子與Fe融合蛋白，所用模板及引物說明如下
小鼠-干細胞生長因子與Fe融合蛋白的基因構(gòu)建
模板購自 Thermo (Open Biosystems)公司的 cDNA 克隆(貨號MMM1013_65096),引物Pl :5’ atatgGCGGCCGCTGGATCGCAGCGCTG 3’，
引物 P2:5’ CAGAGGGATCCTGTAGGCCCGAGTCTTCAG 3’
PCR產(chǎn)物大小為676bp (圖I)
大鼠-干細胞生長因子與Fe融合蛋白的基因構(gòu)建
使用全基因合成的方法，方法參考文獻進行A modified method for PCR-directedgene synthesis from large number of overlapping oligodeoxyribonucleotides.Cherry, J ；Nieuwenhuijsen, Bff ；Kaftan, EJ ；Kennedy, JD ；Chanda, PKJournal of Biochemical and Biophysical Methods. 200870(6)
PCR產(chǎn)物大小為654bp (圖I)
實施例2.干細胞生長因子與Fe融合蛋白的生產(chǎn)
I、穩(wěn)定的高表達細胞株的篩選
用冷的I XPBS將對數(shù)生長期的CHO細胞稀釋至8 XlOVml后，
取0. 4mI懸液,加入電擊杯,再加入15ug線性化表達質(zhì)粒,混合后冰上靜置10-15min。設(shè)定電穿孔儀電壓800V，電容25uF，點穿后電擊杯在冰上靜置lOmin，用移液管轉(zhuǎn)移細胞至含5%1X FBS培養(yǎng)液的IOcm培養(yǎng)皿中培養(yǎng)。兩天后待細胞生長狀態(tài)恢復(fù)，用400 ug/ml的G418對陰性細胞進行篩選。觀察細胞狀態(tài)，每4天換液一次，培養(yǎng)兩周后，采用極限稀釋法，用96孔培養(yǎng)板進行高表達細胞株篩選。最終通過ELISA檢測和比較篩選，得到穩(wěn)定的高表達細胞株。2、高表達細胞株的培養(yǎng)
根據(jù)需要，按每毫升培養(yǎng)液加5mg微載體計算，稱取微載體，并在磷酸緩沖液(PBS)的液體模式下高壓滅菌。將滅菌好的微載體移入攪瓶，待微載體沉淀后，棄去PBS，加入培養(yǎng)液。取出細胞培養(yǎng)皿中的處于對數(shù)生長期的SCF-Fc高表達細胞，去上清液，加適量胰蛋白酶37°C消化2-3min(顯微鏡下可見細胞漂浮并分散)后，加適量含血清的培養(yǎng)基終止消化并細胞計數(shù)。根據(jù)細胞計數(shù)結(jié)果和培養(yǎng)體積，將細胞和培養(yǎng)液混合并使細胞分散均勻，得到細胞懸液，懸液細胞密度為l-5xl05/ml。待攪瓶中的微載體沉淀，棄去培養(yǎng)液,并將細胞懸液加入攪瓶。將攪瓶放入二氧化碳培養(yǎng)箱(5% 二氧化碳、37 °C)，調(diào)整攪瓶轉(zhuǎn)速至50-70rpm，進行連續(xù)懸浮培養(yǎng)。3、SCF-Fc融合蛋白的純化
發(fā)酵培養(yǎng)物經(jīng)高速冷凍離心后收集培養(yǎng)上清，培養(yǎng)上清經(jīng)離子截留分子量為IOKDPellicon (購自Millipore公司)超濃縮15倍,然后用Protein A親合層析柱(購自GE公司)分離提純，提純的蛋白經(jīng)IXPBS的透析最終得到SCF-FC融合蛋白。(圖2-1，圖2_2)實施例3.干細胞生長因子與Fe融合蛋白半衰期的測定
檢測原理和方法為檢測融合蛋白的血清半衰期特殊設(shè)計了一種酶聯(lián)免疫檢測方法(ELISA)，使用鼠抗人SCF單克隆抗體作為捕獲抗體，生物素標記的鼠抗人IgGl單克隆抗體作為檢測抗體，這種ELISA是特異性的針對人SCF-Fc融合蛋白中的SCF和IgGl，不會產(chǎn)生假陽性反應(yīng)，可以對血清中的SCF-Fc濃度進行定量的分析，從而測出SCF-Fc的循環(huán)半衰期。分別對4只10周大的C57BL/6小鼠靜脈注射O. Img人SCF-Fc融合蛋白，在注射后的5分鐘、I小時、5小時、8小時、24小時、48小時、72小時分別進行IOOml眼窩取血，并·進行上述ELISA方法檢測。SCF-Fc融合蛋白血清半衰期達到32小時。(圖3)
實施例4.應(yīng)用SCF-Fc熒光標記骨髓造血干細胞
先將Rat-SCF-mFc融合蛋白做生物素標記。用無水DMSO配制10mg/ml生物素N-羥基丁二酰亞胺活化酯溶液(SIGMA Cat# B-2642，生物素終濃度22mM)。用磷酸鹽緩沖液(IXPBS)配制濃度為O. 5mg/ml的Rat-SCF-mFc融合蛋白溶液。取3ul生物素酯溶液加入300ul Rat-SCF-mFc融合蛋白溶液中，室溫放置Ih。加入3. 3ul O. 5M Tris(pH=8)，室溫放置Ih終止反應(yīng)。IX PBS過夜透析。應(yīng)用生物素標記的Rat-SCF-mFc融合蛋白(Rat-SCFiFc-Biotin)進行紅色熒光標記骨髓造血干細胞。將LEW大鼠的骨髓細胞進行紅細胞裂解液溶解(碧云天生物技術(shù)公司，貨號C3702)，將細胞涂片、1%福爾馬林固定，然后用Rat-SCF-mFc-Biotin進行4度、30分鐘染色，再用Avidin-TRITC (購自博士德生物公司，貨號BA1093)染色，應(yīng)用熒光顯微鏡進行觀察，結(jié)果如圖4-1。應(yīng)用Rat-SCF-mFc-Biotin和抗cKit-FITC雙熒光標記骨髓造血干細胞。將LEW大鼠的骨髓細胞進行紅細胞裂解液溶解，將細胞涂片、1%福爾馬林固定，用Rat-SCF/mFc-Biotin進行4度、30分鐘染色，再用Avidin-TRITC染色，然后再用抗cKit-FITC進行染色，應(yīng)用熒光顯微鏡進行觀察，結(jié)果如圖4-2。SCF-Fc熒光標記骨髓造血干細胞效果的測定。將LEW大鼠的骨髓細胞進行紅細胞裂解液溶解，用Rat-SCF-mFc-Biotin進行4度、30分鐘染色。用Avidin-TRITC染色，然后再用抗cKit-FITC進行4度、30分鐘染色。經(jīng)流式細胞儀檢測，結(jié)果如圖5，93% SCF/Fc標記陽性骨髓細胞是cKit標記陽性。實施例5.應(yīng)用SCF-Fc分離骨髓造血干細胞
將LEW大鼠的骨髓細胞進行紅細胞裂解液溶解，應(yīng)用Rat-SCF-mFc-Biotin與Avidin-磁珠混合，4度、30分鐘后，加入骨髓細胞4度、30分鐘處理。過磁珠后，洗脫磁珠上的細胞。洗脫的細胞加入抗cKit-FITC，4度30分鐘處理后，用流式細胞儀分析。結(jié)果如圖6，應(yīng)用SCF-Fc分離的骨髓造血細胞77. 4%為cKit陽性的造血干細胞。實施例6.應(yīng)用SCF-Fc增強混合嵌合體的建立以誘導(dǎo)移植免疫耐受以BN大鼠為供體，進行原肢異體移植，以LEW大鼠為受體接受環(huán)孢素(Cyclosporin)和雷帕霉素(Rapamycin)進行ALS，21天治療，一組受體(n=2)接受了溶細胞性Rat-SCF-Fc融合蛋白(O. 3mg)腹腔注射，術(shù)后用抗BN大鼠MHC抗體檢測嵌合體的進行，結(jié)果顯示經(jīng)SCF-Fc融合蛋白治療的大鼠嵌合體不斷升高。其中一只受體術(shù)后11周可達97. 5%。另一只可達22. 4%，而對照組只維持在2- 4%之間。(如圖7)
權(quán)利要求
1.SCF-Fc融合蛋白，其特征在于，所說的SCF包括胞外區(qū)全部序列，所說的Fe片段包括鉸鏈區(qū)、CH2區(qū)和CH3區(qū)，所說的SCF與Fe序列之間為直接融合或通過連接序列融合，所說的SCF選自人、小鼠、大鼠或其他動物的SCF，所說的Fe片段選自人或動物的IgG、IgM、IgD、IgA或者它們的亞型，所說Fe片段選自天然型Fe或與受體和/或補體結(jié)合相關(guān)的氨基酸改變的突變型Fe。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的SCF-Fc融合蛋白，其特征在于，所說的SCF選自人、小鼠或大鼠SCF，其中人SCF具有如SEQ ID. I所示的氨基酸序列和如SEQ ID. 2所示的核苷酸序列，小鼠SCF具有如SEQ ID. 3所示的氨基酸序列和如SEQ ID. 4所示的核苷酸序列，大鼠SCF具有如SEQ ID. 5所示的氨基酸序列和如SEQ ID. 6所示的核苷酸序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的SCF-Fc融合蛋白，其特征在于，所說的Fe片段選自人或動物的IgG、IgM、IgD、IgA或者它們的亞型。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的SCF-Fc融合蛋白，其特征在于，所說的Fe片段選自人IgGl、小鼠IgG2a或大鼠IgG2a，其中人IgGl的氨基酸序列如SEQ ID. 7所示，小鼠IgG2a的氨基酸序列如SEQ ID. 8所示、大鼠IgG2a的氨基酸序列如SEQ ID. 9所示。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的SCF-Fc融合蛋白，其特征在于，所說的突變型Fe片段選自突變型人IgGl或小鼠IgG2a，其中突變型人IgGl的氨基酸序列如SEQ ID. 10所示，突變型小鼠IgG2a的氨基酸序列如SEQ ID. 11所示。
6.—種包含權(quán)利要求1-5中任意一種SCF-Fc融合蛋白編碼DNA序列的載體,其特征在于，所說的載體為真核載體。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的載體，其特征在于，所說的真核載體為哺乳動物細胞表達載體。
8.—種包含權(quán)利要求1-5中任意一種的SCF-Fc融合蛋白編碼DNA序列的載體的宿主細胞，其特征在于，所說的宿主細胞選自真核細胞或原核細胞。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的宿主細胞，其特征在于，所說的細胞選自CHO細胞。
10.如權(quán)利要求1-5中任意一種所述的SCF-Fc融合蛋白的用途，包括用于建立溶細胞性SCF-Fc融合蛋白，一過性的清除cKit表面受體陽性的造血干細胞，激活骨髓造血干細胞微環(huán)境一 Niche，促進造血干細胞歸宿至干細胞微環(huán)境，誘導(dǎo)和增強混合嵌合體的形成，以誘導(dǎo)移植免疫耐受，還可以應(yīng)用于對血液系統(tǒng)遺傳性細胞異常疾病的干細胞治療；用于建立非溶性的SCF-Fc融合蛋白可以應(yīng)用于SCF的替代療法，以及用于標記和分離骨髓造血干細胞。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種SCF-Fc融合蛋白，其特征在于，所說的SCF包括胞外區(qū)全部序列，所說的Fc片段包括鉸鏈區(qū)、CH2區(qū)和CH3區(qū)，所說的SCF與Fc序列之間為直接融合或通過連接序列融合。本發(fā)明的SCF-Fc融合蛋白可用于建立溶細胞性SCF-Fc融合蛋白，一過性的清除cKit表面受體陽性的造血干細胞，激活骨髓造血干細胞微環(huán)境－Niche,促進造血干細胞歸宿至干細胞微環(huán)境，誘導(dǎo)和增強混合嵌合體的形成，以誘導(dǎo)移植免疫耐受，還可以應(yīng)用于對血液系統(tǒng)遺傳性細胞異常疾病的干細胞治療；用于建立非溶性的SCF-Fc融合蛋白可以應(yīng)用于SCF的替代療法，以及用于標記和分離骨髓造血干細胞。
文檔編號A61K38/18GK102675470SQ201210094390
公開日2012年9月19日 申請日期2012年4月1日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月1日
發(fā)明者卞春東, 查長春, 田燕, 鄭心校 申請人:江蘇省弗泰生物科技有限公司