專利名稱：一種復方免疫增強劑、禽用疫苗及其制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領域，具體涉及復方免疫增強劑。
背景技術：
現(xiàn)有各類獸用疫苗主要包括活疫苗、滅活疫苗和亞單位疫苗。滅活疫苗因其安全性，得到廣泛的應用。常用的獸用滅活疫苗和亞單位疫苗均只能激發(fā)機體產生體液免疫，且激發(fā)機體產生抗體的時間較長，一般需要在免疫后3 4周達到各類疫苗規(guī)定的抗體效價。在這段缺乏免疫保護窗口期，存在巨大疫病風險。如高致病性禽流感常規(guī)疫苗，其免疫后抗體效價達到我國規(guī)定的保護標準要求(71og2)至少需要3周，而在這3周的窗口期內一旦發(fā)生高致病性禽流感，將會導致災難性后果，對養(yǎng)殖戶和養(yǎng)禽業(yè)造成重大損失。更重要的是，由于禽流感病毒對人具有感染性，因此，發(fā)生高致病性禽流感，亦對公共衛(wèi)生安全造成嚴重威脅。因此，縮短現(xiàn)有禽流感疫苗免疫后的窗口期，具有重要意義。同時，提高禽流感疫苗的抗體效價和免疫持續(xù)期，可以減少免疫次數(shù)，減少人力和物力投入，并降低免疫帶來的應激反應，這對于臨床生產具有重要經濟意義。H9亞型禽流感是危害養(yǎng)禽業(yè)發(fā)展的重要傳染病之一?，F(xiàn)有H9亞型禽流感疫苗在免疫后3至4周才能達到國家規(guī)定的71og2的抗體水平要求。而在此期間，一直處于免疫保護的窗口期，受H9亞型禽流感的威脅。因此，臨床生產亟需一種能提高現(xiàn)有禽流感疫苗抗體效價的免疫增強劑?，F(xiàn)有傳染性支氣管炎疫苗需用弱毒活疫苗進行基礎免疫，再用滅活疫苗加強免疫才能獲得較好的免疫效果。采用兩次免疫法，導致出現(xiàn)至少I個月的免疫保護窗口期，而且傳支弱毒活疫苗易受母源抗體的干擾，導致免疫失敗?，F(xiàn)用獸用疫苗利用礦物油包被水相抗原制成油乳劑疫苗，礦物油的主要作用是暫時儲存抗原，提高疫苗抗原的緩釋性。以礦物油為遞送系統(tǒng)的各類滅活油乳劑疫苗激發(fā)機體產生的抗體效價不高，特別是類似傳支病毒免疫原性不強的抗原，且抗體維持時間較短，幾乎不能激發(fā)機體產生有效的細胞免疫。因此，臨床亟需一種能提高現(xiàn)有滅活疫苗免疫效果，縮短免疫保護窗口期，具有較長抗體維持期，并能提高滅活疫苗細胞免疫效果的免疫增強劑。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種復方免疫增強劑，該復方免疫增強劑能夠使疫苗的免疫窗口期縮短，顯著提高抗體效價，延長抗體持續(xù)期。本發(fā)明的另一目的是提供所述復方免疫增強劑的制備方法，該方法簡單，易操作。本發(fā)明的另一目的是提供一種含有所述的復方免疫增強劑的禽用疫苗，該禽用疫苗的免疫窗口期短，抗體效價高，抗體持續(xù)期長。本發(fā)明的再一目的是提供所述禽用疫苗的制備方法，該方法簡單，易操作。本發(fā)明提供一種復方免疫增強劑，該復方免疫增強劑含有5ng lOmg/mL的聚肌、胞、IOng 10mg/mL的胞壁酰二肽、IOng 5mg/mL的左旋咪唑、IOng 5mg/mL的雷西莫特和IOng 5mg/mL咪喹莫特。所述聚肌胞、胞壁酰二肽、左旋咪唑、雷西莫特和咪喹莫特的質量濃度比為I:(I 10) : (I 10) : (I 10) : (I 10)。所述聚肌胞、胞壁酰二肽、左旋咪唑、雷西莫特和咪喹莫特的質量濃度比為I: (2 5) : (2 5) : (3 6) : (3 6)。本發(fā)明還提供一種制備所述復方免疫增強劑的方法，包括下述步驟
(1)配制水相溶液在磷酸鹽緩沖液中加入聚肌胞、胞壁酰二肽和左旋咪唑，然后加入吐溫-80，配制成水相溶液； (2)配制油相溶液在白油中加入雷西莫特、咪喹莫特，然后加入司盤-80配制成油相溶液；
(3)將所述水相溶液與油相溶液充分混合，即得所述復方免疫增強劑。本發(fā)明還提供一種禽用疫苗，所述禽用疫苗中含有5ng 10mg/mL的聚肌胞、IOng 10mg/mL的胞壁酰二肽、IOng 5mg/mL的左旋咪唑、IOng 5mg/mL的雷西莫特和IOng 5mg/mL咪喹莫特；所述禽用疫苗中還含有滅活疫苗抗原。所述禽用疫苗中聚肌胞、胞壁酰二肽、左旋咪唑、雷西莫特和咪喹莫特的質量濃度比為 I: (I 10) : (I 10) : (I 10) : (I 10)。所述聚肌胞、胞壁酰二肽、左旋咪唑、雷西莫特和咪喹莫特的質量濃度比為I: (2 5) : (2 5) : (3 6) : (3 6)。所述禽用疫苗為H5亞型禽流感疫苗、H9亞型禽流感疫苗或傳染性支氣管炎疫苗。本發(fā)明還提供一種制備所述禽用疫苗的方法，包括下述步驟
(1)配制水相溶液在磷酸鹽緩沖液中加入聚肌胞、胞壁酰二肽和左旋咪唑，然后加入吐溫-80，配制成水相溶液；
(2)在所述水相溶液中加入滅活疫苗抗原，混勻后得到滅活抗原溶液；
(3)配制油相溶液在白油中加入雷西莫特、咪喹莫特，然后加入司盤-80配制成油相溶液；
(4)將所述滅活抗原溶液與油相溶液充分混合，即得所述復方免疫增強劑。有益效果本發(fā)明的復方免疫增強劑，由于其各成分的協(xié)同作用，使疫苗的免疫窗口期縮短，顯著提高抗體效價，延長抗體持續(xù)期。本發(fā)明復方免疫增強劑與H5亞型禽流感滅活疫苗混合使用免疫雞，與常規(guī)疫苗比較，抗體產生提前I周，即免疫窗口期縮短I周，提高抗體效價1.81og2以上，抗體持續(xù)期延長I個月。本發(fā)明復方免疫增強劑與傳染性支氣管炎滅活疫苗M41混合使用僅免疫一次,免疫雞后4周的抗體效價,與常規(guī)操作的兩次免疫后的抗體效價相當。本發(fā)明含有該復方免疫增強劑的禽用疫苗的免疫窗口期短，抗體效價高，抗體持續(xù)期長。所述禽用疫苗的制備方法，簡單，易操作。


圖I.顯示各組免疫后血清HI抗體效價。圖2顯示免疫后HI抗體持續(xù)期。圖3顯示各組免疫后血清HI抗體效價。
具體實施例方式實施例I復方免疫增強劑、禽用疫苗的配制 (I) 試驗材料
聚肌胞、咪喹莫特、雷西莫特、胞壁酰二肽，以及抗寄生蟲類藥物左旋咪唑購自SIGMA公司。白油購自法國埃索公司，吐溫-80和司盤-80購自廣東肇慶超能實業(yè)有限公司。配制磷酸鹽緩沖液的無機鹽購自國藥集團化學試劑有限公司。(2) 試驗方法
①制備復方免疫增強劑
水相溶液的配制首先配制磷酸鹽(PBS)緩沖液，其配方中含Na2HPO4S I. 44g/L，KH2PO4為I. 44g/L，NaCl為8g/L，KCl為0. 2g/L，以雙蒸水溶解上述鹽，調整pH為7. 0，滅菌后備用。然后在所述PBS緩沖液中加入聚肌胞、胞壁酰二肽、左旋咪唑，然后加入吐溫-80，配制成水相溶液，所述吐溫-80在水相溶液的體積百分含量為4%。油相溶液的配制在白油中加入雷西莫特、咪喹莫特和司盤-80配制成油相溶液，司盤-80在油相溶液中的體積百分含量為4%。將所述水相溶液和油相溶液混合均勻，配制成含有5ng 10mg/mL聚肌胞、IOng lOmg/mL胞壁酸二妝、IOng 5mg/mL左旋咪唑、IOng 5mg/mL雷西莫特和IOng 5mg/mL咪喹莫特的復方免疫增強劑。所述聚肌胞、胞壁酰二肽、左旋咪唑、雷西莫特和咪喹莫特的質量濃度比為I: (I 10) : (I 10) : (I 10) : (I 10)。所述聚肌胞、胞壁酰二肽、左旋咪唑、雷西莫特和咪喹莫特的質量濃度比為I: (2 5) : (2 5) : (3 6) : (3 6)。②禽用疫苗及其配制方法
禽用疫苗中含有5ng 10mg/mL的聚肌胞、IOng 10mg/mL的胞壁酰二肽、IOng 5mg/mL的左旋咪唑、IOng 5mg/mL的雷西莫特和IOng 5mg/mL咪喹莫特；所述禽用疫苗中還含有滅活疫苗抗原。該禽用疫苗含有上述復方免疫增強劑。為了與現(xiàn)有疫苗相區(qū)分，在實施例2 — 5中將該禽用疫苗均稱為含有復方免疫增強劑的禽用疫苗。所述聚肌胞、胞壁酰二肽、左旋咪唑、雷西莫特和咪喹莫特的質量濃度比為I: (I 10) : (I 10) : (I 10) : (I 10)。所述聚肌胞、胞壁酰二肽、左旋咪唑、雷西莫特和咪喹莫特的質量濃度比為I: (2 5) : (2 5) : (3 6) : (3 6)。所述禽用疫苗為H5亞型禽流感疫苗、H9亞型禽流感疫苗或傳染性支氣管炎疫苗。制備禽用疫苗的方法
第一種方法，配制母液，所述母液的成分與所述復方免疫增強劑相同，所述母液中聚肌 胞、胞壁酰二肽、左旋咪唑、咪喹莫特、雷西莫特濃度為禽用疫苗中相應物質濃度的10倍；將所述母液與現(xiàn)有疫苗按照體積比為1:9混合均勻，即得到禽用疫苗。飼養(yǎng)戶在實際操作過程中，能夠將該復方免疫增強劑與各種現(xiàn)有疫苗混合使用，操作方便，靈活。第二種方法，包括如下步驟(I)配制水相溶液在磷酸鹽緩沖液中加入聚肌胞、胞壁酰二肽和左旋咪唑，然后加入吐溫-80，配制成水相溶液；(2)在所述水相溶液中加入滅活疫苗抗原，混勻后得到滅活抗原溶液；(3)配制油相溶液在白油中加入雷西莫特、咪喹莫特，然后加入司盤-80配制成油相溶液；(4)將所述滅活抗原溶液與油相溶液充分混合，即得禽用疫苗。這種方法，對于疫苗生產企業(yè)來說，操作更加的方便易行。采用上述兩種方法制備的相同配方的禽用疫苗，在免疫效果上相同。特別列舉出兩種方法，是為了滿足不同用戶操作方便的需要。配制禽用疫苗H5亞型禽流感疫苗、H9亞型禽流感疫苗和傳染性支氣管炎疫苗。各種禽用疫苗分別配制三種配方禽用疫苗A、B和C。禽用疫苗A中聚肌胞、胞壁酰二肽、左旋咪唑、咪喹莫特、雷西莫特的濃度分別為5ng/mL、10ng/mL、10ng/mL、15ng/mL和15ng/mL，將禽用疫苗A簡稱為A-VAl ;禽用疫苗B中聚肌胞、胞壁酰二肽、左旋咪唑、咪喹莫特、雷西莫特的濃度分別為I y g/mL>5 u g/mL>5 u g/mL、6 u g/mL和6 ii g/mL,將禽用疫苗B簡稱為B-VAl ;禽用疫苗C中聚肌胞、胞壁酰二肽、左旋咪唑、咪喹莫特、雷西莫特的濃度分別為lmg/mL、4mg/mL、4mg/mL、4mg/mL 和 4mg/mL,將禽用疫苗 C 簡稱為 C-VAI。本實施例中的重量單位根據(jù)配制體積，可以為納克、微克、毫克或克。本實施例中，免疫增強劑的各組分可以在給出的配比范圍內靈活進行組合，在此不一一例舉。除添加上述免疫增強劑成分外，以上方法制備疫苗是熟悉本領域的技術人士所知悉的常規(guī)方法。實施例2復方免疫增強劑對H5亞型禽流感疫苗免疫效力和抗體持續(xù)期的影響 (I)試驗材料 采用現(xiàn)有的H5亞型禽流感疫苗，按照實施例I第一種方法制備含復方免疫增強劑的H5亞型禽流感疫苗A、B和C。H5亞型禽流感疫苗A、B和C分別簡稱A_VAl_Re5、B_VAl_Re5、C-VA1-Re5。H5亞型禽流感疫苗和H5亞型禽流感標準檢測抗原均購自哈爾濱維科生物技術開發(fā)公司。制苗用白油購自法國埃索公司(Esso, Marcol 52)，吐溫-80和司盤-80購自廣東肇慶超能實業(yè)有限公司。無特定病原體(Specific Pathogen Free, SPF)雞系從北京梅里亞維通實驗動物技術有限公司購買雞胚，經自行孵化后于隔離器內飼養(yǎng)，飼養(yǎng)至28日齡待用。(2)試驗方法
免疫和分組根據(jù)“規(guī)程”，4周齡雞免疫0. 3mL/雞，5周齡以上的雞按0. 5mL/雞免疫，免疫途徑為肌肉或皮下注射。本次試驗取35日齡雞，經頸部皮下途徑按0. 3mL/雞接種，設立含復方免疫增強劑的A-VA1-Re5、B-VAI-Re 5、C-VAI-Re 5疫苗組和H5亞型禽流感疫苗組(現(xiàn)有疫苗，縮寫為Re-5常規(guī)苗組)、以及空白對照組(不免疫)，共5組，各免疫組均有20只雞，空白對照組10只雞。(3)復方免疫增強劑對H5亞型禽流感疫苗免疫效力的影響
采血和抗體效價檢測免疫后第2周和第3周經靜脈采血，分離血清，用H5亞型禽流感標準檢測抗原，采用微量血凝抑制試驗(HI)檢測血清抗體效價，HI檢測方法參考2010年版《中國獸藥典》。根據(jù)每組雞的幾何平均抗體效價(GMT)和方差(SD)，比較復方免疫增強劑對現(xiàn)有H5亞型禽流感疫苗的免疫增強效果。結果
在免疫后2周，含復方免疫增強劑的疫苗組的抗體效價高于常規(guī)疫苗效價至少
I.61og2，達到或高于常規(guī)疫苗免疫后3周的抗體效價，與規(guī)程要求的常規(guī)疫苗免疫后3周的合格抗體效價(71og2)—致。即含復方免疫增強劑的疫苗能將免疫窗口期縮短I周。免疫后3周，含免疫復方增強劑的疫苗組的抗體效價均高于常規(guī)疫苗組抗體效價，含免疫復方增強劑疫苗組之間的幾何平均抗體效價相當，而常規(guī)疫苗剛達到規(guī)程要求的合格水平，詳見圖I。經One-Way ANOVA, Tukey分析表明，含復方免疫增強劑疫苗的抗體效價與常規(guī)疫苗組抗體效價差異顯著(P< 0.05)。在圖I中以*表示。試驗結果表明，不同劑量的復方免疫增強劑配方均能提高H5亞型禽流感疫苗抗體效價，具有明顯的免疫增強作用，且能縮短免疫窗口期。(4)復方免疫增強劑對H5亞型禽流感疫苗的抗體持續(xù)期的影響
采血和抗體效價檢測免疫后第2、3、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22和24周經靜脈采血，分離血清，用H5亞型禽流感標準檢測抗原，采用微量血凝抑制試驗(HI)檢測血清抗體 效價。結果和結論
從免疫后2周開始檢測抗體，含復方免疫增強劑的H5亞型禽流感疫苗在免疫后的抗體均高于常規(guī)疫苗組。A-VA1-Re5疫苗組在免疫后2 18周抗體效價在71og2以上，B_VAl_Re5疫苗組在免疫后2 20周抗體效價在71og2以上，C-VA1-Re5疫苗組在免疫后2 22周抗體效價均在71og2以上，均符合規(guī)程要求。而常規(guī)疫苗免疫后僅在第3周到第6周抗體效價維持在71og2，此后抗體效價持續(xù)下降至41og2。詳見圖2。試驗結果表明，本發(fā)明中的復方免疫增強劑能縮短現(xiàn)有H5亞型禽流感疫苗免疫窗口期I周，提高H5亞型禽流感疫苗抗體效價，并在后續(xù)的抗體持續(xù)期中比常規(guī)疫苗維持較高的效價長達14-18周，具有顯著的免疫增強作用。
實施例3復方免疫增強劑對H9亞型禽流感疫苗免疫效力的影響 (I)試驗材料
采用現(xiàn)有的H9亞型禽流感疫苗，按照實施例I第一種方法制備含復方免疫增強劑的H9亞型禽流感疫苗A、B和C。含復方免疫增強劑的H9亞型禽流感疫苗A、B和C分別簡稱為A-VA1-H9、B-VA1-H9、C-VA1-H9?，F(xiàn)有的H9亞型禽流感疫苗和H9禽流感檢測抗原均購自南京天邦生物科技有限公司。(2)試驗方法
免疫和分組根據(jù)《獸用生物制品質量標準匯編(2006-2008)》，簡稱“規(guī)程”，4周齡雞免疫0. 3mL/雞，5周齡以上的雞按0. 5mL/雞免疫，免疫途徑為肌肉或皮下注射。本次試驗取35日齡雞，經頸部皮下途徑按0. 3mL/雞接種，設立含A-VA1-H9、B-VA1-H9、C-VAI-H9組和H9常規(guī)疫苗組以及空白對照組(不免疫)，共5組，各免疫組每組各20只雞，空白對照組10只雞。H9常規(guī)疫苗組采用現(xiàn)有的H9亞型禽流感疫苗，由南京天邦生物科技有限公司提供。采血和抗體效價檢測免疫后第2、3、4周經靜脈采血，分離血清，用H9禽流感檢測抗原，采用微量血凝抑制試驗(HI)檢測血清抗體效價。根據(jù)每組雞的幾何平均效價和方差，比較免疫增強劑對疫苗的免疫增強效果。(3)結果和結論
抗體效價在免疫后2周，含復方免疫增強劑的疫苗組的抗體效價高于常規(guī)疫苗效價至少0. 81og2，接近于常規(guī)疫苗免疫后3周的抗體效價。含復方免疫增強劑的疫苗能將免疫窗口期縮短I周。免疫后3和4周，含復方免疫增強劑疫苗組的抗體效價均高于常規(guī)疫苗組抗體效價，含復方免疫增強劑疫苗組之間的幾何平均抗體效價相當，詳見圖3。經One-Way ANOVA, Tukey分析，含免疫增強劑疫苗的抗體效價與常規(guī)疫苗組抗體效價差異顯著(P<0.05)。在圖3中以*表示。試驗結果表明，復方免疫增強劑能提高H9亞型禽流感疫苗抗體效價，具有明顯的免疫增強作用，且能縮短免疫窗口期I周。
實施例4復方免疫增強劑提高傳染性支氣管炎疫苗M41株免疫效力試驗 (I)試驗材料
傳染性支氣管炎病毒(Infectious Bronchitis Virus, IBV) H120株和M41株購自中 國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，經本室用11日齡無特定病原(Specific Pathogen Free, SPF)雞胚繁殖制備。傳染性支氣管炎病毒M41株滅活疫苗抗原的制備方法抗原系用M41病毒經接種11日齡SPF雞胚擴繁后，經初步離心除雜處理后M41株抗原含量為IO72個雞胚半數(shù)感染量/0. ImL ( 107 2EID5Q/0. ImL)，￠-丙內脂滅活。傳染性支氣管炎病毒H120株疫苗抗原的制備方法抗原系用H120病毒經接種11日齡SPF雞胚擴繁后，經初步離心除雜處理后H120株抗原含量為IO6 8個雞胚半數(shù)感染量/0. ImL (106 8EID50/0. ImL)。傳染性支氣管炎診斷抗原采用荷蘭BioChek國際通用進口的M41傳染性支氣管炎標準抗原作為血凝抑制抗原。SPF雞系從北京梅里亞維通實驗動物技術有限公司購買雞胚，經自行孵化后于隔離器內飼養(yǎng)至使用。制苗用白油購自法國埃索公司，吐溫-80和司盤-80購自廣東肇慶超能實業(yè)有限公司。(2)試驗方法
采用傳染性支氣管炎病毒M41株滅活疫苗抗原，并參考“規(guī)程”，調整抗原用量達到規(guī)程要求，按照實施案例I第二種方法制備含復方免疫增強劑的傳染性支氣管炎疫苗A、B和C。所述含復方免疫增強劑的傳染性支氣管炎疫苗A、B和C，分別縮寫為A-VA1-M41、B-VA1-M41和 C-VA1-M41。H120株活疫苗的制備方法按照規(guī)程制備的不含免疫增強劑的H120株活疫苗。M41常規(guī)滅活苗的制備方法按照規(guī)程制備的不含免疫增強劑的M41常規(guī)滅活苗。免疫和分組參考“規(guī)程”，取I月齡SPF雞，共分為6組，10只雞/組。其中I組用H120株活疫苗按I羽份/雞進行首免。其余5組不免，并與H120株活疫苗免疫組隔離飼養(yǎng)。經H120株活疫苗免疫的10只雞在免疫后21天采血，此時雞為51日齡，再經頸部皮下免疫M41常規(guī)滅活苗，0. 3mL/雞。未免疫的5組雞中，任意選4組分別命名為A-VA1-M41組、B-VA1-M41組、C-VA1-M41組和M41常規(guī)滅活苗組，各組雞在51日齡時分別免疫對應于組名的疫苗A-VA1-M41、B-VA1-M41、C-VA1-M41和M41常規(guī)滅活苗。另外留一組雞不免作為空白對照。采血和抗體效價檢測在51日齡僅對H120首免組的雞進行采血，在79日齡，對每只雞進行采血，用傳染性支氣管炎診斷抗原測定各組雞的血清抗體效價，比較HI抗體水平。用M41傳染性支氣管炎標準抗原，采用微量血凝抑制試驗(HI)檢測血清抗體效價。(3)結果和結論
本次試驗中，空白對照雞的HI效價較低，經H12 0株活疫苗作基礎免疫后再用M41常規(guī)滅活苗加強免疫(縮寫為H120+M41 二免)，其抗體水平高于H120首免6. 5倍(27-73/25-04=22-69 ^ 6. 5)，符合規(guī)程中至少提高3倍抗體效價的要求。A-VA1-M41 (7. 821og2)、B-VAl_M41 (7. 891og2)和 C-VA1-M41 (8. 041og2)組免后28天，雞只的HI平均抗體效價均略高于與H120+M41加強免疫組(7. 7321og2)，遠高于M41常規(guī)滅活苗免疫組(4. 371og2)和H120首次免疫時的效價(5. 041og2)。含復方免疫增強疫苗組與M41常規(guī)滅活苗比較，經One-Way ANOVA, Tukey分析，差異極顯著，P < 0. 0001。詳見表I。試驗結果表明，含復方免疫增強劑的傳染性支氣管炎疫苗免疫后能達到與H120 株活疫苗作基礎免疫再用M41常規(guī)滅活苗加強免疫的效果，復方免疫增強劑能顯著增強M41疫苗的免疫效果。H120株活疫苗作基礎免疫再用M41常規(guī)滅活苗加強免疫的方法，不僅操作麻煩，而且首免后的效價很低，免疫窗口期較長，如果采用含復方免疫增強劑的傳染性支氣管炎疫苗，不僅能夠縮短免疫窗口期，而且操作簡單。表I免疫IB疫苗后雞血清的HI效價
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注a，針對IB病毒的HI效價低于21og2，判為非特異性血凝，故對照組不計平均血凝價。表示，與M41常規(guī)滅活苗比較，經One-Way ANOVA, Tukey分析，差異極顯著，P < 0.0001。
實施例5安全性檢測
(I)試驗材料
參照實施例2方法制備A-VA1-Re5、B_VAl_Re5、C_VAl_Re5。SPF雞系從北京梅里亞維通實驗動物技術有限公司購買雞胚，經自行孵化后于隔離器內飼養(yǎng)至使用。(2)試驗方法
將28日齡SPF雞分成140只。各種疫苗免疫組，10只雞/組。對照組20只雞。A_VAl_Re5組、B-VA1-Re5組、C_VAl_Re5組均在第28天免疫一次與組名相對應的疫苗，每只雞經頸部皮下免疫0. 3mL疫苗；Re-5組在第28天免疫一次現(xiàn)有的H5亞型禽流感疫苗，每只雞經頸部皮下免疫 0. 3mL 疫苗。2A-VA1-Re5 組(免疫 A_VAl-Re5)、2B_VAl-Re5 組(免疫 B_VAl_Re5)、2C-VA1-Re5組(免疫C_VAl_Re5)和2Re_5組(免疫現(xiàn)有的H5亞型禽流感疫苗)在第28天均免疫一次，每只雞經頸部皮下免疫0. 6mL疫苗。A-VA1-Re5+A-VA1-Re5組(免疫A_VAl_Re5)、B-VA1-Re5+B-VA1-Re5 組(免疫 B-VAl-Re5)、C-VAl-Re5+C_VAl-Re5 組(免疫 C_VAl_Re5)和Re-5+Re-5 (免疫現(xiàn)有的H5亞型禽流感疫苗)組經2次免疫，第一次在第28天，每只雞經頸部皮下免疫0. 3mL疫苗，過14天后，即42日齡，每只雞經頸部皮下再免疫0. 3mL疫苗。一次免疫組，包括一次免疫0. 3mL疫苗組和0. 6mL疫苗組，均在免疫后第7天和第14天分別從各組中隨機抽出5只，另從對照組中隨機抽出5只，撲殺，觀察疫苗吸收情況。兩次免疫組，在第二次免疫結束后，第7天和第14天分別從各組中隨機抽出5只，另從對照組中隨機抽出5只，撲殺，觀察疫苗吸收情況。免疫后連續(xù)觀察14天，記錄是否出現(xiàn)任何發(fā)病癥狀，以及采食和飲水情況。(3) 結果和結論
I.連續(xù)觀察14天，所有雞只飲水采食正常，無任何異常情況。2. 一次免疫0. 3mL組疫苗吸收情況。在免疫后第7天，從A-VA1-Re5組、B-VA1-Re5組、C-VA1-Re5組和Re-5組，對照組隨機抽取5只，經撲殺，剖檢疫苗注射部位的疫苗吸收情況。各疫苗免疫組在疫苗注射部位含有一些淡黃色米?；蛩诹４笮☆愃浦緲宇w粒物?？瞻讓φ战M無此淡黃色米粒大小類似脂肪樣顆粒物。在免疫后第14天，撲殺每組余下的5只雞，僅B-VA1-Re5組和C_VAl_Re5組中各有I只雞在注射部位含有淡黃色粟粒大小類似脂肪樣顆粒物，其余雞均與空白對照無異。詳見表2。3. 一次免疫0. 6mL組疫苗吸收情況。在免疫后第7天，從2A_VAl_Re5組、2B-VAl-Re5、2C-VAl-Re5組和2Re_5，對照組隨機抽取5只，經撲殺，剖檢疫苗注射部位的疫苗吸收情況。各疫苗免疫組均在疫苗注射部位含有少量粟粒大小乳白色顆粒，部分雞含有米粒大小或粟粒大小淡黃色類似脂肪樣顆粒物?？瞻讓φ战M正常。在免疫后第14天，撲殺每組余下的5只雞，個別免疫組的雞含有米粒大小或粟粒大小淡黃色類似脂肪樣顆粒物，其余正常?？瞻捉M正常。詳見表2。4. 二次免疫組疫苗吸收情況。在第二次免疫后第7天，從A-VA1-Re5+ A_VAl_Re5組、B-VA1-Re5+B-VA1-Re5 組、C-VAI-Re 5+C-VAI-Re 5 組和 Re_5+Re5 以及對照組各抽取 5只，經撲殺剖檢疫苗注射部位吸收情況。各疫苗免疫組均在疫苗注射部位含有少量粟粒大小乳白色顆粒，部分雞含有米粒大小或粟粒大小淡黃色類似脂肪樣顆粒物?？瞻讓φ战M正常。在免疫后第14天，撲殺每組余下的5只雞，個別免疫組的雞含有米粒大小或粟粒大小淡黃色類似脂肪樣顆粒物，其余正常?？瞻捉M正常。詳見表2。5.免疫后飲水采食等狀況提示，含免疫增強劑的疫苗免疫后對雞的正常飲食不產生明顯影響。根據(jù)含免疫增強劑疫苗組與常規(guī)疫苗組經0. 3mL和0. 6mL免疫一次，以及
0.3mL免疫二次剖檢后的結果比對，含復方免疫增強劑疫苗組的吸收與常規(guī)疫苗組無明顯差異。結果提示，免疫增強劑不影響疫苗的正常吸收，含免疫增強劑疫苗對免疫雞安全。表2雞疫苗吸收情況
權利要求
1.一種復方免疫增強劑，其特征在于該復方免疫增強劑含有5ng lOmg/mL的聚肌胞、IOng 10mg/mL的胞壁酰二肽、IOng 5mg/mL的左旋咪唑、IOng 5mg/mL的雷西莫特和IOng 5mg/mL咪喹莫特。
2.根據(jù)權利要求I所述復方免疫增強劑，其特征在于所述聚肌胞、胞壁酰二肽、左旋咪唑、雷西莫特和咪喹莫特的質量濃度比為I: (I 10) : (I 10) : (I 10) : (I 10)。
3.根據(jù)權利要求2所述的復方免疫增強劑，其特征在于所述聚肌胞、胞壁酰二肽、左旋咪唑、雷西莫特和咪喹莫特的質量濃度比為I: (2 5) : (2 5) : (3 6) : (3 6)。
4.一種制備權利要求I所述復方免疫增強劑的方法，包括下述步驟 (1)配制水相溶液在磷酸鹽緩沖液中加入聚肌胞、胞壁酰二肽和左旋咪唑，然后加入吐溫-80，配制成水相溶液； (2)配制油相溶液在白油中加入雷西莫特、咪喹莫特，然后加入司盤-80配制成油相溶液； (3)將所述水相溶液與油相溶液充分混合，即得所述復方免疫增強劑。
5.一種禽用疫苗，其特征在于所述禽用疫苗中含有5ng lOmg/mL的聚肌胞、IOng lOmg/mL的胞壁酰二肽、IOng 5mg/mL的左旋咪唑、IOng 5mg/mL的雷西莫特和IOng 5mg/mL咪喹莫特；所述禽用疫苗中還含有滅活疫苗抗原。
6.根據(jù)權利要求5所述禽用疫苗，其特征在于所述聚肌胞、胞壁酰二肽、左旋咪唑、雷西莫特和咪喹莫特的質量濃度比為I: (I 10) : (I 10) : (I 10) : (I 10)。
7.根據(jù)權利要求6所述禽用疫苗，其特征在于所述聚肌胞、胞壁酰二肽、左旋咪唑、雷西莫特和咪喹莫特的質量濃度比為I: (2 5) : (2 5) : (3 6) : (3 6)。
8.根據(jù)權利要求7所述禽用疫苗，其特征在于所述禽用疫苗為H5亞型禽流感疫苗、H9亞型禽流感疫苗或傳染性支氣管炎疫苗。
9.一種制備權利要求5所述禽用疫苗的方法，包括下述步驟 (1)配制水相溶液在磷酸鹽緩沖液中加入聚肌胞、胞壁酰二肽和左旋咪唑，然后加入吐溫-80，配制成水相溶液； (2)在所述水相溶液中加入滅活疫苗抗原，混勻后得到滅活抗原溶液； (3)配制油相溶液在白油中加入雷西莫特、咪喹莫特，然后加入司盤-80配制成油相溶液； (4)將所述滅活抗原溶液與油相溶液充分混合，即得所述復方免疫增強劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及復方免疫增強劑及其在制備獸用疫苗中的應用。復方免疫增強劑含有5ng～10mg/mL的聚肌胞、10ng～10mg/mL的胞壁酰二肽、10ng～5mg/mL的左旋咪唑、10ng～5mg/mL的雷西莫特和10ng～5mg/mL咪喹莫特。本免疫增強劑與H5亞型禽流感滅活疫苗混合，可使提前1周產生抗體，抗體效價提高1.8log2以上。含有以上復方疫苗免疫增強劑的H5亞型禽流感疫苗、H9亞型禽流感疫苗或傳染性支氣管炎疫苗免疫雞后，均可縮短抗體產生的窗口期，提高疫苗的抗體效價，免疫持續(xù)期延長，降低感染發(fā)病的幾率。
文檔編號A61K39/39GK102743750SQ20121023542
公開日2012年10月24日 申請日期2012年7月9日 優(yōu)先權日2012年7月9日
發(fā)明者侯繼波, 劉振興, 吳培培, 唐應華, 李蘭, 楊維維, 田震, 陸吉虎 申請人:江蘇省農業(yè)科學院