專利名稱：用于診斷和治療癌癥的組合物和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及腫瘤學(xué)領(lǐng)域并提供了用于診斷和治療癌癥的新型組合物和方法。本發(fā)明提供了用于診斷和治療實(shí)體瘤的抗癌干細(xì)胞標(biāo)記物的抗體。
背景技術(shù)：
癌癥是發(fā)達(dá)世界中死亡的主要原因之一，僅在美國(guó)，每年有超過一百萬(wàn)人診斷患有癌癥，并且有500，000人死亡?？傮w而言，據(jù)估計(jì)在3人當(dāng)中就有不止I人在他們的一生當(dāng)中會(huì)患上某些形式的癌癥。癌癥有超過200種不同的類型，其中的四種-乳癌、肺癌、結(jié) 腸直腸癌和前列腺癌一超過所有新發(fā)現(xiàn)病例的一半(Jemal等，2003，Cancer J. Clin. 53 5 26)。乳癌是女性中最常見的癌癥，據(jù)估計(jì)，有12%的女性在她們的一生中存在患上該疾病的風(fēng)險(xiǎn)。盡管由于檢查的提早和治療的改善，死亡率已得到降低，但是乳癌仍然是中年女性死亡的主要原因，并且轉(zhuǎn)移乳癌依然是不可治愈的疾病。患有轉(zhuǎn)移乳癌的大部分患者在顯現(xiàn)時(shí)只有一個(gè)或兩個(gè)器官系統(tǒng)受到影響，但是隨著疾病的發(fā)展，常常會(huì)使多個(gè)部位受累。轉(zhuǎn)移受累的最常見部位是胸腔壁的皮膚和軟組織以及腋窩和鎖骨上區(qū)域中的局部復(fù)發(fā)。遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移的最常見的部位是骨(遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移的30% 40%)，其次是肺和肝。而且，盡管只有約1% 5%的剛診斷患有乳癌的女性在診斷時(shí)具有遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移，但是約有50%的患有局部疾病的患者最終在5年內(nèi)都出現(xiàn)轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)。目前，遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移顯現(xiàn)的中位存活為約3年。目前對(duì)乳癌進(jìn)行診斷和分期的方法包括腫瘤結(jié)節(jié)轉(zhuǎn)移(TNM)體系，該體系依賴于腫瘤尺寸、淋巴結(jié)中腫瘤的存在和遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移的存在(American Joint Committeeon Cancer AJCC Cancer Staging Manual.Philadelphia, Pa. Lippincott-RavenPublishers,第 5 版，1997,第 171 180 頁(yè)；Harris, JR :“Staging of breast carcinoma”于 Harris, J. R. , Heilman, S. , Henderson, I. C. , Kinne D. W (編)Breast Diseases.Philadelphia, Lippincott, 1991)。這些參數(shù)用以提供預(yù)后和選擇適當(dāng)?shù)寞煼?。還可以對(duì)腫瘤的形態(tài)外觀進(jìn)行評(píng)價(jià)，但是由于具有相似的組織病理學(xué)外觀的腫瘤能夠表現(xiàn)出明顯的臨床變化性，因此這種方法具有嚴(yán)重的局限性。最后，細(xì)胞表面標(biāo)記物的測(cè)定可用以將某些腫瘤類型分為各亞類。例如，在乳癌的預(yù)后和治療中考慮的一個(gè)因素是雌激素受體(ER)的存在，因?yàn)镋R陽(yáng)性乳癌通常比ER陰性腫瘤更容易對(duì)諸如三苯氧胺或芳香酶抑制劑等激素療法作出應(yīng)答。這些分析盡管有用，但是只能部分地預(yù)測(cè)乳腺腫瘤的臨床行為，并且在目前診斷工具無(wú)法檢測(cè)并且目前療法無(wú)法治療的乳癌中還存在大量的表型多樣性。前列腺癌是發(fā)達(dá)世界的男性中最為常見的癌癥，在美國(guó)所有新發(fā)現(xiàn)的癌癥病例中估計(jì)占33%，是頻率次高的死亡原因(Jemal等，2003，CA Cancer J. Clin. 53 :5 26)。由于前列腺特異性抗原(PSA)血液測(cè)試的引入，前列腺癌的早期檢測(cè)顯著提高了存活率；診斷時(shí)患有局部區(qū)域性階段前列腺癌的患者的5年存活率接近100%。但是仍有超過50%的患者最終將發(fā)展為局部晚期疾病或轉(zhuǎn)移疾病(Muthuramalingam等，2004，Clin. Oncol. 16 505 16)。目前，根治性前列腺切除術(shù)和放射療法為大部分的局部化的前列腺腫瘤提供了治愈性治療。然而對(duì)于晚期病例，可選擇的治療方案非常有限。對(duì)于轉(zhuǎn)移疾病，單獨(dú)使用黃體生成素釋放激素(LHRH)激動(dòng)藥或者結(jié)合使用黃體生成素釋放激素(LHRH)激動(dòng)藥與抗雄激素的雄激素阻斷是標(biāo)準(zhǔn)治療。盡管使雄激素得到最大程度的阻斷，但是疾病病情幾乎總還是發(fā)展，大部分逐漸形成雄激素非依賴性疾病。目前對(duì)激素難以醫(yī)治的前列腺癌還沒有普遍接受的治療，并且常用的是化學(xué)療法(Muthuramalingam等,2004, Clin. Oncol. 16 :505 16 ；Tro jan 等，2005, AnticancerRes. 25 :551 61)。結(jié)腸直腸癌在世界范圍內(nèi)是第3位最常見癌癥，并且是第4位頻率最高的癌癥死亡原因(Weitz等，2005，Lancet 365 :153 65)。所有結(jié)腸直腸癌中約有5% 10%是遺傳的，其主要形式之一是家族性腺瘤性息肉病(FAP)，該家族性腺瘤性息肉病是常染色體顯性 疾病，其中有約80%的受影響個(gè)體在結(jié)腸腺瘤性息肉病(APC)基因中含有種系突變。結(jié)腸直腸癌通過周向生長(zhǎng)而局部侵入，在其他位置則通過淋巴擴(kuò)散、血行擴(kuò)散、跨腹膜擴(kuò)散和周圍神經(jīng)擴(kuò)散來侵入。淋巴外受累的最常見部位是肝，腹部外器官受影響的頻率最高的是肺。血行擴(kuò)散的其他部位包括骨、腎、腎上腺和腦。結(jié)腸直腸癌的現(xiàn)有分期體系基于腫瘤穿過腸壁的程度以及結(jié)節(jié)受累的有無(wú)。這種分期體系被限定為3個(gè)主要的Duke分級(jí)=DukeA級(jí)疾病限制于結(jié)腸或直腸的黏膜下層；Duke B級(jí)疾病具有侵入穿過固有肌層并可能穿過結(jié)腸或直腸壁的腫瘤；Duke C級(jí)疾病包括任何程度的帶有區(qū)域性淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的腸壁侵入。雖然對(duì)于結(jié)腸直腸癌來說手術(shù)切除術(shù)是非常有效的，在Duke A級(jí)患者中提供95%的治愈率,但是在Duke B級(jí)患者中該比率下降到75%，在Duke C級(jí)疾病中陽(yáng)性淋巴結(jié)的存在預(yù)示在5年內(nèi)復(fù)發(fā)可能性為60%。采用化學(xué)療法的術(shù)后療程對(duì)Duke C級(jí)患者進(jìn)行治療可將復(fù)發(fā)率降低至40% 50%，這是目前這些患者的護(hù)理標(biāo)準(zhǔn)。肺癌是世界上最常見的癌癥，在美國(guó)是所診斷到的癌癥中第三大最常見的癌癥，是迄今為止頻率最高的癌癥死亡原因(Spiro等，2002, Am. J. Respir. Crit. Care Med. 166 1166 96 Jemal等，2003，CA Cancer J. Clin. 53 :5 26)。據(jù)認(rèn)為，吸煙造成的肺癌占所有肺癌的比例估計(jì)有87%，使得肺癌成為最致命的可預(yù)防疾病。肺癌分為兩種主要類型小細(xì)胞肺癌(SCLC)和非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)，這兩種類型肺癌占所有肺癌的比例超過90%。SCLC病例占15% 20%，其特征在于，這類肺癌根源于大的中心氣道和組織學(xué)組成為幾近沒有細(xì)胞質(zhì)的小細(xì)胞的片層。SCLC比NSCLC更具有侵襲性，并且生長(zhǎng)快、轉(zhuǎn)移早。NSCLC占所有病例的80% 85%，并基于組織學(xué)而進(jìn)一步分為3個(gè)主要亞型腺癌、鱗狀細(xì)胞癌(表皮樣癌)和大細(xì)胞未分化癌。肺癌通常在其病程中顯現(xiàn)較晚，因此診斷后的中位存活率只有6 12個(gè)月，總5年存活率僅有5% 10%。雖然手術(shù)提供了治愈的最好機(jī)會(huì)，但是只有少部分患者適合手術(shù)，大部分依賴于化學(xué)療法和放射療法。盡管嘗試控制這些療法的時(shí)機(jī)和劑量強(qiáng)度，但是在過去 15年中存活率幾乎沒有提高(Spiro 等，2002，Am. J. Respir. Crit. Care Med. 166 :1166 96)。這四種癌癥以及其他癌癥表現(xiàn)為由異源性細(xì)胞群組成的實(shí)體瘤。例如，乳癌是癌細(xì)胞和正常細(xì)胞(包括間質(zhì)(基質(zhì))細(xì)胞、炎性細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞)的混合體。癌癥的數(shù)種模型為這種異源性的存在提供了不同的解釋。一種模型(癌癥的經(jīng)典模型)認(rèn)為表型明顯不同的癌細(xì)胞群都具有增殖和形成新腫瘤的能力。在該經(jīng)典模型中，腫瘤細(xì)胞異源性源自于環(huán)境因子以及癌細(xì)胞內(nèi)正在發(fā)生的突變，從而形成多樣的致癌細(xì)胞群。這一模型基于這樣的觀點(diǎn)，即，腫瘤細(xì)胞的所有群體都具有某種程度的致癌潛能(Pandis等，1998，Genes,Chromosomes & Cancer 12 :122 129 ;Kuukas jrvi 等，1997, Cancer Res. 57 :1597 1604;Bonsing 等，1993, Cancer 71 :382 391 ;Bonsing 等，2000, Genes Chromosomes & Cancer82 :173 183 ;Beerman H 等，1991, Cytometry 12 :147 54 ;Aubele M和 Werner M, 1999,Analyt. Cell. Path. 19 :53 ；Shen L 等，2000，Cancer Res. 60 :3884)。所觀測(cè)到的實(shí)體瘤細(xì)胞異源性的一種替代性模型源自于干細(xì)胞對(duì)腫瘤發(fā)展的影響。根據(jù)該模型，癌癥起因于控制正常組織發(fā)育和維持的機(jī)制的失調(diào)(Beachy等，2004，Nature 432:324)。在正常動(dòng)物的發(fā)育過程中，絕大部分或所有組織的細(xì)胞都來自于正常 前體，即所謂的干細(xì)胞(Morrison 等，1997, Cell 88 :287 98 ；Morrison 等，1997, Curr.Opin. Tmmun01 9 216 21 ；Morrison 等，1995, Annu. Rev. Cell. Dev. Biol. 11 :35 71)。干細(xì)胞是這樣的細(xì)胞(1)具有廣泛的增殖能力；(2)能夠非對(duì)稱性細(xì)胞分裂以生成一種或多種增殖潛力和/或發(fā)育潛力下降的子代；和(3)能夠進(jìn)行對(duì)稱性細(xì)胞分裂而自我再生或自我維持。通過干細(xì)胞分化實(shí)現(xiàn)成體細(xì)胞再生的最佳研究例子是造血系統(tǒng)，其中發(fā)育未成熟的前體(造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞)響應(yīng)分子信號(hào)而形成各種血細(xì)胞和淋巴樣細(xì)胞類型。其他細(xì)胞(包括內(nèi)臟、乳管系統(tǒng)和皮膚的細(xì)胞)從各自組織的小群體干細(xì)胞得到持續(xù)的補(bǔ)充，最近研究認(rèn)為，絕大多數(shù)其他成體組織(包括腦)同樣存在干細(xì)胞。源自于“實(shí)體瘤干細(xì)胞”(或來自于實(shí)體瘤的“癌干細(xì)胞”)的腫瘤隨后通過對(duì)稱性和非對(duì)稱性細(xì)胞分裂過程而經(jīng)歷無(wú)序的發(fā)育。在該干細(xì)胞模型中，實(shí)體瘤含有明顯不同且有限的(甚至可能是稀有的)具有正?！案杉?xì)胞”性質(zhì)的細(xì)胞亞組，原因在于它們廣泛增殖并有效地形成另外的實(shí)體瘤干細(xì)胞(自我再生)和形成實(shí)體瘤的缺乏致瘤潛能的大部分瘤細(xì)胞。實(shí)際上，長(zhǎng)壽干細(xì)胞群中的突變可以引發(fā)癌干細(xì)胞的形成，癌干細(xì)胞成為腫瘤生長(zhǎng)和維持的基礎(chǔ)，并且癌干細(xì)胞的存在促成當(dāng)前治療方法的失敗。癌癥的干細(xì)胞性質(zhì)首先在血癌(急性髓系白血病(AML))中得到揭示(Lapidot等，1994, Nature 17 :645 8)。新近，已證明惡性人乳腺腫瘤也類似地具有小而明顯不同的癌干細(xì)胞群，其被富集而能夠在免疫缺陷小鼠中形成腫瘤。已發(fā)現(xiàn)，與未分級(jí)腫瘤細(xì)胞相比，致瘤性細(xì)胞的ESA+、CD44+、CD24-/低、Lin-細(xì)胞群被富集50倍(Al-Hajj等，2003，Proc. Naf I Acad. Sci. 100 :3983 8)。有望分離致瘤性癌細(xì)胞的能力使得可以研究成為這些細(xì)胞中的致瘤性的基礎(chǔ)的關(guān)鍵生理學(xué)途徑，因此有望為癌癥患者研發(fā)出更好的診斷測(cè)定和治療。這正是本發(fā)明所針對(duì)的目的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種分離的單克隆抗體，所述單克隆抗體特異性結(jié)合人類FZD8受體的胞外域，并抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。本發(fā)明還提供了一種分離的抗體，所述抗體特異性結(jié)合兩種以上的人類FZD受體的胞外域，并抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。本發(fā)明進(jìn)一步提供了一種藥物組合物，該藥物組合物包含本發(fā)明所公開的抗體和藥學(xué)可接受的載質(zhì)(vehicle)。本發(fā)明另外還提供了一種治療癌癥的方法，所述方法包括施用抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)有效量的本發(fā)明所公開的抗體。本發(fā)明的另外的目的和優(yōu)點(diǎn)，一部分將在隨后說明中給出，一部分根據(jù)所述說明也得以明了或者通過本發(fā)明的實(shí)踐而獲悉。本發(fā)明的目的和優(yōu)點(diǎn)將借助所附權(quán)利要求書中指出的要素和要素組合來實(shí)現(xiàn)和達(dá)到。應(yīng)當(dāng)理解的是，上文的概述和下文的詳細(xì)說明只是用于例示和解釋，而不是用于限制所要求保護(hù)的發(fā)明。合并在本說明書中或者構(gòu)成本說明書的一部分的附圖示出了本發(fā)明的多個(gè)實(shí)施方式，其與所述說明一起用以解釋本發(fā)明的原理。在本說明書和所附權(quán)利要求書中，單數(shù)形式的“一個(gè)”、“一種”或“所述”，除非上下文另有明確說明，否則包括復(fù)數(shù)形式所指對(duì)象。


圖I :抗FZD10、抗FZD7、抗FZD5、抗FZD6、抗FZD4和抗FZD8抗體與它們相應(yīng)的膜連受體的特異性結(jié)合的分析。沒有與GFP共轉(zhuǎn)染(A)或與GFP共轉(zhuǎn)染(B、C、D、E和F)的表達(dá)全長(zhǎng)FZD10、FZD7、FZD5、FZD6、FZD4和FZD8的HEK293細(xì)胞與抗FZD抗體或?qū)φ誌gG溫育并通過FACS分選。(A)顯示了對(duì)于各抗體來說，抗FZDlO的抗體與IgG同種型陰性對(duì)照的FACs比較分析。與抗FLAG抗體匹配的帶FLAG標(biāo)簽的構(gòu)建體顯示為陽(yáng)性對(duì)照(底圖)。(B)與對(duì)照IgG進(jìn)行比較，表達(dá)FZD7和GFP的細(xì)胞中的抗FZD7的抗體的FACs分析。與抗FLAG抗體匹配的帶FLAG標(biāo)簽的構(gòu)建體顯示為陽(yáng)性對(duì)照(底圖，最右邊)。(C)與對(duì)照IgG進(jìn)行比較，表達(dá)FZD5和GFP的細(xì)胞中的抗FZD5的抗體的FACs分析。來自經(jīng)FZD5抗原免疫動(dòng)物的血清顯示在右邊底圖。(D)與對(duì)照IgG進(jìn)行比較，表達(dá)FZD6和GFP的細(xì)胞中的抗FZD6的抗體的FACs分析。與抗FLAG抗體匹配的帶FLAG標(biāo)簽的構(gòu)建體顯示為陽(yáng)性對(duì)照(底圖，右邊)。(E)與對(duì)照IgG進(jìn)行比較，表達(dá)FZD4和GFP的細(xì)胞中的抗FZD4的抗體的FACs分析。與抗FLAG抗體匹配的帶FLAG標(biāo)簽的構(gòu)建體顯示為陽(yáng)性對(duì)照(底圖，右邊)。(F)表達(dá)FZD8和GFP的細(xì)胞中的抗FZD8抗體的FACs分析。圖2 =FZD Fe可溶性受體抑制了 Wnt的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。在不同Wnt配體(包括Wntl、Wnt2、Wnt3、Wnt3a和Wnt7b)的存在下，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染有8xTCF_熒光素酶報(bào)告基因的HEK 293細(xì)胞與濃度不斷增加的FZD Fe可溶性受體溫育。根據(jù)熒光素酶活性喪失所示，F(xiàn)ZD4Fc、FZD5Fc和FZD8Fc融合蛋白抑制了由所有5個(gè)Wnt配體介導(dǎo)的Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。圖3 :干擾Wnt3a配體結(jié)合的抗FZD5抗體的鑒定。根據(jù)熒光素酶活性，測(cè)量在Wnt3a和32個(gè)不同的抗FZD5抗體存在(單獨(dú)存在(左側(cè)條)或在可溶性FZD5Fc的存在下(右側(cè)條))下，轉(zhuǎn)染有fct 8xTCF-熒光素酶報(bào)告基因載體的HEK 293細(xì)胞中的Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。干擾FZD5FC和Wnt3a之間的結(jié)合的抗體導(dǎo)致Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的顯著激活(右側(cè)條)。圖4 :抗FZD6和抗FZD5的抗體減緩了腫瘤生長(zhǎng)。注射有UM-C4結(jié)腸腫瘤細(xì)胞并經(jīng)抗FZD6或抗FZD5的抗體處理的N0D/SCID小鼠中8周內(nèi)的腫瘤生長(zhǎng)(mm3)作圖在x軸上。用抗FZD6抗體23M2 (空白條)和抗FZD5抗體44M13 (斜紋條)處理相對(duì)于PBS注射對(duì)照(黑色條)，顯著減緩了腫瘤的生長(zhǎng)。
具體實(shí)施例方式
術(shù)語(yǔ)“抗體”用以指這樣的免疫球蛋白分子，即能夠通過該免疫球蛋白分子可變區(qū)內(nèi)的至少一個(gè)抗原識(shí)別位點(diǎn)識(shí)別并特異性結(jié)合諸如蛋白、多肽、肽、碳水化合物、多核苷酸、脂質(zhì)或前述物質(zhì)的組合等靶的免疫球蛋白分子。在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明的抗體包括拮抗劑抗體，該拮抗劑抗體與癌干細(xì)胞標(biāo)記物蛋白特異性結(jié)合并干擾例如配體結(jié)合、受體二聚化、癌干細(xì)胞標(biāo)記物蛋白的表達(dá)和/或癌干細(xì)胞標(biāo)記物蛋白的下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。在某些實(shí)施方式中，所公開的抗體包括激動(dòng)劑抗體，該激動(dòng)劑抗體與癌干細(xì)胞標(biāo)記物蛋白特異性結(jié)合并促進(jìn)例如配體結(jié)合、受體二聚化和/或通過癌干細(xì)胞標(biāo)記物蛋白進(jìn)行的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。在某些實(shí)施方式中，所公開的抗體不干擾或促進(jìn)癌干細(xì)胞標(biāo)記物蛋白的生物活性，但是通過例如抗體內(nèi)化和/或由免疫系統(tǒng)識(shí)別來抑制腫瘤生長(zhǎng)。本文所使用的術(shù)語(yǔ)“抗體”涵蓋完整的多克隆抗體、完整的單克隆抗體、抗體片段(例如Fab、Fab'、F(ab' )2和Fv片段)、單鏈Fv(ScFv)突變體、多特異性抗體(如由至少兩個(gè)完整抗體生成的雙特異性抗體)、嵌合抗體、人源化抗體、人類抗體、包含抗體的抗原決定部分的融合蛋白和其他任何包含抗原識(shí)別位點(diǎn)的經(jīng)修飾的免疫球蛋白分子，只要所述抗體顯示出所需的生物活性即可。抗體可以屬于免疫球蛋白的5種主要類別(即IgA、IgD、IgE、IgG和IgM)中的任意一種類別或其亞 類(同種型)(例如IgGU IgG2、IgG3、IgG4、IgAl和IgA2)，根據(jù)它們的重鏈恒定區(qū)的性質(zhì)分別稱為a、S、e、Y和ii。不同類別的免疫球蛋白具有不同的公知的亞基結(jié)構(gòu)和三維構(gòu)型?？贵w可以是裸露的或者與諸如毒素、放射性同位素等其他分子偶聯(lián)。在此所用的“抗體片段”是指完整抗體的一部分，還指完整抗體的抗原決定可變區(qū)?？贵w片段的例子包括但不限于Fab、Fab'、F(ab' ) 2和Fv片段、線性抗體、單鏈抗體和由抗體片段形成的多特異性抗體。“Fv抗體”是指含有完全抗原識(shí)別和抗原結(jié)合位點(diǎn)的最小抗體片段，其可以是其中一條重鏈和一條輕鏈可變區(qū)形成非共價(jià)二聚體的雙鏈，也可以是其中一條重鏈和一條輕鏈可變區(qū)通過柔性肽接頭共價(jià)連接從而使所述兩條鏈以類似二聚體結(jié)構(gòu)聯(lián)合的單鏈(scFv)。在這種構(gòu)型中，各可變區(qū)的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)相互作用來限定該Fv 二聚體的抗原結(jié)合特異性。作為選擇，單個(gè)可變區(qū)(或者Fv的一半)可以用來識(shí)別和結(jié)合抗原，不過親和性通常較低。本文所用的“單克隆抗體”是指具有高度特異性識(shí)別和單抗原決定簇或表位結(jié)合的同源抗體群。這與多克隆抗體相反，多克隆抗體通常包括針對(duì)抗不同抗原決定簇的不同抗體。術(shù)語(yǔ)“單克隆抗體”涵蓋完整和全長(zhǎng)單克隆抗體以及抗體片段(例如Fab、Fab'、F(ab/ )2和Fv)、單鏈Fv(ScFv)突變體、包含抗體部分的融合蛋白和其他任何包含抗原識(shí)別位點(diǎn)的修飾免疫球蛋白分子。此外，“單克隆抗體”還指通過任意種方式制得的抗體，所述方式包括但不限于雜交瘤、噬菌體選擇、重組表達(dá)和轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。本文所用的術(shù)語(yǔ)“人源化抗體”是指作為含有最少的非人序列的特異性免疫球蛋白鏈、嵌合免疫球蛋白或其片段的各種形式的非人(例如鼠類)抗體。通常，人源化抗體是這樣的人類免疫球蛋白，其中來自互補(bǔ)性決定區(qū)(CDR)的殘基被來自非人物種(例如小鼠、大鼠、兔、倉(cāng)鼠)的具有所需特異性、親和性和能力的來自⑶R的殘基所置換。在一些情況中，人類免疫球蛋白的Fv骨架區(qū)(FR)殘基被來自非人物種的抗體中具有所需特異性、親和性和能力的相應(yīng)殘基所置換。人源化抗體還可以通過Fv骨架區(qū)中和/或所置換的非人類殘基內(nèi)的額外殘基取代進(jìn)行進(jìn)一步的修飾，以改進(jìn)和優(yōu)化抗體特異性、親和性和/或能力。人源化抗體通常包含至少一個(gè)(通常為兩個(gè)或三個(gè))可變區(qū)的幾乎全部，所述可變區(qū)包含所有或幾乎所有與非人類免疫球蛋白對(duì)應(yīng)的CDR區(qū)，而所有或幾乎所有的FR區(qū)是人類免疫球蛋白共有序列的FR區(qū)。人源化抗體還包含免疫球蛋白恒定區(qū)或域(Fe)的至少一部分，通常包含的是人類免疫球蛋白的至少一部分。用以生成人源化抗體的方法的例子在美國(guó)專利5，225，539中有描述。本文所用的術(shù)語(yǔ)“人類抗體”是指由人類產(chǎn)生的抗體或采用本領(lǐng)域已知的任何技術(shù)制得的具有與由人類產(chǎn)生的抗體相對(duì)應(yīng)的氨基酸序列的抗體。人類抗體的定義包括完整或全長(zhǎng)抗體、該抗體的片段和/或包含至少一條人類重鏈和/或輕鏈多肽的抗體，例如包含鼠類輕鏈多肽和人類重鏈多肽的抗體。
“雜交抗體”是這樣的免疫球蛋白分子，其中將來自具有不同抗原決定簇區(qū)域的抗體的重鏈輕鏈對(duì)組裝在一起，使得兩種不同的表位或兩種不同的抗原能夠?yàn)樗纬傻乃木垠w所識(shí)別和結(jié)合。術(shù)語(yǔ)“嵌合抗體”是指這樣的抗體，其中免疫球蛋白分子的氨基酸序列來自兩種以上物種。通常，輕鏈和重鏈這兩者的可變區(qū)對(duì)應(yīng)于來自于哺乳動(dòng)物的一個(gè)物種(例如小鼠、大鼠、兔等)的具有所需特異性、親和性和能力的抗體的可變區(qū)，但是恒定區(qū)與來自于另一種物種(通常為人類)的抗體中的序列同源，以避免在那個(gè)物種中引發(fā)免疫應(yīng)答。術(shù)語(yǔ)“表位”或“抗原決定簇”在本文中可相互交換使用，是指抗原的能夠被特定抗體識(shí)別和特異性結(jié)合的部分。當(dāng)抗原是多肽時(shí)，表位既可以由相鄰氨基酸形成，也可以由經(jīng)蛋白的三級(jí)折疊而并置的非相鄰氨基酸形成。由相鄰氨基酸形成的表位在蛋白變性時(shí)通常仍得以保持，而由三級(jí)折疊形成的表位在蛋白變性時(shí)通常會(huì)喪失。表位通常包括至少3個(gè)(更多情況下常常為至少5個(gè)或8個(gè) 10個(gè))處于獨(dú)特空間構(gòu)型中的氨基酸。抗體“選擇性結(jié)合”或“特異性結(jié)合”是指抗體更頻繁地、更迅速地、更持久地、親和性更強(qiáng)地或者以上的某些組合而與表位反應(yīng)或聯(lián)合(相比于與包括不相關(guān)的蛋白在內(nèi)的替代性物質(zhì)的反應(yīng)或聯(lián)合相比)?！斑x擇性結(jié)合”或者“特異性結(jié)合”是指例如抗體以至少約0. ImM，但是更常見的是至少約I i! M的KD與蛋白結(jié)合。“選擇性結(jié)合”或者“特異性結(jié)合”有時(shí)是指抗體有時(shí)以至少約0. I ii M的KD或者更佳的KD與蛋白結(jié)合，在其它時(shí)候是指以至少約0. 01 ii M的KD或者更佳的KD與蛋白結(jié)合。由于不同物種中的同源蛋白之間的序列同一性，特異性結(jié)合可以包括識(shí)別不止一種物種中的癌干細(xì)胞標(biāo)記物蛋白的抗體的特異性結(jié)合。本文所用的術(shù)語(yǔ)“非特異性結(jié)合”和“背景結(jié)合”當(dāng)在涉及抗體和蛋白或肽的相互作用中使用時(shí)是指不依賴于特定結(jié)構(gòu)的存在的相互作用(即，抗體普遍與蛋白結(jié)合，而不是與特定的結(jié)構(gòu)如表位結(jié)合)。術(shù)語(yǔ)“分離的”或“純化的”是指材料基本上或?qū)嵸|(zhì)上不含有天然狀態(tài)中與該材料通常相伴的成分。純度和均質(zhì)性通常采用諸如聚丙烯酰胺凝膠電泳或高效液相色譜等分析化學(xué)技術(shù)來確定。本發(fā)明所公開的在制劑中所存在的主要物種種類的蛋白(例如抗體)或核酸經(jīng)過了充分的純化。特別是，分離的核酸與開放閱讀框分開，該開放閱讀框天然位于該基因的側(cè)翼并編碼不同于該基因所編碼的蛋白的蛋白。分離的抗體與其他非免疫球蛋白分開，并與具有不同的抗原結(jié)合特異性的免疫球蛋白分開。所述術(shù)語(yǔ)還指核酸或蛋白在一些實(shí)施方式中具有至少80%的純度，在一些實(shí)施方式中具有至少85%的純度，在一些實(shí)施方式中具有至少90%的純度，在一些實(shí)施方式中具有至少95%的純度，而在一些實(shí)施方式中具有至少99%的純度。本文所用的術(shù)語(yǔ)“癌癥”和“癌”是指或描述其中細(xì)胞群具有細(xì)胞生長(zhǎng)失調(diào)特征的哺乳動(dòng)物的生理狀態(tài)。癌癥的例子包括但不限于癌、淋巴瘤、胚細(xì)胞瘤、肉瘤和白血病。這樣的癌癥的更具體的例子包括鱗狀細(xì)胞癌、小細(xì)胞肺癌、非小細(xì)胞肺癌、肺部的腺癌、肺部的鱗狀癌、腹膜癌、肝細(xì)胞癌、胃腸癌、胰腺癌、成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、子宮頸癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝細(xì)胞瘤、乳癌、結(jié)腸癌、結(jié)腸直腸癌、子宮內(nèi)膜癌或子宮癌、唾液腺癌、腎癌、肝癌、前列腺癌、外陰癌、甲狀腺癌、肝細(xì)胞癌和各種類型的頭頸部癌癥。本文所用的“增殖病癥”和“增殖疾病”是指與諸如癌癥等異常細(xì)胞增殖有關(guān)的病癥。本文所用的“腫瘤”和“瘤”是指由細(xì)胞過度生長(zhǎng)或增殖引起的任何組織塊，其為 良性(非癌性)或惡性(癌性，包括癌前病變)。本文所用的“轉(zhuǎn)移”是指癌癥播散或者從原初部位轉(zhuǎn)移到身體的其他區(qū)域且在該新的位置發(fā)展有類似癌性病變的過程。“轉(zhuǎn)移性”或“轉(zhuǎn)移”細(xì)胞是失去與相鄰細(xì)胞的粘附接觸并通過血流或淋巴從最初患病部位轉(zhuǎn)移而侵入相鄰身體結(jié)構(gòu)的細(xì)胞。術(shù)語(yǔ)“癌干細(xì)胞”、“腫瘤干細(xì)胞”或“實(shí)體瘤干細(xì)胞”在本文中可以相互交換使用，并指來自實(shí)體瘤的這樣細(xì)胞群(I)具有廣泛的增殖能力；(2)能夠進(jìn)行非對(duì)稱性細(xì)胞分裂，生成一種或多種增殖潛力或發(fā)育潛力下降的分化子代；和(3)能夠進(jìn)行對(duì)稱性細(xì)胞分裂而自我再生或自我維持。“癌干細(xì)胞”、“腫瘤干細(xì)胞”或“實(shí)體瘤干細(xì)胞”的這些性質(zhì)使得這些癌干細(xì)胞具有在連續(xù)移植到免疫受損的小鼠后形成可觸診的腫瘤(與不能形成腫瘤的大多數(shù)腫瘤細(xì)胞相比)的能力。癌干細(xì)胞經(jīng)歷無(wú)序方式的自我再生與分化，從而形成帶有因發(fā)生突變而能夠隨時(shí)間而變化的異常細(xì)胞類型的腫瘤。根據(jù)美國(guó)專利No. 6，004, 528所提出的，實(shí)體瘤干細(xì)胞不同于“癌干系”。在該專利中，“癌干系”被定義為緩慢生長(zhǎng)的祖細(xì)胞類型，其自身很少發(fā)生突變，而且由于在細(xì)胞環(huán)境內(nèi)出現(xiàn)致瘤性變化的原因而進(jìn)行對(duì)稱性細(xì)胞分裂而不是非對(duì)稱性細(xì)胞分裂。所述“癌干系”假說因而提出，作為異常環(huán)境的結(jié)果，大量出現(xiàn)高度突變的快速增殖的腫瘤細(xì)胞，從而導(dǎo)致相對(duì)正常的干細(xì)胞積累然后發(fā)生突變，這導(dǎo)致這些細(xì)胞變成腫瘤細(xì)胞。美國(guó)專利No. 6，004, 528提出，這種模型可用以促進(jìn)癌癥的診斷。實(shí)體瘤干細(xì)胞模型根本不同于“癌干系”模型，結(jié)果展示出“癌干系”模型所不能提供的應(yīng)用。第一，實(shí)體瘤干細(xì)胞不是“突變?nèi)狈Φ摹?。美?guó)專利No. 6，004，528所述的“突變?nèi)狈Φ陌└上怠笨梢哉J(rèn)為是癌前病變，而實(shí)體瘤干細(xì)胞是本身含有從癌前階段到整個(gè)后期階段癌癥的造成致瘤性的突變的癌細(xì)胞。即，實(shí)體瘤干細(xì)胞(“癌干細(xì)胞”)應(yīng)當(dāng)包含在與美國(guó)專利No. 6，004, 528所述的“癌干系”明顯不同的高度突變的細(xì)胞中。第二，導(dǎo)致癌癥的基因突變本質(zhì)上明顯屬于實(shí)體瘤干細(xì)胞并且受到環(huán)境的影響。實(shí)體瘤干細(xì)胞模型預(yù)測(cè)，分離的實(shí)體瘤干細(xì)胞在移植時(shí)能夠形成另外的腫瘤(由此可以解釋轉(zhuǎn)移)，而“癌干系”模型預(yù)測(cè)，經(jīng)移植的“癌干系”細(xì)胞不能形成新的腫瘤，這是正是因?yàn)樗鼈兊漠惓－h(huán)境是致瘤性的。實(shí)際上，解離的表型分離的人類實(shí)體瘤干細(xì)胞移植到小鼠(進(jìn)入到與正常腫瘤環(huán)境非常不同的環(huán)境)中仍能形成新的腫瘤的能力使本發(fā)明明顯區(qū)別于“癌干系”模型。第三，實(shí)體瘤干細(xì)胞很可能同時(shí)進(jìn)行對(duì)稱性細(xì)胞分裂和非對(duì)稱性細(xì)胞分裂，使得對(duì)稱細(xì)胞分裂并不是必有的性質(zhì)。第四，實(shí)體瘤干細(xì)胞能夠快速或緩慢分裂，這取決于很多變數(shù)，因此緩慢增殖速度并不是確有的特性。術(shù)語(yǔ)“癌細(xì)胞”、“腫瘤細(xì)胞”以及文法上的等同表述是指衍生自腫瘤或癌前病變(包括非致瘤性細(xì)胞)的細(xì)胞總?cè)海浒蠖鄶?shù)腫瘤細(xì)胞群和致瘤性干細(xì)胞(癌干細(xì)胞)。本文所用的“致瘤性”是指實(shí)體瘤干細(xì)胞的功能特征，包括自我再生性(形成另外的致瘤性癌干細(xì)胞)和生成所有其他腫瘤細(xì)胞(發(fā)生分化并因此形成非致瘤性腫瘤細(xì)胞)從而使實(shí)體瘤干細(xì)胞形成腫瘤的增殖性。自我再生性和生成所有其他腫瘤細(xì)胞的增殖性的這些性質(zhì)使本發(fā)明的癌干細(xì)胞具有在連續(xù)移植到免疫受損的小鼠后形成可觸診的腫瘤(與連續(xù)移植后不能形成腫瘤的大多數(shù)腫瘤細(xì)胞相比)。腫瘤細(xì)胞，即非致瘤性腫瘤細(xì)胞，在從實(shí)體瘤獲得腫瘤細(xì)胞后可在移植到免疫受損的小鼠后形成腫瘤有限次數(shù)(例如一次或兩次)。本文所用的術(shù)語(yǔ)“干細(xì)胞癌標(biāo)記物”、“癌干細(xì)胞標(biāo)記物”、“腫瘤干細(xì)胞標(biāo)記物”或“實(shí)體瘤干細(xì)胞標(biāo)記物”是指一條或多條基因、或者所述一條或多條基因所表達(dá)的蛋白、多 肽或肽，所述一條或多條基因的表達(dá)水平本身或與其他基因的組合與致瘤性癌細(xì)胞的存在相關(guān)聯(lián)(與非致瘤性細(xì)胞相比)。這種相關(guān)與所述基因表達(dá)的增加或減少有關(guān)(即所述基因的mRNA或所編碼的肽的增加的或減少的水平)。本文所用的術(shù)語(yǔ)“未分級(jí)的腫瘤細(xì)胞”、“分選前細(xì)胞”、“腫瘤細(xì)胞塊”及其文法上等同表述可以相互交換使用，是指分離自患者樣品(例如腫瘤活檢樣品或側(cè)腹流出物)還未根據(jù)細(xì)胞表面標(biāo)記物表達(dá)而分開或分級(jí)的腫瘤細(xì)胞群。本文所用的術(shù)語(yǔ)“非ESA+⑶44+腫瘤細(xì)胞”、“非ESA+44+”、“分選的非致瘤性腫瘤細(xì)胞”、“非致瘤性腫瘤細(xì)胞”、“非干細(xì)胞”、“腫瘤細(xì)胞”及其文法上等同表述可以相互交換使用，是指基于細(xì)胞表面標(biāo)記物表達(dá)而從中已分開或移取本發(fā)明癌干細(xì)胞的腫瘤群體。本文所用的術(shù)語(yǔ)“活檢樣品”或“活檢組織”是指取自受試對(duì)象的組織樣品或流體樣品以確定該樣品是否含有癌組織。在一些實(shí)施方式中，獲得活檢組織或流體是因?yàn)閼岩墒茉噷?duì)象患有癌癥，于是檢查所述活檢組織或流體是否存在癌癥。本文所用的術(shù)語(yǔ)“受試對(duì)象”是指任何動(dòng)物(例如哺乳動(dòng)物)，包括但不限于人類、非人類靈長(zhǎng)動(dòng)物和嚙齒動(dòng)物等，所述受試對(duì)象是特定處理的接受者。術(shù)語(yǔ)“受試對(duì)象”和“患者”在本文中提及人類受試對(duì)象時(shí)通?？梢韵嗷ソ粨Q使用?！八帉W(xué)可接受的”是指已由或可由聯(lián)邦管理機(jī)構(gòu)或州政府批準(zhǔn)或者列于美國(guó)藥典或其他受普遍認(rèn)可的藥典而用于動(dòng)物(包括人類)?！八帉W(xué)可接受的鹽”是指藥學(xué)可接受并且具有母體化合物的所需藥理學(xué)活性的化合物的鹽?！八帉W(xué)可接受的賦形劑、載體或佐藥”是指這樣的賦形劑、載體或佐藥，即可以與本發(fā)明所公開的至少一種抗體一起施用于受試對(duì)象、不破壞所述抗體的藥理學(xué)活性并且按足以輸送治療量的所述化合物的劑量施用時(shí)是無(wú)毒的?！八帉W(xué)可接受的載質(zhì)”是指與本發(fā)明所公開的至少一種抗體一起施用的稀釋劑、佐藥、賦形劑或載體?！扒八帯笔侵感枰隗w內(nèi)轉(zhuǎn)化生成治療有效化合物的該治療有效化合物的衍生物。前藥可以在被轉(zhuǎn)化為治療有效的母體化合物之后才具有藥學(xué)活性。術(shù)語(yǔ)“治療有效量”是指抗體、多肽、多核苷酸、有機(jī)小分子或其他藥物有效“治療”受試對(duì)象或哺乳動(dòng)物中的疾病或病癥的量。在癌癥的情況中，藥物的治療有效量可以減少癌細(xì)胞的 數(shù)量；減少腫瘤尺寸；抑制或阻止癌細(xì)胞浸潤(rùn)到周圍器官，包括例如癌散播到軟組織和骨中；抑制并阻止腫瘤轉(zhuǎn)移；抑制并阻止腫瘤生長(zhǎng)；一定程度上減輕一種或多種與癌癥有關(guān)的癥狀，減少發(fā)病率和死亡率；改善生命質(zhì)量；或這些效果的組合。達(dá)到藥物防止所存在的癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和/或殺死所存在的癌細(xì)胞的程度，其可以稱為抑制細(xì)胞和/或細(xì)胞毒性。本文所用的“提供診斷”或“診斷信息”是指可用于確定患者是否具有疾病或病狀和/或?qū)⒓膊』虿罘旨?jí)為表型類別或在疾病或病狀的預(yù)后或可能的治療(可以普通治療也可以是特定治療)反應(yīng)方面具有意義的任何類別的任何信息。類似地，診斷是指提供任何類型的診斷信息，包括但不限于受試對(duì)象是否可能具有病狀(例如腫瘤)、與腫瘤分級(jí)性質(zhì)有關(guān)的信息如高風(fēng)險(xiǎn)腫瘤或低風(fēng)險(xiǎn)腫瘤、與預(yù)后有關(guān)的信息和/或與可用于選擇適當(dāng)治療的信息。治療選擇可以包括特定化學(xué)治療劑或其他治療形式如手術(shù)或放射的選擇或者與是否停止或提供治療有關(guān)的選擇。本文所用的術(shù)語(yǔ)“提供預(yù)后”、“預(yù)后信息”或“預(yù)測(cè)信息”是指提供與癌癥(例如，通過本發(fā)明的診斷方法確定的)的存在對(duì)受試對(duì)象日后的健康(例如，預(yù)期發(fā)病或死亡，患上癌癥的可能性以及轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn))的影響有關(guān)的信息。術(shù)語(yǔ)如“進(jìn)行治療”或“治療”或“以治療”或“緩解”或“以緩解”同時(shí)指I)治愈、減慢、減輕所診斷病理病狀或病癥的癥狀和/或防止所診斷病理病狀或病癥的前進(jìn)的治療措施，和2)防止和/或減緩目標(biāo)病理病狀或病癥的發(fā)展的預(yù)防措施或防止措施。因此，需要治療的那些患者包括已經(jīng)具有病癥的那些患者；傾向具有病癥的那些患者；和病癥需要防止的那些患者；如果受試對(duì)象顯示出一種或多種以下效果則該患者根據(jù)本發(fā)明的方法成功地得到“治療”:癌細(xì)胞數(shù)量的減少或完全消失；腫瘤尺寸的減?。灰种苹虿辉俪霈F(xiàn)癌細(xì)胞在周圍器官的浸潤(rùn)，包括例如癌在軟組織和骨中的播散；抑制或不再發(fā)生腫瘤的轉(zhuǎn)移；抑制或不再出現(xiàn)腫瘤的生長(zhǎng)；減輕一種或多種與特定癌癥有關(guān)的癥狀；減少發(fā)病和死亡；改善生命質(zhì)量；或某些組合效果。本文所用的術(shù)語(yǔ)“多核苷酸”或“核酸”是指多個(gè)核苷酸單元(核糖核苷酸或脫氧核糖核苷酸或有關(guān)結(jié)構(gòu)變體)通過磷酸二酯鍵連接構(gòu)成的聚合物，包括但不限于DNA或RNA。該術(shù)語(yǔ)涵蓋包括DNA和RNA的任意已知堿基類似物的序列。術(shù)語(yǔ)“基因”是指包含生成多肽、前體、或RNA(例如rRNA、tRNA)所需的編碼序列的核酸(例如DNA)序列。多肽可以由全長(zhǎng)編碼序列編碼，或者由該編碼序列的任何部分編碼，只要保留有該全長(zhǎng)編碼序列或片段的所需活性或功能性質(zhì)(例如，酶活性、配體結(jié)合、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、免疫原性等)即可。該術(shù)語(yǔ)還涵蓋結(jié)構(gòu)基因的編碼區(qū)和臨近該編碼區(qū)并距離5'端和3'端任意一端約Ikb以上定位使得該基因相當(dāng)于全長(zhǎng)mRNA長(zhǎng)度的序列。定位于編碼區(qū)的5'端并出現(xiàn)在mRNA上的序列是指5'端非翻譯區(qū)序列。定位于編碼區(qū)的3'端或下游并出現(xiàn)在mRNA上的序列是指3/端非翻譯區(qū)序列。術(shù)語(yǔ)“基因”涵蓋cDNA和基因組形式的基因?；蚪M形式的基因或基因克隆包含被非編碼序列(稱為“內(nèi)含子”或“插入?yún)^(qū)”或“插入序列”)間斷的編碼區(qū)。內(nèi)含子是轉(zhuǎn)錄到核RNA(hnRNA)中的基因片段；內(nèi)含子可以含有諸如增強(qiáng)子等調(diào)節(jié)元件。內(nèi)含子被從核轉(zhuǎn)錄本或初級(jí)轉(zhuǎn)錄本除掉或“剪切掉”；因此內(nèi)含子并沒有出現(xiàn)在信使RNA(mRNA)轉(zhuǎn)錄本中。mRNA在翻譯過程中起到確定新形成多肽中的氨基酸序列或順序的作用。除了含有內(nèi)含子之外，基因組形式的基因還可以包含位于出現(xiàn)在RNA轉(zhuǎn)錄本上的序列的5'端和3'端的序列。這些序列稱為“側(cè)翼”序列或“側(cè)翼”區(qū)(這些側(cè)翼序列位于出現(xiàn)在RNA轉(zhuǎn)錄本上的非翻譯序列的5'端或3'端)。5'端側(cè)翼區(qū)可以含有控制或影響基因轉(zhuǎn)錄的諸如啟動(dòng)子和增強(qiáng)子等調(diào)節(jié)序列。3'端側(cè)翼區(qū)可以包含指導(dǎo)轉(zhuǎn)錄終止、轉(zhuǎn)錄后切割和多腺苷酸化的序列。在涉及細(xì)胞、核酸、蛋白或載體時(shí)所使用的術(shù)語(yǔ)“重組”表示所述細(xì)胞、核酸、蛋白或載體已經(jīng)通過導(dǎo)入異源核酸或蛋白或改變天然核酸或蛋白進(jìn)行了修飾，或者所述細(xì)胞來源于經(jīng)如此修飾的細(xì)胞。因此，例如，重組細(xì)胞表達(dá)出未見于天然(非重組)形式的細(xì)胞的基因或表達(dá)出過表達(dá)或異常表達(dá)(例如表達(dá)為非天然存在的片段或剪切變體)的基因。本文所用的“重組核酸”是指這樣的核酸，其最初通常通過操縱核酸(例如使用聚合酶和內(nèi)切酶)在體外形成，并且為通常未見于自然界的形式。采用這種方式可以實(shí)現(xiàn)不同序列的可操作連接。因此，線性形式的分離的核酸或者通過連接通常未連在一起的DNA分子而在 體外形成的表達(dá)載體都認(rèn)為是用于本發(fā)明用途的重組體。應(yīng)當(dāng)理解的是，重組核酸一旦制得并導(dǎo)入宿主細(xì)胞或生物體，其將非重組地(即利用宿主細(xì)胞的體內(nèi)細(xì)胞器而不是體外操縱)復(fù)制；然而，這樣的核酸一旦重組制得，雖然隨后進(jìn)行非重組地復(fù)制，但是仍然認(rèn)為是用于本發(fā)明用途的重組體。類似地，“重組蛋白”是利用重組技術(shù)(即通過以上所述的重組核酸的表達(dá))所制得的蛋白。本文所用的術(shù)語(yǔ)“異源基因”是指未處于其天然環(huán)境中的基因。例如，異源基因包括來自某一物種的但被導(dǎo)入到另一種物種的基因。異源基因還包括天然來源于某一生物體但在某些方面已經(jīng)改變了的(例如，突變了的、加入了多拷貝的、連接到非天然調(diào)節(jié)序列上的，等等)基因。異源基因明顯不同于內(nèi)源性基因，原因在于異源基因序列通常連接到未發(fā)現(xiàn)與染色體中的基因序列天然有關(guān)或與自然界未發(fā)現(xiàn)的染色體的各部分有關(guān)的DNA序列(例如，大腸桿菌(coli)所表達(dá)的通常其并沒有表達(dá)的基因)。本文所用的術(shù)語(yǔ)“載體”用于指將一條或多條DNA片段從一個(gè)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到另一個(gè)細(xì)胞的核酸分子。術(shù)語(yǔ)“載質(zhì)”有時(shí)與“載體”相互交換使用。載體通常來自于質(zhì)粒、噬菌體或者植物病毒或動(dòng)物病毒。“連接”是指在雙鏈核酸片段之間形成二酯鍵的過程。除非另有說明，否則連接可以使用已知緩沖液和10單位T4DNA連接酶(“連接酶”)/0. 5ug(約等摩爾量)待連接DNA片段的條件完成。核酸的連接可以用來在框架內(nèi)將兩個(gè)蛋白連接在一起以生成單個(gè)蛋白或融合蛋白。本文所用的術(shù)語(yǔ)“基因表達(dá)”是指通過基因的“轉(zhuǎn)錄”(例如，通過RNA聚合酶的酶作用)將基因中所編碼的遺傳信息轉(zhuǎn)化為RNA (例如mRNA、rRNA、tRNA或snRNA)，以及對(duì)于蛋白編碼基因則通過mRNA “翻譯”而將該基因轉(zhuǎn)化為蛋白的過程?；虮磉_(dá)可以在該過程中的很多階段得以調(diào)節(jié)?！吧险{(diào)”或“激活”是指提高基因表達(dá)產(chǎn)物(例如，RNA或蛋白)生成的調(diào)節(jié)，而“下調(diào)”或“抑制”是指降低生成的調(diào)節(jié)。參與上調(diào)或下調(diào)的分子(例如，轉(zhuǎn)錄因子)常常分別稱為“活化劑”和“抑制劑”。術(shù)語(yǔ)“多肽”、“肽”、“蛋白”和“蛋白片段”在本文中可以相互交換使用，指氨基酸殘基的聚合物。該術(shù)語(yǔ)適用于其中一種或多種氨基酸殘基是相應(yīng)天然存在的氨基酸的人造化學(xué)模擬物的氨基酸聚合物，也適用于天然存在的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物。術(shù)語(yǔ)“氨基酸”是指天然存在的氨基酸和合成的氨基酸酸以及具有與天然存在的氨基酸類似的功能的氨基酸類似物和氨基酸模擬物。天然存在的氨基酸是那些由遺傳密碼子編碼的氨基酸以及那些經(jīng)后期修飾的氨基酸，例如羥基脯氨酸、Y-羧基谷氨酸和0-磷酸絲氨酸。氨基酸類似物是指具有與天然存在的氨基酸相同的基本化學(xué)結(jié)構(gòu)的化合物，例如a碳連接到氫、羧基、氨基和R基團(tuán)的氨基酸，例如高絲氨酸、正亮氨酸、蛋氨酸亞砜、蛋氨酸甲基锍。所述類似物可以具有經(jīng)修飾的R基團(tuán)(例如正亮氨酸)或經(jīng)修飾的肽骨架但仍保留與天然存在的氨基酸相同的基本化學(xué)結(jié)構(gòu)。氨基酸模擬物是指具有不同于氨基酸的普通化學(xué)結(jié)構(gòu)但是具有與天然存在的氨基酸類似的功能的化合物?！氨Ｊ匦揎椬凅w”適用于氨基酸和核酸序列?！鞍被嶙凅w”是指氨基酸序列。對(duì)于特定的核酸序列，保守修飾變體是指編碼相同或基本相同的氨基酸序列的那些核酸序列，或者在核酸不編碼氨基酸序列的情況中指基本相同或相關(guān)的(例如天然臨近的)序列。由 于遺傳密碼子的簡(jiǎn)并性，大多數(shù)蛋白都由大量功能相同的核酸編碼。例如，密碼子GCA、GCC、GCG和G⑶編碼的氨基酸均是丙氨酸。因此，在由密碼子規(guī)定的丙氨酸的每一個(gè)位置，該密碼子可以改變?yōu)榱硪粋€(gè)相應(yīng)的所述密碼子而沒有改變所編碼的多肽。這樣的核酸變異為“沉默變異”，是一種保守修飾變異。此處編碼多肽的每一核酸序列也描述了核酸的沉默變異。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)知道，在某些情況下，也可以對(duì)核酸中的各密碼子(除了一般是甲硫氨酸的唯一密碼子的AUG和一般是色氨酸的唯一密碼子的TGG之外)加以修飾以獲得功能相同的分子。因此，編碼多肽的核酸的沉默變異隱含在關(guān)于表達(dá)產(chǎn)物的所述序列中，但不隱含在關(guān)于實(shí)際探針序列的所述序列中。對(duì)于氨基酸序列，本領(lǐng)域技術(shù)人員知道，核酸的取代、缺失或增加、在經(jīng)編碼的序列中改變、增加或缺失單個(gè)氨基酸或少量百分比的氨基酸的肽、多肽或蛋白序列是“保守修飾變體”，包括改變的結(jié)果導(dǎo)致氨基酸被化學(xué)相似的氨基酸取代的情況。提供有功能相似的氨基酸的保守取代的表格在本領(lǐng)域內(nèi)是已知的。除包括這樣的保守修飾變體之外，并沒有排除本發(fā)明的多態(tài)性變體、種間同系物和等位基因。通常，保守取代包括1)丙氨酸(A)、甘氨酸(G) ；2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E) ；3)天冬酰氨(N)、谷氨酰氨(Q) ;4)精氨酸(R)、賴氨酸⑷；5)異亮氨酸⑴、亮胺酸(L)、甲硫氨酸(M)、纈氨酸(V) ；6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W) ；7)絲氨酸(S)、蘇氨酸(T);和8)半胱氨酸(C)、甲硫氨酸(M)(參見,例如 Creighton, Proteins (1984))。本文所用的術(shù)語(yǔ)“帶表位標(biāo)簽的”是指包含癌干細(xì)胞標(biāo)記物蛋白或其域序列或部分的、與“表位標(biāo)簽”融合的嵌合多肽。表位標(biāo)簽多肽包含足夠的氨基酸殘基以提供由抗體識(shí)別的表位，但仍然足夠的短使得其不影響癌干細(xì)胞標(biāo)記物蛋白的活性。適宜的表位標(biāo)簽通常具有至少6個(gè)氨基酸殘基，一般在約8 約50個(gè)氨基酸殘基之間,有時(shí)在約10 約20個(gè)殘基之間。常用的表位標(biāo)簽包括Fe、HA、His和FLAG標(biāo)簽。本發(fā)明提供了一種分離的抗體，所述抗體與人類FZD8受體的胞外域特異性結(jié)合，并抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。在某些實(shí)施方式中，所述抗體是單克隆抗體。在某些實(shí)施方式中，所述抗體是嵌合抗體。在某些實(shí)施方式中，所述抗體是人源化抗體。在某些實(shí)施方式中，所述抗體是人類抗體。
本發(fā)明還提供了一種分離的抗體，所述抗體與兩種以上的人類FZD受體的胞外域特異性結(jié)合，并抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。在某些實(shí)施方式中，所述抗體與人類FZD2和FZD6的胞外域特異性結(jié)合。在某些實(shí)施方式中，所述抗體與人類FZD7和FZDlO的胞外域特異性結(jié)合。在某些實(shí)施方式中，所述抗體與人類FZD4和FZD5的胞外域特異性結(jié)合。在某些實(shí)施方式中，所述抗體與人類FZD4和FZD8的胞外域特異性結(jié)合。在一些實(shí)施方式中，所述抗體與人類FZD5和FZD8的胞外域特異性結(jié)合。在一些實(shí)施方式中，所述抗體是單克隆抗體。在一些實(shí)施方式中，所述抗體是嵌合抗體。在一些實(shí)施方式中，所述抗體是人源化抗體。在一些實(shí)施方式中，所述抗體是人類抗體。本發(fā)明還提供了一種分離的抗體，所述抗體與三種以上的人類FZD受體的胞外域特異性結(jié)合。在某些實(shí)施方式中，所述抗體與人類FZD4、FZD5和FZD8的胞外域特異性結(jié)合。在一些實(shí)施方式中，所述抗體是單克隆抗體。在一些實(shí)施方式中，所述抗體是嵌合抗體。在一些實(shí)施方式中，所述抗體是人源化抗體。在一些實(shí)施方式中，所述抗體是人類抗體。本發(fā)明還提供一種藥物組合物，該藥物組合物包含本發(fā)明所公開的抗體和藥學(xué)可 接受的載質(zhì)。本發(fā)明還提供了一種產(chǎn)生本發(fā)明所公開的抗體的雜交瘤。本發(fā)明進(jìn)一步提供了一種治療癌癥的方法，所述方法包括施用抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)有效量的本發(fā)明所公開的抗體或藥物組合物。在某些實(shí)施方式中，所述抗體與細(xì)胞毒性部分進(jìn)行了偶聯(lián)。在某些實(shí)施方式中，所述方法進(jìn)一步包括施用至少一種適于進(jìn)行聯(lián)合療法的額外治療劑。在某些實(shí)施方式中，所述腫瘤細(xì)胞選自乳腺腫瘤、結(jié)腸直腸腫瘤、肺腫瘤、前列腺腫瘤、胰腺腫瘤和頭頸部腫瘤。實(shí)體瘤類似于其來源組織，由異源細(xì)胞群組成。大部分這些細(xì)胞缺乏致瘤性，這表明實(shí)體瘤的發(fā)展和維持也依賴于小群體的干細(xì)胞(即，致瘤性癌細(xì)胞)，這些干細(xì)胞具有增殖并有效地同時(shí)形成另外的腫瘤干細(xì)胞(自我再生)和大部分的更分化的、缺乏致瘤潛能的腫瘤細(xì)胞(即，非致瘤性癌細(xì)胞)。癌干細(xì)胞概念是在發(fā)現(xiàn)HSC之后不久首次引入的，并在急性髓性白血病(AML)中得到試驗(yàn)確證(Park等，1971, JNatl. Cancer Inst. 46 :411 22 ；Lapidot 等，1994, Nature 367 :645 8 ；Bonnet 和 Dick, 1997, Nat. Med. 3 :730 7 ；Hope等,2004, Nat. Immunol. 5 :738 43)。來自實(shí)體瘤的干細(xì)胞新近基于它們的細(xì)胞表面受體獨(dú)特的表達(dá)模式和對(duì)它們?cè)谂囵B(yǎng)物和異種移植物動(dòng)物模型中自我再生和增殖性能的評(píng)價(jià)而得到分離。已發(fā)現(xiàn)，ESA+,⑶44+、⑶24-/低譜系群體為具有形成腫瘤的能力而富集超過非分級(jí)腫瘤細(xì)胞的 50 倍(Al-Hajj 等，2003, Proc. Nat，I. Acad. Sci. 100 :3983 8)。從大量非致瘤性腫瘤細(xì)胞中分離出致瘤性癌干細(xì)胞的能力使得可以使用微陣列分析來鑒定癌干細(xì)胞標(biāo)記物、相對(duì)于非致瘤性腫瘤細(xì)胞或正常乳腺上皮在癌干細(xì)胞中具有差異表達(dá)的基因。本發(fā)明利用對(duì)這些所鑒定的癌干細(xì)胞標(biāo)記物的認(rèn)識(shí)來診斷和治療癌癥。本發(fā)明的癌干細(xì)胞標(biāo)記物涉及人類FZD受體，包括例如作為癌干細(xì)胞標(biāo)記物的人類FZD4、FZD5和FZD8，該受體涉及癌干細(xì)胞維持中的Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，并通過消除這些致瘤性細(xì)胞而作為癌癥治療靶。fct信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑是胚胎模式形成、胚胎后的組織維持和干細(xì)胞生物學(xué)的多個(gè)關(guān)鍵調(diào)節(jié)因素之一。更具體地說，Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)在細(xì)胞極性的產(chǎn)生和細(xì)胞命運(yùn)特化(包括干細(xì)胞群的自我再生)中發(fā)揮重要的作用。fct途徑的失控激活與大量人類癌癥有關(guān)，其中該途徑可以改變腫瘤細(xì)胞的發(fā)育命運(yùn)而使它們維持在未分化和增殖狀態(tài)。因此，致癌作用能夠通過盜用控制正常發(fā)育和由干細(xì)胞進(jìn)行的組織修復(fù)的穩(wěn)態(tài)機(jī)制而進(jìn)行(Reya 和 Clevers, 2005, Nature 434 :843 ；Beachy 等，2004, Nature 432 :324 中的綜述)。fct信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑首次闡述在果蜆(Drosophila)發(fā)育突變體Wingless (wg)并源自于鼠類原癌基因 int-l(目前稱為 Wntl) (Nusse 和 Varmus，1982，Cell 31 :99 109 ；VanOoyen 和 Nusse，1984，Cell 39 :233 40 ;Cabrera 等，1987，Cell 50 :659 63 ；Rijsewijk等，1987, Cell 50 :649 57)。Wnt基因編碼分泌的脂改性的糖蛋白，該糖蛋白在哺乳動(dòng)物中已經(jīng)鑒定到19個(gè)。這些分泌出的配體激活由Frizzled(Fzd) 受體家族成員和低密度脂蛋白(LDL)受體相關(guān)蛋白5或6(LPR5/6)構(gòu)成的受體復(fù)合物。Fzd受體是G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)超家族的七跨膜域蛋白，含有帶10個(gè)保守半胱氨酸的大胞外N端配體結(jié)合域(稱為富含半胱氨酸域(CRD)或Fri域)。人類FZD受體有10個(gè)FZD1 10。不同F(xiàn)zd CRD對(duì)特定的Wnt具有不同結(jié)合親和性(Wu和Nusse, 2002, J. Biol. Chem. 277 :41762 9)，并且Fzd受體被分為激活以下所述的規(guī)范3 -連環(huán)蛋白途徑的受體和激活非規(guī)范途徑的受體(Miller等，1999，Oncogene 18 :7860 72)。為了形成結(jié)合FZD配體的受體復(fù)合物，F(xiàn)ZD受體與LRP5/6 (單通道跨膜蛋白，帶有由6個(gè)YWTD氨基酸重復(fù)物分開的4個(gè)胞外EGF樣域)相互作用(Johnson 等，2004, J. Bone Mineral Res. 19 :1749)。受體結(jié)合激活的規(guī)范Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑由與Fzd受體直接相互作用的胞質(zhì)蛋白Dishevelled(Dsh)所介導(dǎo)，并導(dǎo)致胞質(zhì)穩(wěn)定和￠-連環(huán)蛋白積累。在沒有Wnt信號(hào)時(shí)，
連環(huán)蛋白定位于包含腫瘤抑制劑結(jié)腸腺瘤息肉病(APC)蛋白和生長(zhǎng)素的胞質(zhì)破壞復(fù)合物。這些蛋白起到讓糖原合成酶激酶(GSK)-30結(jié)合和磷酸化￠-連環(huán)蛋白的關(guān)鍵支架作用，使得其可以通過泛素/蛋白酶途徑降解。Dsh的激活導(dǎo)致GSK3P的磷酸化和所述破壞復(fù)合物的解離。累積的胞質(zhì)￠-連環(huán)蛋白然后轉(zhuǎn)運(yùn)至核內(nèi)，并在那里與Tcf/Lef家族的DNA結(jié)合蛋白相互作用而激活轉(zhuǎn)錄。除了規(guī)范信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑之外，Wnt配體還激活P -連環(huán)蛋白非依賴途徑(Veeman等，2003，Dev. Cell 5 :367 77)。非規(guī)范Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)參與到很多過程，但確信大多數(shù)是通過類似于果蠅平面細(xì)胞極性(PCP)途徑的機(jī)制而參與原腸胚形成活動(dòng)。非規(guī)范fct信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的其他可能機(jī)制包括鈣通量、JNK以及小G蛋白和異三聚G蛋白。經(jīng)常觀察到規(guī)范途徑和非規(guī)范途徑之間的拮抗作用，有一些證據(jù)表明，非規(guī)范信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)可以抑制癌癥形成(Olson
Gibo, 1998, Exp. Cell Res. 241 :134 ;Topol 等，2003，J. Cell Biol. 162 :899 908)。因此在某些情況下，F(xiàn)zd受體起到規(guī)范Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的負(fù)調(diào)節(jié)劑作用。例如，F(xiàn)ZD6在與FZDl共表達(dá)時(shí)通過TAKl-NLK途徑抑制Wnt_3a誘導(dǎo)的規(guī)范信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(Golan等，2004，JBC279 14879 88)。類似地，F(xiàn)zd2在Wnt_5a存在的情況下通過TAKl-NLK MAPK級(jí)聯(lián)來拮抗規(guī)范 Wnt 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(Ishitani 等，2003, Mol. Cell. Biol. 23 :131 9)。造血干細(xì)胞(HSC)是體內(nèi)了解最好的干細(xì)胞，并且Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)同時(shí)參與了它們的正常維持和白血病轉(zhuǎn)化(Reya和Clevers，2005，Nature 434 :843)。HSC是位于成體骨髓中的小孔龕(stomal niche)內(nèi)的稀有細(xì)胞群。這些細(xì)胞的特征在于獨(dú)特的基因表達(dá)模式以及持續(xù)產(chǎn)生更加分化的祖細(xì)胞以再建整個(gè)造血系統(tǒng)的能力。HSC及其基質(zhì)微環(huán)境細(xì)胞均表達(dá)Wnt配體,并且Wnt受體激活存在于體內(nèi)HSC中。而且，P -連環(huán)蛋白和純化的Wnt3A促進(jìn)了鼠類HSC體外的自我再生，增強(qiáng)了它們體內(nèi)再建造血系統(tǒng)的能力，而Wnt5A促進(jìn)了人類造血祖細(xì)胞的體外擴(kuò)展和NOD-SCID異種移植物模型中的再群集(Reya等，2003，Nature423 :409 14 ;Willert 等，2003，Nature 423 :448 52 ；Van Den Berg等，1998，Blood 92:3189 202 !Murdoch 等，2003，Proc. Nat' I Acad. Sci. 100 :3422 7)。新近發(fā)現(xiàn)，Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)在髓系譜系和淋巴樣譜系的致瘤性生長(zhǎng)中均發(fā)揮作用。例如，來自慢性髓性白血病的粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞祖細(xì)胞(GMP)顯示出它們生長(zhǎng)和再生依賴激活的Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(Jamieson等，2004，N. Engl. J. Med. 351 :657 67)。雖然白血病似乎沒有包含Wnt途徑中的突變，但是自分泌和/或旁分泌Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)可以維持癌性自我再生(Reya 和 Clevers 2005, Nature 434 :843)。規(guī)范Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在小腸和結(jié)腸的干細(xì)胞群的維持中也起到核心作用，該途徑的不當(dāng)激活在結(jié)腸直腸癌中發(fā)揮突出的作用(Reya和Clevers, 2005, Nature 434 843)。吸收性的腸上皮分布在絨毛和隱窩中。干細(xì)胞位于隱窩中并緩慢分裂而生成快速增殖的細(xì)胞，由此產(chǎn)生移動(dòng)到隱窩外而占據(jù)腸絨毛的所有分化細(xì)胞群。fct信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)級(jí)聯(lián)在控制沿著隱窩-絨毛軸的細(xì)胞命運(yùn)中發(fā)揮主導(dǎo)作用，并且對(duì)干細(xì)胞群的維持而言是
1.必要的。通過同源重組造成Tcf7/2的基因缺失(Korinek等，1998，Nat. Genet. 19 :379)或Dickkopf-I (Dkkl)( 一種有效的分泌的Wnt拮抗劑)的過表達(dá)(Pinto等,2003, GenesDev. 17 :1709 13 ;Kuhnert 等，2004，Proc. Nat' I Acad. Sci. 101 :266 71)中斷 Wnt 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，會(huì)導(dǎo)致腸干細(xì)胞群的耗竭。結(jié)腸直腸癌最常見的是通過激活Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)級(jí)聯(lián)中的突變來引發(fā)。所有結(jié)腸直腸癌中約有5% 10%是遺傳的，其主要形式之一是家族性腺瘤性息肉病(FAP)，該家族性腺瘤性息肉病是常染色體顯性疾病，其中有約80%的受影響個(gè)體在結(jié)腸腺瘤性息肉病(APC)基因中含有種系突變。在包括生長(zhǎng)素和￠-連環(huán)蛋白在內(nèi)的fct途徑其他組分中也己鑒定到突變。個(gè)體腺瘤是含有第二非激活的等位基因的上皮細(xì)胞的克隆過生長(zhǎng)，大量的FAP腺瘤不可避免地通過癌基因和/或腫瘤抑制劑基因的添加突變而導(dǎo)致腺癌的發(fā)育。而且，fct信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的激活，包括APC和￠-連環(huán)蛋白中的功能獲得性突變，可以誘導(dǎo)小鼠模型中的增生性發(fā)育和腫瘤生長(zhǎng)(Oshima 等，1997, Cancer Res. 57 :1644 9 ；Harada 等，1999,EMBO J. 18 5931 42)。Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)在癌癥中的作用由于Wntl(最初為inti)被鑒定為附近插入鼠類病毒而轉(zhuǎn)化的哺乳動(dòng)物腫瘤中的癌基因而得到首次揭示(Nusse和Varmus，1982，Cell 31 99 109)。從此積累了 Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)在乳癌中的作用的其他證據(jù)。例如，哺乳動(dòng)物腺體中的￠-連環(huán)蛋白轉(zhuǎn)基因過表達(dá)導(dǎo)致增生癥和腺癌(Imbert等，2001，J. Cell Biol. 153 555 68 ；Michaelson 和 Leder, 2001, Oncogene 20 :5093 9),而 Wnt 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的缺失破壞了正常哺乳動(dòng)物腺體的發(fā)育(T印era等，2003，J. Cell Sc. 116 :1137 49 ;Hatsell等，2003, J. Mammary Gland Biol. Neoplasia 8 :145 58)。最近，已經(jīng)證明哺乳動(dòng)物干細(xì)胞由fct信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)所激活(Liu等，2004，Proc. NaC I Acad. Sci. 101 :4158)。在人類乳癌中，P -連環(huán)蛋白積累暗示有超過50%的癌癥中出現(xiàn)受激活的Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，盡管還沒有鑒定到具體的突變，但是已經(jīng)觀察到Frizzled受體表達(dá)的上調(diào)(Brennan和Brown, 2004, JMammary Gland Neoplasia 9 :119 31 ；Malovanovic 等，2004, Int. J. Oncol. 25:1337 42)。FZD10、FZD8、FZD7、FZD4和FZD5是10個(gè)已經(jīng)鑒定到的人類Wnt受體中的5個(gè)。在小鼠胚胎中，F(xiàn)zdlO在神經(jīng)管、肢芽和苗勒管中與Wnt7a—起表達(dá)(Nunnally和Parr，2004，Dev. Genes Evol. 214 :144 8),并且在肢芽發(fā)育過程中起到Wnt_7a受體的作用(Kawakami等，2000，Dev. Growth Differ. 42 :561 9)。FZDlO 在肺中與 Wnt7b 共表達(dá)，并且細(xì)胞轉(zhuǎn)染研究顯示，F(xiàn)ZD10/LRP5共受體激活響應(yīng)Wnt7b的規(guī)范Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑(Wang等，2005，Mol. Cell Biol. 25 :5022 30)。FZDlOmRNA在許多癌細(xì)胞系(包括子宮頸細(xì)胞系、胃細(xì)胞系和成膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞系)和原發(fā)性癌(包括約40%的原發(fā)性胃癌、結(jié)腸癌和滑膜肉瘤)中受到上調(diào)(Saitoh 等，2002, Int. J. Oncol. 20 :117 20 ；Terasaki 等，2002, Int. J. Mol.Med. 9 :107 12 ;Nagayama 等，2005, Oncogene I 12)。FZD8 在數(shù)種人類癌細(xì)胞系、原發(fā)性胃癌和直腸癌中受到上調(diào)(Saitoh等，2001, Int. J. Oncol. 18 :991 96 ；Kirikoshi等，2001, Int. J. Oncol. 19 :111 5 Janssens 等，2004，Tumor Biol. 25 :161 71)。FZD7在整個(gè)胃腸管中表達(dá)，并且在人類原發(fā)性胃癌病例中有六分之一受到上調(diào)(Kirikoshi等，2001，Int. J. Oncol. 19 :111 5)。結(jié)腸癌細(xì)胞系的FZD7胞外域的表達(dá)誘導(dǎo)形態(tài)學(xué)變化并減 緩異種外植體模型中的腫瘤生長(zhǎng)(Vincan等,2005, Differentiation 73 :142 53)。FZD5在卵黃囊和胎盤血管生成中發(fā)揮必要作用(Ishikawa等，2001，Dev. 128 :25 33)，并在與Wnt/P -連環(huán)蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)的腎癌中受到上調(diào)(Janssens等,2004, Tumor Biology25 161 71)。FZD4在腸隱窩上皮細(xì)胞中高度表達(dá)，并且是在正常組織與腫瘤組織中顯示出差異表達(dá)的數(shù)種因子之一(Gregorieff 等，2005, Gastroenterology 129 :626 38)。因此FZD受體作為癌干細(xì)胞標(biāo)記物的鑒定使得這些蛋白成為癌癥治療的理想靶。本發(fā)明提供了一種癌干細(xì)胞標(biāo)記物，所述癌干細(xì)胞標(biāo)記物的表達(dá)可用于分析，以診斷或監(jiān)測(cè)與癌干細(xì)胞標(biāo)記物表達(dá)相關(guān)的疾病。在一些實(shí)施方式中，癌干細(xì)胞標(biāo)記物的表達(dá)例如由編碼所述癌干細(xì)胞標(biāo)記物的多核苷酸(例如mRNA)表達(dá)來確定?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域已知的眾多手段中任意一種來檢測(cè)和定量所述多核苷酸。在一些實(shí)施方式中，采用從例如患者活檢樣品的組織切片的原位雜交來檢測(cè)編碼癌干細(xì)胞標(biāo)記物的mRNA。在一些實(shí)施方式中，將RNA從組織中分離并通過例如Northern印跡、定量RT-PCR或微陣列等進(jìn)行檢測(cè)。例如可以從組織樣品中提取總RNA，并可以利用RT-PCR，使用特異性雜交和擴(kuò)增癌干細(xì)胞標(biāo)記物的引物來檢測(cè)癌干細(xì)胞標(biāo)記物多核苷酸的表達(dá)。在某些實(shí)施方式中，可以通過檢測(cè)相應(yīng)的多肽來檢測(cè)癌干細(xì)胞標(biāo)記物的表達(dá)?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域已知的眾多手段中的任意一種來檢測(cè)和定量所述多肽。在一些實(shí)施方式中，例如使用分析生物化學(xué)方法例如電泳、毛細(xì)管電泳、高效液相色譜(HPLC)或薄層層析(TLC)來檢測(cè)癌干細(xì)胞標(biāo)記物多肽。還可以根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的技術(shù)對(duì)所分離的多肽進(jìn)行測(cè)序。在某些實(shí)施方式中，利用例如組織切片上的免疫熒光或免疫組織化學(xué)，以抗癌干細(xì)胞標(biāo)記蛋白而產(chǎn)生的抗體來檢測(cè)所述蛋白。作為選擇，使用例如ELISA、FACS、Western印跡、免疫沉淀或蛋白微陣列，以抗癌干細(xì)胞標(biāo)記物的抗體檢測(cè)表達(dá)。例如，可從患者活檢樣品中分離出癌干細(xì)胞，利用FACS以熒光標(biāo)記抗體檢測(cè)癌干細(xì)胞標(biāo)記物蛋白的表達(dá)。在另一種方法中，可以利用標(biāo)記抗體在典型成像系統(tǒng)中體內(nèi)檢測(cè)表達(dá)癌干細(xì)胞標(biāo)記的細(xì)胞。例如，可以使用順磁性同位素標(biāo)記的抗體進(jìn)行磁共振成像(MRI)。在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，診斷測(cè)定包括使用例如免疫組織化學(xué)、原位雜交或RT-PCR確定癌干細(xì)胞標(biāo)記物在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)與否。在另外的實(shí)施方式中，診斷測(cè)定包括使用例如定量RT-PCR確定癌干細(xì)胞標(biāo)記物的表達(dá)水平。在一些實(shí)施方式中，診斷測(cè)定還包括例如與對(duì)照組織例如正常上皮組織比較來確定癌干細(xì)胞標(biāo)記物的表達(dá)水平。然后，癌干細(xì)胞標(biāo)記物表達(dá)的檢測(cè)可用以提供預(yù)后和選擇療法。預(yù)后可以基于癌干細(xì)胞標(biāo)記物指示的任意已知風(fēng)險(xiǎn)表達(dá)。而且，癌干細(xì)胞標(biāo)記物的檢測(cè)可以用以選擇適當(dāng)?shù)寞煼?，包括例如用抗被檢測(cè)的癌干細(xì)胞標(biāo)記物蛋白的抗體所進(jìn)行的治療。在某些實(shí)施方式中，所述抗體特異性結(jié)合諸如人類FZD受體等癌干細(xì)胞標(biāo)記物蛋白的胞外域。在本發(fā)明的范圍內(nèi)，適當(dāng)?shù)目贵w是具有例如以下一種或多種效果的物質(zhì)干擾癌干細(xì)胞標(biāo)記物的表達(dá)；通過例如在空間上抑制癌干細(xì)胞標(biāo)記物與其配體、受體或共受體之間的相互作用來干擾癌干細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的激活；通過例如作為配體或促進(jìn)內(nèi)源性配體的結(jié)合而激活癌干細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑；或結(jié)合癌干細(xì)胞標(biāo)記物并抑制腫瘤細(xì)胞增殖。在某些實(shí)施方式中，抗癌干細(xì)胞標(biāo)記物的抗體起到胞外調(diào)節(jié)癌干細(xì)胞標(biāo)記物蛋白功能的作用。在一些實(shí)施方式中，針對(duì)癌干細(xì)胞標(biāo)記物的抗體的胞外結(jié)合可以通過例如抑制癌干細(xì)胞標(biāo)記物的固有激活(例如激酶活性)和/或通過在空間上抑制例如癌干細(xì)胞標(biāo)記物與其配體、與其受體、與共受體或與胞外基質(zhì)之間的相互作用來抑制癌干細(xì)胞標(biāo)記物 蛋白的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。在一些實(shí)施方式中，例如抗癌干細(xì)胞標(biāo)記物的抗體的胞外結(jié)合可以通過例如癌干細(xì)胞標(biāo)記物蛋白的內(nèi)化或減少癌干細(xì)胞標(biāo)記物的細(xì)胞表面運(yùn)輸來下調(diào)癌干細(xì)胞標(biāo)記物的細(xì)胞表面表達(dá)。在一些實(shí)施方式中，抗癌干細(xì)胞標(biāo)記物的抗體的胞外結(jié)合可以通過例如發(fā)揮作為誘餌配體的作用或增加配體結(jié)合來促進(jìn)癌干細(xì)胞標(biāo)記物蛋白的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。在某些實(shí)施方式中，抗癌干細(xì)胞標(biāo)記物的抗體結(jié)合到癌干細(xì)胞標(biāo)記物蛋白上并具有以下一種或多種效果抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，觸發(fā)腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞死亡或防止腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。在某些實(shí)施方式中，針對(duì)癌干細(xì)胞標(biāo)記的抗體通過所偶聯(lián)的毒素、化療劑、放射性同位素或其他類似試劑來觸發(fā)細(xì)胞死亡。例如，針對(duì)癌干細(xì)胞標(biāo)記物的抗體與在表達(dá)該癌干細(xì)胞標(biāo)記物的腫瘤細(xì)胞中通過蛋白內(nèi)化而被激活的毒素偶聯(lián)。在某些實(shí)施方式中，針對(duì)癌干細(xì)胞標(biāo)記物的抗體通過抗體依賴性細(xì)胞毒性(ADCC)介導(dǎo)表達(dá)所述癌干細(xì)胞標(biāo)記物蛋白的細(xì)胞的細(xì)胞死亡。ADCC通過能識(shí)別抗體的Fe部分的效應(yīng)細(xì)胞而介入細(xì)胞的裂解。許多淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、組織巨噬細(xì)胞、粒細(xì)胞和嗜酸性細(xì)胞例如具有Fe受體并能夠介導(dǎo)細(xì)胞裂解(DiIIman, 1994，J. Clin. Oncol. 12 :1497)。在某些實(shí)施方式中，針對(duì)癌干細(xì)胞標(biāo)記物的抗體通過激活補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性(CDC)而觸發(fā)表達(dá)癌干細(xì)胞標(biāo)記物蛋白的細(xì)胞的細(xì)胞死亡。CDC參與血清補(bǔ)體與抗體的Fe部分的結(jié)合和隨后補(bǔ)體蛋白級(jí)聯(lián)的激活，從而導(dǎo)致細(xì)胞膜破壞，并最終造成細(xì)胞的死亡?？贵w的生物學(xué)活性已知在很大程度上由抗體分子的恒定區(qū)或Fe區(qū)決定(Uananue和Benacerraf, Textbook of Immunology,第 2 版，Williams 和 Wilkins,第 218 頁(yè)(1984))。如同屬于相同亞類但是來自于不同物種的抗體一樣，屬于不同類別和亞類的抗體在這方面是不同的。在人類抗體中，IgM是與補(bǔ)體結(jié)合最有效的抗體類別，其次是IgGl、IgG3和IgG2，但是IgG4似乎在激活補(bǔ)體級(jí)聯(lián)中非常缺乏(Dillman，1994，J. Clin. Oncol. 12 :1497 ；Jefferis等，1998, Immunol. Rev. 163 :59 76)。根據(jù)本發(fā)明，可以制備具有所需生物學(xué)活性的那類抗體?？梢詼y(cè)定針對(duì)癌干細(xì)胞的任何特定抗體通過補(bǔ)體激活和/或ADCC介導(dǎo)靶細(xì)胞裂解的能力。使感興趣的細(xì)胞在體外生長(zhǎng)并標(biāo)記；將抗體與血清補(bǔ)體或可被抗原抗體復(fù)合物激活的免疫細(xì)胞一起加到細(xì)胞培養(yǎng)物中。通過例如從裂解細(xì)胞釋放標(biāo)記而檢測(cè)靶細(xì)胞的細(xì)胞裂解。實(shí)際上，可以使用患者自己的血清作為補(bǔ)體源和/或免疫細(xì)胞源來篩查抗體。然后可以將能夠在體外測(cè)試中激活補(bǔ)體或介導(dǎo)ADCC的抗體用于該特定患者的治療。在某些實(shí)施方式中，針對(duì)癌干細(xì)胞標(biāo)記物的抗體可觸發(fā)細(xì)胞死亡，從而抑制血管生成。血管生成是這樣的過程，即，通過血管生成，由先前存在的血管形成新的血管，并且血管生成是在例如胚胎發(fā)育、傷口愈合和產(chǎn)卵反應(yīng)中正常生長(zhǎng)所需的基本過程。大于Imm2 2mm2的實(shí)體瘤生長(zhǎng)也需要血管生成以補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)和氧，如果沒有血管生成，腫瘤細(xì)胞將會(huì)死亡。在某些實(shí)施方式中，針對(duì)癌干細(xì)胞標(biāo)記物的抗體靶向表達(dá)該癌干細(xì)胞標(biāo)記物的血管細(xì)胞，包括例如內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞或胞外基質(zhì)的血管組裝所需的組分。在某些實(shí)施方式中，針對(duì)癌干細(xì)胞標(biāo)記物的抗體抑制血管細(xì)胞募集、組裝、維持或存活所需的生長(zhǎng)因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。針對(duì)癌干細(xì)胞標(biāo)記物的抗體可以用于本文所述的診斷和治療方法。在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明抗體例如用以檢測(cè)生物學(xué)樣品如患者組織活檢樣品、胸腔積液或血液樣品中的癌干細(xì)胞標(biāo)記物蛋白的表達(dá)?？梢詫⒔M織活檢樣品做成切片并使用例如免疫熒光或免疫組織化學(xué)對(duì)蛋白進(jìn)行檢測(cè)。此外，可以分離來自樣品的個(gè)體細(xì)胞并通過FACS分析來檢測(cè)經(jīng) 固定的細(xì)胞或活細(xì)胞。在某些實(shí)施方式中，可以在蛋白陣列上使用抗體來檢測(cè)例如腫瘤細(xì)胞上、細(xì)胞裂解物中或其他蛋白樣品中的癌干細(xì)胞標(biāo)記物的表達(dá)。在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明的抗體通過將抗體與基于體外細(xì)胞的測(cè)定或體內(nèi)動(dòng)物模型等中的腫瘤細(xì)胞接觸而用以抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。在某些實(shí)施方式中，通過施用治療有效量的針對(duì)癌干細(xì)胞標(biāo)記物的抗體而使用所述抗體來治療患者中的癌癥?？梢酝ㄟ^任何已知方法制備多克隆抗體。多克隆抗體可以通過多次皮下注射或腹膜內(nèi)注射相關(guān)抗原(純化的肽片段、全長(zhǎng)重組蛋白、融合蛋白等)來免疫動(dòng)物(例如兔、大鼠、小鼠、驢等)而產(chǎn)生，所述抗原可任選與稀釋在無(wú)菌鹽水中的匙孔血藍(lán)蛋白(KLH)、血清白蛋白等偶聯(lián)和與佐劑(例如完全弗氏佐劑或不完全弗氏佐劑)聯(lián)合以形成穩(wěn)定乳液。然后從經(jīng)如此免疫的動(dòng)物的血液和腹水等中回收多克隆抗體。讓所收集的血液凝結(jié)，傾析出血清并通過離心使其澄清并測(cè)定蛋白滴度?？梢愿鶕?jù)本領(lǐng)域標(biāo)準(zhǔn)方法，包括親和層析、離子交換色譜、凝膠電泳、透析等從血清或腹水中純化出多克隆抗體。單克隆抗體可以采用例如Kohler和Milstein(1975，Nature 256 :495)所描述的雜交瘤方法來制備。采用雜交瘤方法，按照如上所述對(duì)小鼠、倉(cāng)鼠或其他適當(dāng)?shù)乃拗鲃?dòng)物進(jìn)行免疫以引發(fā)淋巴細(xì)胞生成與免疫性抗原特異性結(jié)合的抗體。還可以在體外對(duì)淋巴細(xì)胞進(jìn)行免疫。免疫后，分離淋巴細(xì)胞，并使用例如聚乙二醇將其與適當(dāng)骨髓瘤細(xì)胞系融合，從而形成隨后可以從未融合淋巴細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞中選出的雜交瘤細(xì)胞。然后根據(jù)免疫沉淀、免疫印跡和體外結(jié)合測(cè)定(例如放射性免疫測(cè)定(RIA);酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA))確定的產(chǎn)生特異性抗所選抗原的單克隆抗體的雜交瘤使用標(biāo)準(zhǔn)方法(Goding, MonoclonalAntibodies !Principles and Practice,Academic Press, 1986)在培養(yǎng)物中體外繁殖或作為動(dòng)物腹水腫瘤體內(nèi)繁殖。然后從如以上針對(duì)多克隆抗體所描述的培養(yǎng)基或腹水液中純化出單克隆抗體。作為選擇，還可以使用如美國(guó)專利4，816，567所描述的重組DNA法來制備單克隆抗體。使用能夠特異性擴(kuò)增編碼單克隆抗體的重鏈和輕鏈的基因的寡核苷酸引物，通過例如RT-PCR從成熟B細(xì)胞或雜交瘤細(xì)胞分離出編碼所述抗體的多核苷酸，并使用常規(guī)程序確定它們的序列。然后將所分離的編碼重鏈和輕鏈的多核苷酸克隆到適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體中，當(dāng)將該表達(dá)載體轉(zhuǎn)染到諸如大腸桿菌(E. coli)細(xì)胞、猿COS細(xì)胞、中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞或骨髓瘤細(xì)胞等否則不生成免疫球蛋白的宿主細(xì)胞中，由該宿主細(xì)胞產(chǎn)生單克隆抗體。另夕卜，可以從表達(dá)所述的所需物種的CDR的噬菌體展示文庫(kù)中分離出所需物種的重組單克隆抗體或其片段(McCafferty 等，1990, Nature, 348 :552 554 ；Clackson 等，1991, Nature,352 624 628 ;和 Marks 等，1991，J. Mol. Biol, 222 :581 597)?？梢允褂弥亟MDNA技術(shù)，以許多不同的方式進(jìn)一步修飾編碼單克隆抗體的多核苷酸，以產(chǎn)生替代性抗體。在一些實(shí)施方式中，可以將例如小鼠單克隆抗體的輕鏈和重鏈的恒定區(qū)取代為I)例如人類抗體的恒定區(qū)，以產(chǎn)生嵌合抗體或2)非免疫球蛋白多肽，以產(chǎn)生融合抗體。在一些實(shí)施方式中，截?cái)嗷蛉コ龊愣▍^(qū)以產(chǎn)生單克隆抗體的所需抗體片段。可以使用可變區(qū)的定向誘變或高密度誘變來優(yōu)化單克隆抗體的特異性、親和性等。在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，針對(duì)癌干細(xì)胞標(biāo)記物的單克隆抗體是人源化抗體。人源化抗體是可變區(qū)中含有來自非人類(例如鼠類)抗體的最少量序列的抗體。這樣的抗 體在治療上用于施用于人類受試對(duì)象時(shí)減少抗原性和HAMA(人抗小鼠抗體)應(yīng)答。在實(shí)踐 中，人源化抗體通常是帶有最少量的或不帶有非人類序列的人類抗體。人類抗體是由人類產(chǎn)生的抗體或者是具有對(duì)應(yīng)于由人類產(chǎn)生的抗體的氨基酸序列。可以使用本領(lǐng)域已知的各種技術(shù)來制備人源化抗體?？梢允褂镁哂兴杼禺愋?、親和性和能力的非人類抗體(例如小鼠、大鼠、兔、倉(cāng)鼠等)的CDR取代人類抗體的CDR來對(duì)抗體進(jìn)行人源化(Jones 等，1986, Nature, 321 :522 525 ；Riechmann 等，1988, Nature,332 323 327 ；Verhoeyen 等，1988，Science, 239 :1534 1536)?？梢酝ㄟ^ Fv 骨架區(qū)中和/或所置換的非人類殘基內(nèi)的額外殘基的取代來進(jìn)一步修飾人源化抗體，以改進(jìn)和優(yōu)化抗體特異性、親和性和/或能力?？梢允褂帽绢I(lǐng)域已知的各種技術(shù)來直接制備人源化抗體?？梢援a(chǎn)生經(jīng)體外免疫的永生化人類B淋巴細(xì)胞或從能夠生成用于抗靶抗原的抗體的免疫個(gè)體中分離得到的永生化人類 B 淋巴細(xì)胞(參見，例如 Cole 等，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,Alan R.Liss，第 77 頁(yè)(1985) ;Boemer 等，1991，J. Immunol. , 147(1) :86 95;和美國(guó)專利5,750,373)。而且,可以從其中表達(dá)人類抗體的曬菌體文庫(kù)中選擇人類抗體(Vaughan等，1996, Nat. Biotech. , 14 :309 314 ；Sheets 等，1998, Proc. Nat1 I. Acad. Sci. ,95 :6157 6162 ;Hoogenboom 和 Winter, 1991, J. Mol. Biol.，227 :381 ；Marks 等，1991，J. Mol. Biol.，222:581)。還可以在含有人類免疫球蛋白基因座的轉(zhuǎn)基因小鼠中制得人源化抗體，所述人類免疫球蛋白基因座能夠在沒有內(nèi)源性免疫球蛋白生成的情況下在免疫后生成人類抗體的所有組成成員。該方法在美國(guó)專利5，545，807 ；5, 545,806 ；5, 569,825 ;5，625，126 ；5，633，425 ;和 5，661，016 中有描述。本發(fā)明還涵蓋特異性識(shí)別癌干細(xì)胞標(biāo)記物的雙特異性抗體。雙特異性抗體是能夠特異性識(shí)別和結(jié)合至少兩種不同表位的抗體。所述不同表位可以處在同一分子(例如，同一癌干細(xì)胞標(biāo)記物多肽)中或者處在不同的分子中，使得例如這兩個(gè)抗體可以特異性識(shí)別并結(jié)合癌干細(xì)胞標(biāo)記物以及例如I)諸如T細(xì)胞受體等白細(xì)胞上的效應(yīng)分子(例如CD3)或Fe受體(例如CD64、CD32或CD16)，或者2)將在下文詳述的細(xì)胞毒劑。雙特異性抗體可以是完整的抗體或抗體片段。
示例性的雙特異性抗體可以結(jié)合兩種不同的表位，其中至少一個(gè)表位來自于本發(fā)明的多肽。作為選擇，可以將免疫球蛋白分子的抗抗原臂與能夠和諸如T細(xì)胞受體分子等白細(xì)胞上的觸發(fā)分子(例如，CD2、CD3、CD28或B7)或者IgG的Fe受體結(jié)合的臂組合，以著眼于表達(dá)特定抗原的細(xì)胞的細(xì)胞防御機(jī)制。還可以使用雙特異性抗體來將細(xì)胞毒劑導(dǎo)入表達(dá)特定抗原的細(xì)胞。這些抗體具有抗原結(jié)合臂和能夠結(jié)合細(xì)胞毒劑或放射性核素螯合劑如EOTUBE、DPTA, DOTA或TETA的臂。制備雙特異性抗體的技術(shù)在本領(lǐng)域內(nèi)是常見的(Millstein 等，1983,Nature 305 :537 539 ；Brennan 等，1985,Science 229 81 ；Suresh等，1986，Methods in EnzymoI. 121 :120 ；Traunecker 等，1991，EMBO J. 10 :3655 3659 ；Shalaby 等，1992，J. Exp. Med. 175 :217 225 ;Kostelny 等，1992，J. Immunol. 148 :1547 1553 ；Gruber 等，1994，J. Immunol. 152 :5368 ;和美國(guó)專利 5，731，168)。還設(shè)想有多于兩價(jià)的抗體。例如，可以制備三特異性抗體(Tutt等，J. Immunol. 147 :60(1991))。在某些實(shí)施方式中，提供了抗體片段以例如提高腫瘤穿透性。已知有多種用于生成抗體片段的技術(shù)。傳統(tǒng)上，這些片段通過完整抗體的蛋白水解消化來獲得(例如，Morimoto 等，1993, Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24 :107 117 ； Brennan等，1985, Science, 229 :81)。在某些實(shí)施方式中，抗體片段通過重組產(chǎn)生。Fab、Fv和scFv抗體片段都可以在大腸桿菌或其他宿主細(xì)胞中表達(dá)和分泌，從而可以生成大量的這些片段。還可以從以上所討論的抗體噬菌體文庫(kù)中分離出所述抗體片段。抗體片段還可以是例如美國(guó)專利5，641，870中所述的線性抗體，并且可以是單特異性抗體或雙特異性抗體。本領(lǐng)域技術(shù)人員清楚生成抗體片段的其他技術(shù)。根據(jù)本發(fā)明，有各種技術(shù)適用于生成對(duì)本發(fā)明的多肽具有特異性的單鏈抗體(參見美國(guó)專利No. 4，946，778)。另外，也有各種方法適用于構(gòu)建Fab表達(dá)文庫(kù)(Huse等，Science 246 :1275 1281 (1989))，以快速有效地鑒定對(duì)FZD受體或其衍生物、片段、類似物或同系物具有所需特異性的單克隆抗體Fab片段。可以通過本領(lǐng)域技術(shù)生成含有本發(fā)明多肽的獨(dú)特型的抗體片段，所述抗體片段包括但不限于(a)通過抗體分子的胃蛋白酶消化而生成的F (ab' )2片段；(b)通過還原F(ab' ) 2片段的二硫橋而產(chǎn)生的Fab片段；(c)通過使用木瓜蛋白酶和還原劑處理抗體分子而產(chǎn)生的Fab片段；和(d)Fv片段。還可以根據(jù)需要，特別是在抗體片段的情況下，對(duì)抗體進(jìn)行修飾以延長(zhǎng)其血清半衰期。這可以通過例如以下方法來實(shí)現(xiàn)通過抗體片段中適當(dāng)區(qū)域的突變而將補(bǔ)救受體結(jié)合表位引入到抗體片段中，或者將所述表位引入到肽標(biāo)簽中，然后將肽標(biāo)簽融合到抗體片段的任一端或抗體片段的中間(例如通過DNA或肽合成)。異源偶聯(lián)抗體也處在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。異源偶聯(lián)抗體由兩個(gè)共價(jià)連接的抗體構(gòu)成。已經(jīng)提出例如利用這樣的抗體將免疫細(xì)胞靶向到有害細(xì)胞上(美國(guó)專利No. 4，676，980)。還想到的是，可以使用合成蛋白化學(xué)中已知的方法，包括那些涉及使用交聯(lián)劑的方法體外制備所述抗體。例如，可以使用二硫化物交換反應(yīng)或通過形成硫醚鍵來構(gòu)建免疫毒素。用于該目的的適當(dāng)試劑的例子包括亞氨基硫醇鹽(iminothiolate)和甲基 _4_ 疏基丁亞氨酸酯(methy-4-mercaptobutyrimidate)。應(yīng)當(dāng)理解，為本發(fā)明目的，所修飾的抗體可以包含使所述抗體和人類FZD受體相關(guān)聯(lián)的任何類型的可變區(qū)。在這方面，所述可變區(qū)可以包含或來自于可以被誘導(dǎo)而加強(qiáng)體液應(yīng)答和產(chǎn)生抗所需的腫瘤相關(guān)抗原的免疫球蛋白的任何類型的哺乳動(dòng)物。這樣，所修飾抗體的可變區(qū)可以例如來源于人類、鼠類、非人類靈長(zhǎng)動(dòng)物(例如食蟹猴、短尾猴等)或狼。在一些實(shí)施方式中，所修飾的免疫球蛋白的可變區(qū)和恒定區(qū)均是人類的可變區(qū)和恒定區(qū)。在其他實(shí)施方式中，相容性抗體(一般來自于非人類來源)的可變區(qū)可以改造或特異性定制以改善結(jié)合性能或減少該分子的免疫原性。在這方面，可以通過包含引入的氨基酸序列而對(duì)本發(fā)明有用的可變區(qū)進(jìn)行人源化或加以改變。通過一個(gè)或多個(gè)⑶R的至少一部分置換來同時(shí)改變重鏈和輕鏈中的可變域，并且如果需要，可以通過部分骨架區(qū)置換和序列變化來進(jìn)行所述改變。盡管⑶R可以來自于與骨架區(qū)來源抗體類別或者甚至是亞類相同的抗體，但是還想到的是，CDR可以來自于不同類別的抗體，優(yōu)選來自于不同物種的抗體?？赡懿恍枰脕碜怨w可變區(qū)的全部CDR來置換所有的CDR以將一個(gè)可變區(qū)的抗原結(jié)合能力轉(zhuǎn)移到另一個(gè)可變區(qū)。更合適的是，可以只需要轉(zhuǎn)移對(duì)維持抗原結(jié)合位點(diǎn)活性所必須的那些殘基。在美國(guó)專利No. 5，585，089,5, 693，761和5，693，762中給出了解釋。本領(lǐng)域技術(shù)人員完全有能力通過實(shí)施常規(guī)的試驗(yàn)或通過試錯(cuò)法測(cè)試來獲得免疫原性降低的功能性抗體。盡管改變可變區(qū)，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明的經(jīng)修飾的抗體將包含 這樣的抗體或其免疫反應(yīng)性片段，其中，當(dāng)與具有近似相同免疫原性的包含天然或未改變的恒定區(qū)的抗體相比時(shí)，所述抗體中的一個(gè)或多個(gè)恒定區(qū)域的至少一部分已被刪除或其它方式改變從而提供所述的生物化學(xué)特性，如增強(qiáng)的腫瘤定位或縮短的血清半衰期。在某些實(shí)施方式中，經(jīng)修飾的抗體的恒定區(qū)包含人類恒定區(qū)。對(duì)與本發(fā)明相容的恒定區(qū)所進(jìn)行的修飾包括在一個(gè)或多個(gè)結(jié)構(gòu)域中有一個(gè)或多個(gè)氨基酸的添加、缺失或取代。即，本文所公開的經(jīng)修飾的抗體可以包含三個(gè)重鏈恒定區(qū)(CH1、CH2或CH3)的一個(gè)或多個(gè)恒定區(qū)和/或輕鏈恒定區(qū)(CL)所進(jìn)行的改變或修飾。在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，想到了其中部分缺失或完全缺失一個(gè)或多個(gè)結(jié)構(gòu)域的經(jīng)修飾的恒定區(qū)。在一些實(shí)施方式中，經(jīng)修飾的抗體包含其中已經(jīng)去除了整個(gè)CH2域的結(jié)構(gòu)域缺失構(gòu)建體或變體(ACH2構(gòu)建體)。在一些實(shí)施方式中，所省掉的恒定區(qū)域?qū)⒈荒軌蛱峁┩ǔＳ扇笔Ш愣▍^(qū)賦予的某些分子柔性的短氨基酸間隔子(例如10個(gè)殘基)所置換。除了它們的構(gòu)型之外，本領(lǐng)域已知的是，恒定區(qū)介導(dǎo)數(shù)種效應(yīng)子功能。例如，補(bǔ)體的Cl組分與抗體的結(jié)合激活補(bǔ)體系統(tǒng)。補(bǔ)體激活對(duì)細(xì)胞病原體的調(diào)理和裂解非常重要。補(bǔ)體激活還刺激炎性反應(yīng)，并且還能夠參與自身免疫超敏反應(yīng)。另外，抗體通過Fe區(qū)與細(xì)胞結(jié)合，其中抗體Fe區(qū)上的Fe受體位點(diǎn)結(jié)合到細(xì)胞上的Fe受體(FcR)。有大量的對(duì)不同類別抗體，包括IgG (Y受體)、IgE (η受體)、IgA(a受體)和IgM (μ受體)具有特異性的Fe受體。抗體與細(xì)胞表面上的Fe受體的結(jié)合會(huì)觸發(fā)許多重要而多樣的生物學(xué)應(yīng)答，包括抗體包被顆粒的吞噬和破壞、免疫復(fù)合物的清除、殺傷細(xì)胞實(shí)施的抗體包被靶細(xì)胞的裂解(稱為抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性，或ADCC)、炎性中介體的釋放、免疫球蛋白生成的胎盤轉(zhuǎn)移和控制。盡管各種Fe受體和受體位點(diǎn)已有一定程度的研究，但是對(duì)它們的定位、結(jié)構(gòu)和功能還有很多未知之處。雖然不是要限制本發(fā)明的范圍，但是據(jù)信包含按本文所述修改的恒定區(qū)的抗體能夠提供改變了的效應(yīng)子功能，這反過來又影響了所施用抗體的生物學(xué)概況。例如，恒定區(qū)域的缺失或失活(通過點(diǎn)突變或其他方式)可以減少循環(huán)中經(jīng)修飾抗體與Fe受體的結(jié)合，由此加強(qiáng)腫瘤的定位。在另外的情況中，與本發(fā)明吻合的是，修飾恒定區(qū)調(diào)節(jié)了補(bǔ)體結(jié)合并由此縮短血清半衰期和偶聯(lián)的細(xì)胞毒素的非特異性連接。不過，可以使用恒定區(qū)的其他修飾來消除二硫鍵或寡聚糖部分，從而使得可提高抗原特異性或抗體柔性，因此可以加強(qiáng)定位。類似地，可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的生物化學(xué)或分子工程技術(shù)來容易地實(shí)現(xiàn)根據(jù)本發(fā)明對(duì)恒定區(qū)所進(jìn)行的修飾。應(yīng)當(dāng)注意的是，經(jīng)修飾的抗體可以被改造而將CH3域直接融合到相應(yīng)的經(jīng)修飾抗體的鉸鏈區(qū)。在另外的構(gòu)建體中，可能希望在鉸鏈區(qū)和經(jīng)修飾的CH2和/或CH3域之間提供肽間隔子。例如，可以表達(dá)相容性構(gòu)建體，其中CH2已經(jīng)缺失，并且余下的CH3域(修飾或未修飾的)通過5 20個(gè)氨基酸間隔子而連接到鉸鏈區(qū)上?？梢栽黾舆@樣的間隔子例如以確保恒定域的調(diào)節(jié)元件保持自由且是可接近的或者使鉸鏈區(qū)保持柔性。然而，應(yīng)當(dāng)注意的是，在某些情況中，能夠證實(shí)氨基酸間隔子具有免疫原性并能夠誘發(fā)抗所述構(gòu)建體的不需要的免疫應(yīng)答。因此，加到所述構(gòu)建體的任何間隔子應(yīng)當(dāng)相對(duì)無(wú)免疫原性，或者如果可以保持所修飾的抗體的所需生物化學(xué)質(zhì)量，甚至可以完全省掉間隔子。除了缺失整個(gè)恒定區(qū)域之外，應(yīng)當(dāng)理解的是，可以通過部分缺失或少量或者甚至 是單個(gè)氨基酸的取代來提供本發(fā)明的抗體。例如，CH2域的所選區(qū)域中的單氨基酸突變可能足以顯著降低Fe結(jié)合并由此加強(qiáng)腫瘤的定位。類似地，可能希望簡(jiǎn)單地缺失控制待調(diào)節(jié)的效應(yīng)子功能(例如補(bǔ)體CLQ結(jié)合)的一個(gè)或多個(gè)恒定區(qū)域的一部分。恒定區(qū)的這種部分缺失可以改善抗體的所選特性(血清半衰期)同時(shí)保持受試對(duì)象的恒定區(qū)域有關(guān)的其他所需功能的完整性。而且，如上文順便提到的，可以通過能夠改善所得構(gòu)建體概況的一個(gè)或多個(gè)氨基酸的突變或取代來修飾所公開的抗體的恒定區(qū)。在這方面，有可能可以破壞由保守的結(jié)合位點(diǎn)(例如Fe結(jié)合)提供的活性的同時(shí)，基本保持所修飾的抗體的構(gòu)型和免疫原性特性。某些實(shí)施方式可以包含添加到恒定區(qū)的一個(gè)或多個(gè)氨基酸以增強(qiáng)所需特性如效應(yīng)子的功能或者提供更多的細(xì)胞毒素或碳水化合物吸附。在這樣的實(shí)施方式中，可能希望插入或復(fù)制來自所選恒定區(qū)域的特異性序列。本發(fā)明還包括基本與本文提出的嵌合抗體、人源化抗體和人類抗體或它們的抗體片段相類似的變體和等效物。這些變體或等效物可以含有例如保守取代突變，即一個(gè)或多個(gè)氨基酸被類似的氨基酸取代。例如，保守取代是指一個(gè)氨基酸被同一大類內(nèi)的另一個(gè)氨基酸取代，例如一個(gè)酸性氨基酸被另一個(gè)酸性氨基酸取代，一個(gè)堿性氨基酸被另一個(gè)堿性氨基酸取代，或者一個(gè)中性氨基酸被另一個(gè)中性氨基酸取代。保守氨基酸取代在本領(lǐng)域內(nèi)是公知的。本發(fā)明還涉及包含偶聯(lián)到細(xì)胞毒劑的抗體的免疫偶聯(lián)物。細(xì)胞毒劑包括化療劑、生長(zhǎng)抑制劑、毒素(例如細(xì)菌、真菌、植物或動(dòng)物來源的酶活性毒素或其片段)、放射活性同位素(即，放射性偶聯(lián)物)等。可用于產(chǎn)生所述免疫偶聯(lián)物的化療劑包括例如甲氨蝶呤、亞德里亞霉素、多柔比星、美法侖、絲裂霉素C、苯丁酸氮芥、柔紅霉素或其他嵌入劑?？捎玫拿富钚远舅丶捌淦伟ò缀鞟鏈、白喉毒素的非結(jié)合活性片段、外毒素A鏈、篦麻毒素A鏈、相思豆毒素A鏈、蒴蓮根毒素A鏈、α-帚曲菌素(a-sarcin)、油桐蛋白(Aleuritesfordii protein)、香石竹毒蛋白、垂序商陸(Phytolaca americana)蛋白(PAPI、PAPII 和PAP-S)、苦瓜抑制劑(momordica charantia inhibitor)、麻風(fēng)樹毒蛋白、巴 毒素、肥阜草抑制劑(sapaonaria officinalis inhibitor)、白樹毒蛋白、絲裂蛋白(mitogellin)、局限菌素、酹霉素、依諾霉素、和單端孢霉烯族化合物(tricothecenes)。各種放射性核素可以用于制備放射性偶聯(lián)的抗體，包括212Bi、131I、131In、9°Y和186Re?？梢允褂靡韵挛镔|(zhì)制備抗體與細(xì)胞毒劑的偶聯(lián)物各種雙官能蛋白偶聯(lián)劑如N-琥珀酰亞胺基-3-2-(吡啶二硫醇)丙酸酯(SPDP)、亞氨硫雜戊烷(IT)、亞胺酯的雙官能衍生物(如己二亞胺二甲酯HCL)、活性酯(如辛二酸二琥珀酰亞 胺酯)、醛(如戊二醛)、雙疊氮化合物(如雙(對(duì)疊氮苯甲?；?己二胺)、雙-二氮鎗衍生物(如雙_(對(duì)二氮鎗苯甲?；?_乙二胺)、二異氰酸酯(如亞甲苯基2，6- 二異氰酸酯)和雙-活性氟化合物(如1，5- 二氟-2，4- 二硝基苯)。還可以使用抗體和一種或多種小分子毒素的偶聯(lián)物，所述小分子毒素例如為刺孢霉素、美登醇(maytansinoid)、單端胞菌毒素(t richothene)和CC1065以及這些毒素的具有毒素活性的衍生物。偶聯(lián)物抗體由兩個(gè)共價(jià)連接的抗體構(gòu)成。已經(jīng)提出例如利用這樣的抗體將免疫細(xì)胞靶向到有害細(xì)胞(美國(guó)專利No. 4，676，980)。想到的是，可以使用在合成蛋白化學(xué)中已知的方法(包括涉及交聯(lián)劑的那些方法)體外制備所述抗體。例如，可以使用二硫化物交換反應(yīng)或通過形成硫醚鍵來構(gòu)建免疫毒素。用于該目的的適當(dāng)試劑的例子包括亞氨基硫醇鹽(iminothiolate)和甲基-4-疏基丁亞氨酸酯(methyl-4-mercaptobutyrimidate)。不管獲得多么有用的量，本發(fā)明的抗體可以以眾多偶聯(lián)形式(即，免疫偶聯(lián)物)或未偶聯(lián)形式中的任意一種使用。作為選擇，本發(fā)明的抗體可以以非偶聯(lián)形式或“裸露”形式使用以控制受試對(duì)象的天然防御機(jī)制，包括補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性(CDC)和抗體依賴性細(xì)胞毒性(ADCC)來消除惡性細(xì)胞。在一些實(shí)施方式中，可以使用眾多已知螯合劑中任意一種或者直接標(biāo)記，將抗體偶聯(lián)到放射線同位素如90Y>125I>131I>123I>mIn,105Rh,153Sm,67Cu,67Ga,166H0、mLu、186Re和188Re。在另外的實(shí)施方式中，所公開的組合物可包含偶聯(lián)到藥物、前藥或生物學(xué)應(yīng)答修飾劑，如甲氨蝶呤、亞德里亞霉素和淋巴因子(如干擾素)。本發(fā)明的另一些實(shí)施方式包含與特定生物毒素如篦麻毒素或白喉毒素等偶聯(lián)的抗體的應(yīng)用。在另一些實(shí)施方式中，經(jīng)修飾的抗體可以與其他免疫活性配體(例如抗體或其片段)復(fù)合，其中所得分子能夠同時(shí)結(jié)合到瘤細(xì)胞和效應(yīng)細(xì)胞如T細(xì)胞上。選擇使用偶聯(lián)或未偶聯(lián)的修飾抗體將取決于癌癥的類型和所處的階段、輔助治療(例如化學(xué)療法或外部輻射)的使用和患者的狀況。應(yīng)當(dāng)理解的是，本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本文的教導(dǎo)能夠容易地作出這樣的選擇?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域任意已知方法測(cè)定本發(fā)明的抗體的免疫特異性結(jié)合?？梢允褂玫拿庖邷y(cè)定法包括但不限于使用諸如BIAcore分析法、FACS分析法、免疫熒光法、免疫細(xì)胞化學(xué)法、Western印跡法、放射性免疫測(cè)定法、ELISA法、“夾心”免疫測(cè)定法、免疫沉淀測(cè)定法、沉淀素反應(yīng)法、凝膠擴(kuò)散沉淀素反應(yīng)法、免疫擴(kuò)散測(cè)定法、凝集測(cè)定法、補(bǔ)體固定測(cè)定法、免疫放射測(cè)定法、熒光免疫測(cè)定法和蛋白A免疫測(cè)定法等的競(jìng)爭(zhēng)性和非競(jìng)爭(zhēng)性測(cè)定系統(tǒng)。這樣的測(cè)定法是本領(lǐng)域內(nèi)常規(guī)和公知的(參見例如Ausubel等編，1994, Current Protocolsin Molecular Biology,第 I 卷，John Wiley 和 Sons, Inc. , New York,在此通過參考的方式將其全部引入)。在一些實(shí)施方式中，使用ELISA來確定針對(duì)癌干細(xì)胞標(biāo)記物的抗體的免疫特異性。ELISA測(cè)定法包括制備抗原、用抗原包被96孔滴定板的板孔，向板孔中加入偶聯(lián)到可檢測(cè)化合物如酶底物(例如辣根過氧化物酶或堿性磷酸酶)的針對(duì)癌干細(xì)胞標(biāo)記物的抗體，溫育一段時(shí)間并檢測(cè)抗原的存在。在一些實(shí)施方式中，針對(duì)癌干細(xì)胞標(biāo)記物的抗體不與可檢測(cè)化合物偶聯(lián)，而是替代性地向板孔中加入與能夠識(shí)別該針對(duì)癌干細(xì)胞標(biāo)記物的抗體的第二偶聯(lián)抗體。在一些實(shí)施方式中，不用抗原包被板孔，而是可用針對(duì)癌干細(xì)胞標(biāo)記物的抗體包被板孔并在向經(jīng)包被的板孔中加入抗原后加入與可檢測(cè)化合物偶聯(lián)的第二抗體。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)知道可加以改變而加強(qiáng)被檢測(cè)信號(hào)的參數(shù)以及本領(lǐng)域已知的ELISA變量(參見例如 Ausubel 等編，1994, Current Protocols in Molecular Biology,第 I 卷，JohnWiley 和 Sons, Inc.，New York,于 11. 2. I)?？梢酝ㄟ^競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合測(cè)定法來確定抗體與癌干細(xì)胞標(biāo)記物抗原的結(jié)合親和性和抗體-抗原相互作用的解離速率。競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合測(cè)定法的一個(gè)例子是放射性免疫測(cè)定法，該方法包括在存在含量不斷增加的未標(biāo)記抗原的情況下，將經(jīng)標(biāo)記的抗原(例如3H或125I)或其片段或變體與感興趣的抗體溫育，然后檢測(cè)結(jié)合到經(jīng)標(biāo)記的抗原的抗體?？梢愿鶕?jù)scatchard作圖分析數(shù)據(jù)確定針對(duì)癌干細(xì)胞標(biāo)記物的抗體的親和性和結(jié)合解離速率。在某些實(shí)施方式中，使用BIAcore動(dòng)力學(xué)分析來確定針對(duì)癌干細(xì)胞標(biāo)記物的抗體的結(jié)合和解離速率。BIAcore動(dòng)力學(xué)分析包括分析抗體與表面上固定有癌干細(xì)胞標(biāo)記物抗原的芯片的結(jié)合和解離。在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明涵蓋分離的多核苷酸，該多核苷酸編碼含有抗人類FZD 受體的抗體或其片段的多肽。因此，術(shù)語(yǔ)“編碼多肽的多核苷酸”涵蓋包含僅該多肽的編碼序列的多核苷酸和包含額外的編碼序列和/或非編碼序列的多核苷酸。本發(fā)明的多核苷酸可以為RNA形式或DNA形式。DNA包括cDNA、基因組DNA和合成DNA ;并且可以是雙鏈或單鏈，如果是單鏈，其可以是編碼鏈或非編碼鏈(反義鏈)。本發(fā)明還涉及以上所述編碼例如片段、類似物和衍生物的多核苷酸的變體。多核苷酸的變體可以是該多核苷酸天然存在的等位基因變體或該多核苷酸的非天然存在的變體。在某些實(shí)施方式中，多核苷酸可以具有這樣的編碼序列，該編碼序列是所公開的多肽的編碼序列的天然存在的等位基因變體。如本領(lǐng)域已知的，等位基因變體是多核苷酸序列的具有例如一個(gè)或多個(gè)核苷酸的取代、缺失或添加但是沒有明顯改變所編碼多肽的功能的替代性形式。在某些實(shí)施方式中，多核苷酸包含成熟多肽的編碼序列，該編碼序列在同一閱讀框中融合有有助于例如在宿主細(xì)胞中表達(dá)和分泌多肽的多核苷酸(例如用作控制多肽從細(xì)胞中轉(zhuǎn)運(yùn)的分泌序列的前導(dǎo)序列)。具有前導(dǎo)序列的多肽是一種前體蛋白，可具有被宿主細(xì)胞切除的前導(dǎo)序列以形成成熟形式的多肽。多核苷酸還可以編碼這樣的前體蛋白，該前體蛋白是成熟蛋白加上額外的5'端氨基酸殘基。具有前體序列的成熟蛋白是一種前體蛋白，并且是一種非活性形式的蛋白。切除前體序列后，留下的即是具有活性的成熟蛋白。在某些實(shí)施方式中，多核苷酸包含成熟多肽的編碼序列，該編碼序列在同一閱讀框中融合有可以用于例如純化所編碼多肽的標(biāo)記序列。例如，在細(xì)菌宿主的情況中，該標(biāo)記序列可以是由PQE-9載體提供的六組氨酸標(biāo)簽以純化與該標(biāo)記融合的成熟蛋白，或者，當(dāng)使用哺乳動(dòng)物宿主(例如C0S-7細(xì)胞)時(shí)，該標(biāo)記序列可以是源自于流感血凝素蛋白的血凝素(HA)標(biāo)簽。在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了分尚的核酸分子，該核酸分子與編碼含有抗人類FZD受體的抗體或其片段的多肽的多核苷酸具有至少80%的同一性、至少85%的同一性、至少90%的同一性、至少95%的同一性，在一些實(shí)施方式中，具有至少96%、97%、98%或99%的同一性。
具有與對(duì)照核苷酸序列的“同一性”為例如至少95%的核苷酸序列的多核苷酸是指，除了多核苷酸序列可包含至多5個(gè)點(diǎn)突變/100個(gè)對(duì)照核苷酸序列的核苷酸之外，多核苷酸的核苷酸序列與對(duì)照序列是相同的。換言之，為了獲得具有與對(duì)照核苷酸序列的同一性為至少95%的核苷酸序列的多核苷酸，對(duì)照序列中至多有5%的核苷酸可以缺失或被另外的核苷酸取代，或者占對(duì)照序列中總核苷酸的至多5%的數(shù)量的核苷酸可以插入到對(duì)照序列中。對(duì)照序列的這些突變可以發(fā)生在對(duì)照核苷酸序列的氨基末端位置或羧基末端位置，或者這些末端位置之間的任意位置，或者單個(gè)地散布在對(duì)照序列的核苷酸之中，或者以一個(gè)或多個(gè)相鄰的組散布在對(duì)照序列中。作為一種實(shí)際情況，可以使用已知的計(jì)算機(jī)程序如Bestfit程序(WisconsinSequence Analysis Package,用于 Unix 的第 8 個(gè)版本，Genetics Computer Group,University Research Park, 575Science Drive, Madison, WI 53711),按常規(guī)方法確定任何特定核苷酸分子是否與對(duì)照序列具有至少80%的同一性、至少85%的同一性、至少90%的同一性，在一些實(shí)施方式中，是否具有至少95%、96%、97%、98%或99%的同一性。Bestfit使用 Smith 和 Waterman (Advances in Applied Mathematics 2 :482489 (1981))的局部同源 性算法來找到兩條序列之間的最優(yōu)同源性片段。當(dāng)使用Bestfit或其他任意的序列比對(duì)程序來確定一條特定的序列是否與本發(fā)明的對(duì)照序列具有例如95%的同一性時(shí)，參數(shù)設(shè)置使得可在全長(zhǎng)的對(duì)照核苷酸序列上計(jì)算同一性百分比并允許有占對(duì)照序列的核苷酸總數(shù)的至多5%的同源性缺口。多核苷酸變體可以在編碼區(qū)和/或非編碼區(qū)中含有變化。在一些實(shí)施方式中，多核苷酸變體含有產(chǎn)生沉默取代、添加或缺失但不改變所編碼多肽的性能或活性的變化。在一些實(shí)施方式中，核苷酸變體利用遺傳密碼子的簡(jiǎn)并性由沉默取代產(chǎn)生?？梢愿鶕?jù)各種理由，例如優(yōu)化用于特定宿主的密碼子表達(dá)(將人類mRNA中的密碼子改變?yōu)榧?xì)菌宿主如大腸桿菌偏好的那些密碼子)來產(chǎn)生多核苷酸變體。本發(fā)明的多肽可以是包含抗人類FZD受體的抗體或其片段的重組多肽、天然多肽或合成多肽。本領(lǐng)域中應(yīng)當(dāng)知道的是，可以改變本發(fā)明的某些氨基酸序列而沒有明顯影響蛋白的結(jié)構(gòu)和功能。因此，本發(fā)明還包括顯示出基本活性的多肽變體或者包含抗人類FZD受體蛋白的抗體或其片段的區(qū)域的多肽變體。這樣的突變體包括缺失、插入、倒位、重復(fù)以及各種類型的取代。多肽和類似物可以被進(jìn)一步修飾以含有額外的化學(xué)部分(蛋白的非常見部分)。這些衍生部分可以提高蛋白的溶解度、生物學(xué)半衰期或吸收性。所述部分還可以減少或消除蛋白等的任意所需的副作用。有關(guān)這些部分的綜述可以在REMINGTON' SPHARMACEUTICAL SCIENCES，第 20 版，Mack Publishing Co. , Easton, PA(2000)找到。本文所述的分離的多肽可以通過本領(lǐng)域已知的任意適當(dāng)?shù)姆椒ㄖ苽?。所述方法包括從直接蛋白合成法乃至?gòu)建編碼該分離的多肽序列的DNA序列并將這些序列表達(dá)在適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)化宿主中表達(dá)。在一些實(shí)施方式中，通過或合成編碼感興趣的野生型蛋白的DNA序列，利用重組技術(shù)構(gòu)建DNA序列?？蛇x的是，可以通過定點(diǎn)誘變來誘變所述序列以提供該序列的功能類似物(參見例如Zoeller等，Proc. Nat' I. Acad. Sci. USA81 :5662 5066 (1984)和美國(guó)專利 No. 4，588，585)。在一些實(shí)施方式中，使用寡核苷酸合成儀通過化學(xué)合成來構(gòu)建編碼感興趣的多肽的DNA序列。這樣的寡核苷酸可以基于所需多肽的氨基酸序列進(jìn)行設(shè)計(jì)并選擇用以生成感興趣的重組多肽的宿主細(xì)胞偏好的那些密碼子?？梢詰?yīng)用標(biāo)準(zhǔn)方法來合成編碼感興趣的分離的多肽的分離的多核苷酸序列。例如，可以使用完整的氨基酸序列來構(gòu)建反翻譯的基因(back-translated gene)。另外,可以合成含有用于編碼分離的特定多肽的核苷酸序列的DNA寡聚體。例如，可以合成用于編碼所需多肽的各部分的數(shù)條短的寡核苷酸然后進(jìn)行連接。各條寡核苷酸通常含有用于互補(bǔ)組裝的5'或3'突出末端。一旦組裝(通過合成、定位誘變或其他方法)，編碼感興趣的分離的特定多肽的多核苷酸序列就被插入到表達(dá)載體中，并被可操縱地連接到適用于使所述蛋白在所需宿主中表達(dá)的表達(dá)控制序列?？梢酝ㄟ^核苷酸測(cè)序、限制圖譜、生物活性多肽在適當(dāng)?shù)乃拗髦械谋磉_(dá)來證實(shí)組裝的正確性。如本領(lǐng)域所公知的，為了在宿主中獲得轉(zhuǎn)染基因的高表達(dá)水平，該基因必須可操縱地連接到在所選表達(dá)宿主中具有功能的轉(zhuǎn)錄和翻譯表達(dá)控制序列上。使用重組表達(dá)載體來擴(kuò)增和表達(dá)編碼癌干細(xì)胞標(biāo)記物多肽融合體的DNA。重組表達(dá)載體是可復(fù)制DNA構(gòu)建體，其具有編碼癌干細(xì)胞標(biāo)記物多肽融合體或生物等效類似物的合成DNA片段或cDNA來源的DNA片段，所述融合體或生物等效類似物可操縱地連接到來自 于哺乳動(dòng)物、微生物、病毒或昆蟲基因的適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)錄或翻譯調(diào)節(jié)元件。轉(zhuǎn)錄單元一般包括以下物質(zhì)的組裝體(I)在基因表達(dá)中具有調(diào)節(jié)作用的一個(gè)或多個(gè)基因元件，例如轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子或增強(qiáng)子，(2)轉(zhuǎn)錄成mRNA和翻譯成蛋白的結(jié)構(gòu)或編碼序列，和(3)適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)錄和翻譯啟始和終止序列，如上文所詳細(xì)描述的序列。這樣的調(diào)節(jié)元件可以包括控制轉(zhuǎn)錄的操縱子序列?？梢灶~外引入在宿主中復(fù)制的能力(一般由復(fù)制起點(diǎn)提供)和便于識(shí)別轉(zhuǎn)化體的選擇基因。當(dāng)各DNA區(qū)在功能上相互關(guān)聯(lián)時(shí)，將它們可操縱地進(jìn)行連接。例如，在其作為參與多肽分泌的前體表達(dá)時(shí)，信號(hào)肽序列(分泌性前導(dǎo)序列)的DNA被可操縱地連接到多肽的DNA上；在啟動(dòng)子控制序列轉(zhuǎn)錄時(shí)，啟動(dòng)子被可操縱地連接到編碼序列上；或者在核糖結(jié)合位點(diǎn)被定位以允許翻譯時(shí)，核糖結(jié)合位點(diǎn)被可操縱地連接到編碼序列上。通常，可操縱地連接意味著是相鄰的，并且在分泌性前導(dǎo)序列的情況中意味著相鄰的且位于閱讀框內(nèi)。擬用在酵母表達(dá)系統(tǒng)中的結(jié)構(gòu)元件包括能夠使得宿主細(xì)胞進(jìn)行所翻譯的蛋白的胞外分泌的前導(dǎo)序列。作為選擇，在表達(dá)重組蛋白而無(wú)需前導(dǎo)序列或轉(zhuǎn)運(yùn)序列的情況下，所述結(jié)構(gòu)元件可以包括N-末端甲硫氨酸殘基。該殘基隨后可以任選從所表達(dá)的重組蛋白上切除以提供最終的產(chǎn)物。表達(dá)控制序列和表達(dá)載體的選擇取決于宿主的選擇?？梢圆捎煤芏嗖煌谋磉_(dá)宿主和/或載體組合。用于真核宿主的有用表達(dá)載體包括例如含有來自SV40、牛乳頭狀瘤病毒、腺病毒和巨細(xì)胞病毒的表達(dá)控制序列的載體。用于細(xì)菌宿主的有用病毒載體包括已知的細(xì)菌質(zhì)粒(如來自大腸桿菌的質(zhì)粒，包括pCRl、pBR322、pMB9及其衍生物)、大范圍宿主質(zhì)粒(如M13)和絲狀單鏈DNA噬菌體。適用于表達(dá)癌干細(xì)胞標(biāo)記物蛋白的宿主細(xì)胞包括在適當(dāng)啟動(dòng)子控制下的原核生物、酵母和昆蟲或高級(jí)真核生物細(xì)胞。原核生物包括革蘭氏陰性生物體或革蘭氏陽(yáng)性生物體，例如大腸桿菌或桿菌屬細(xì)菌(bacilli)。高級(jí)真核生物細(xì)胞包括如下文所述的哺乳動(dòng)物來源的已確立的細(xì)胞系。也可以采用無(wú)細(xì)胞翻譯系統(tǒng)。細(xì)菌、真菌、酵母和哺乳動(dòng)物細(xì)胞宿主適用的克隆和表達(dá)載體是Pouwels等所述的載體(Cloning Vectors A LaboratoryManual, Elsevier, N. Y.，1985)，在此通過參考的方式引入其相關(guān)的公開內(nèi)容。
可以有利地采用各種哺乳動(dòng)物或昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)來表達(dá)重組蛋白?？梢栽诓溉閯?dòng)物細(xì)胞中表達(dá)重組蛋白，因?yàn)檫@樣的蛋白一般能夠正確地折疊、適當(dāng)?shù)男揎棽⒕哂型暾墓δ?。適當(dāng)?shù)牟溉閯?dòng)物宿主細(xì)胞系的例子包括如Gluzman (Cell 23 =175,1981)所述的猴腎細(xì)胞的C0S-7細(xì)胞系和能夠表達(dá)適當(dāng)載體的其他細(xì)胞系，例如L細(xì)胞、C127、3T3、中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)、HeLa和BHK細(xì)胞系。哺乳動(dòng)物表達(dá)載體可以包含連接到待表達(dá)基因的非轉(zhuǎn)錄元件如復(fù)制起點(diǎn)、適當(dāng)?shù)膯?dòng)子和增強(qiáng)子、和其他5'或3'側(cè)翼非轉(zhuǎn)錄序列以及5'或
3,非翻譯序列，如必需的核糖體結(jié)合位點(diǎn)、多腺苷酸化位點(diǎn)、剪切供體和受體位點(diǎn)以及轉(zhuǎn)錄終止序列。用于在昆蟲細(xì)胞中產(chǎn)生異源蛋白的桿狀病毒系統(tǒng)由Luckow和Smnmers (Bio/Technology 6 :47(1988))所概述?？梢愿鶕?jù)任意適當(dāng)?shù)姆椒兓赊D(zhuǎn)化宿主產(chǎn)生的蛋白。這樣的標(biāo)準(zhǔn)方法包括色譜法(例如離子交換色譜法、親和色譜法和分級(jí)柱色譜法)、離心法、差異溶解度法或用于蛋白純化的任意其他標(biāo)準(zhǔn)方法?？梢詫⒅T如六組氨酸、麥芽糖結(jié)合域、流感被膜序列(influenza coat sequence)和谷胱甘肽_S_轉(zhuǎn)移酶連接到蛋白上以易于通過適當(dāng)親和柱 進(jìn)行純化。還可以適用蛋白水解、核磁共振和X射線晶體法等技術(shù)對(duì)所分離的蛋白進(jìn)行物理表征。例如，首先可以使用可商購(gòu)獲得的蛋白濃縮過濾器例如Amicon或MilliporePellicon超濾單元來濃縮來自將重組蛋白分泌到培養(yǎng)基中的系統(tǒng)的上清液。在濃縮步驟之后，可以將濃縮液加到適當(dāng)?shù)募兓橘|(zhì)中。作為選擇，可以采用陰離子交換樹脂，例如懸附有二乙基氨基乙基(DEAE)基團(tuán)的基質(zhì)或基材?；|(zhì)可以是丙烯酰胺、瓊脂糖、葡聚糖、纖維素或在蛋白純化中常用的其他類型。作為選擇，可以采用陽(yáng)離子交換步驟。適當(dāng)?shù)年?yáng)離子交換劑包括含有磺基丙基或羧基甲基的各種不溶性基質(zhì)。最后，可以采用使用疏水性反相高效液相色譜(RP-HPLC)介質(zhì)(例如具有懸附的甲基或其他脂肪族基團(tuán)的硅膠)的一個(gè)或多個(gè)反相高效液相色譜步驟的來進(jìn)一步純化癌干細(xì)胞蛋白-Fe組合物。也可以采用某些或所有前述純化步驟的各種組合來提供同源性重組蛋白?？梢酝ㄟ^從細(xì)胞沉淀中的初始提取，然后進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)濃縮、鹽析、水性離子交換或尺寸排阻色譜步驟來分離細(xì)菌培養(yǎng)物中生成的重組蛋白。高效液相色譜(HPLC)可以用來進(jìn)行最后的純化步驟。表達(dá)重組蛋白所用的微生物細(xì)胞可以通過任何常規(guī)方法來破碎，所述方法包括循環(huán)凍融法、超聲處理法、機(jī)械破碎法或使用細(xì)胞裂解劑的方法。本發(fā)明提供了抑制表達(dá)癌干細(xì)胞標(biāo)記物的致瘤性細(xì)胞的生長(zhǎng)的方法，該方法使用抗本文所述的癌干細(xì)胞標(biāo)記物的抗體。在某些實(shí)施方式中，抑制表達(dá)癌干細(xì)胞標(biāo)記物的致瘤性細(xì)胞的生長(zhǎng)的所述方法包括在體外使所述細(xì)胞與抗癌干細(xì)胞標(biāo)記物的抗體接觸。例如，將表達(dá)癌干細(xì)胞標(biāo)記物的永生化細(xì)胞系或癌細(xì)胞系培養(yǎng)在培養(yǎng)基中，該培養(yǎng)基添加有抗所表達(dá)的癌干細(xì)胞標(biāo)記物的抗體以抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)。在一些實(shí)施方式中，從例如組織活檢樣品、胸腔積液或血液樣品等患者樣品中分離出含有腫瘤干細(xì)胞的腫瘤細(xì)胞，并將其培養(yǎng)在添加有針對(duì)癌干細(xì)胞標(biāo)記物的抗體的培養(yǎng)基中以抑制細(xì)胞生長(zhǎng)。在一些實(shí)施方式中，抑制表達(dá)癌干細(xì)胞標(biāo)記物的致瘤性細(xì)胞的生長(zhǎng)的方法包括在體內(nèi)使所述細(xì)胞與針對(duì)癌干細(xì)胞標(biāo)記物的抗體接觸。在某些實(shí)施方式中，在動(dòng)物模型中使致瘤性細(xì)胞與針對(duì)癌干細(xì)胞標(biāo)記物的抗體接觸。例如，將表達(dá)癌干細(xì)胞標(biāo)記物的異種外植體生長(zhǎng)在免疫受損的小鼠(例如N0D/SCID小鼠)中，該小鼠被施用針對(duì)癌干細(xì)胞標(biāo)記物的抗體以抑制腫瘤的生長(zhǎng)。在一些實(shí)施方式中，從例如組織活檢樣品、胸腔積液或血液樣品等患者樣品中分離出表達(dá)癌干細(xì)胞標(biāo)記物的癌干細(xì)胞，并將其注射到免疫受損的小鼠中，然后對(duì)該小鼠施用針對(duì)癌干細(xì)胞標(biāo)記物的抗體以抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。在一些實(shí)施方式中，在將致瘤性細(xì)胞導(dǎo)入動(dòng)物中的同時(shí)或之后的短時(shí)間內(nèi)施用針對(duì)癌干細(xì)胞標(biāo)記物的抗體以防止腫瘤的生長(zhǎng)。在一些實(shí)施方式中，在致瘤性細(xì)胞已生長(zhǎng)到一定尺寸之后施用針對(duì)癌干細(xì)胞標(biāo)記物的抗體作為治療物。本發(fā)明還提供了包含靶向癌干細(xì)胞標(biāo)記物的抗體的藥物組合物。所述藥物組合物可以用于抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和治療人類患者中的癌癥。通過將本發(fā)明的純化抗體與藥學(xué)可接受的載質(zhì)(例如載體、賦形劑)組合來制備用于保存和使用的制劑(Remington, The Science and Practice of Pharmacy (第 20 版)Mack Publishing，2000)。適當(dāng)?shù)乃帉W(xué)可接受的載質(zhì)包括但不限于非毒性緩沖劑，如磷酸鹽、檸檬酸鹽和其他有機(jī)酸；諸如氯化鈉等鹽；抗氧化劑，包括抗壞血酸和甲硫氨酸 ’防腐 劑(例如十八烷基二甲基芐基氯化銨；氯化六甲雙銨；苯扎氯銨；芐索氯銨；苯酚、丁醇或苯甲醇；對(duì)羥基苯甲酸烷基酯，如對(duì)羥基苯甲酸甲酯或?qū)αu基苯甲酸丙酯；鄰苯二酚；間苯二酚；環(huán)己醇；3-戊醇；和間甲酚)；低分子量多肽(例如小于約10個(gè)氨基酸殘基)；蛋白，如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、組氨酸、精氨酸或賴氨酸；碳水化合物，如單糖、二糖、葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，如EDTA ;糖，如蔗糖、麥芽糖醇、海藻糖或山梨糖醇；成鹽抗衡離子，如鈉；金屬絡(luò)合物(例如Zn-蛋白絡(luò)合物)；和非離子表面活性劑，如TWEEN或聚乙二醇(PEG)。本發(fā)明的藥物組合物可以以眾多方式中的任一種方式施用以用于局部治療或全身治療。施用可以是局部施用(例如粘膜施用，包括陰道輸送和直腸輸送)，如采用透皮貼劑，軟膏劑、洗劑、乳膏劑、凝膠劑、滴劑、栓劑、噴霧劑、液劑和粉劑的施用；肺部施用(例如通過粉末或氣溶膠的吸入或吹入，包括使用噴霧器的施用；氣管內(nèi)、鼻內(nèi)、表皮和透皮施用)；口服施用；或胃腸外施用，包括靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、皮下、腹膜內(nèi)或肌肉內(nèi)的注射或輸注；或顱內(nèi)(例如鞘內(nèi)或腦室內(nèi))施用。所述治療制劑可以是單位劑量形式。所述制劑包括用于口服、腸胃外施用、直腸施用或通過吸入施用的片劑、丸劑、膠囊劑、粉劑、顆粒劑、在水中或非水性介質(zhì)中的溶液劑或懸浮劑、或者栓劑。在諸如片劑等固體組合物中，可以將基本活性組分與藥物載體混合。常規(guī)壓片成分包括玉米淀粉、乳糖、蔗糖、山梨糖醇、滑石、硬脂酸、硬脂酸鎂、磷酸氫二鈣或樹膠，以及其他稀釋劑(例如水)，以形成含有本發(fā)明化合物或其非毒性藥學(xué)可接受的鹽的均相混合物的固體前制劑組合物。然后將所述固體前制劑組合物再分為上述類型的單位劑量形式?？梢詫?duì)所述新型組合物的片劑、丸劑等進(jìn)行包衣，或者進(jìn)行其他方式的復(fù)合而提供具有長(zhǎng)效優(yōu)點(diǎn)的劑量形式。例如，所述片劑或丸劑可以包含由外部組分包被的內(nèi)部組合物。而且，所述兩種組分可以由腸衣層隔開，該腸衣層起到耐崩解并使內(nèi)部組分能夠完好地通過胃部或者延緩釋放。有各種材料可以用于所述腸衣層或包衣，這樣的材料包括眾多聚合酸和聚合酸的混合物，這樣的材料例如為紫膠、十六烷基醇和醋酸纖維素。藥物制劑包括與脂質(zhì)體(Epstein,等，1985,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 :3688 ；Hwang 等，1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 :4030 ;和美國(guó)專利 4，485，045 和 4，544，545)絡(luò)合的本發(fā)明抗體。具有延長(zhǎng)的循環(huán)時(shí)間的脂質(zhì)體公開在美國(guó)專利5，013，556中。有些脂質(zhì)體可以通過使用包含磷脂酰膽堿、膽固醇和PEG衍生的磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)的液體組合物的反相蒸發(fā)來制備。脂質(zhì)體可以通過具有確定的孔徑的過濾器擠出而獲得具有所需直徑的脂質(zhì)體。所述抗體還可以包載在微囊中。這樣的微囊例如通過凝聚技術(shù)或通過界面聚合來制備，例如分別為在膠質(zhì)藥物輸送系統(tǒng)(例如，脂質(zhì)體、白蛋白微球體、微乳、納米顆粒和納米囊)或大乳液中的羥基甲基纖維素或明膠-微囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微囊，如在Remington, The Science and Practice of Pharmacy (第 20 版)Mack Publishing(2000)中所述。此外，可以制備緩釋制劑。緩釋制劑的適當(dāng)例子包括含有所述抗體的固體疏水性聚合物的半透性基質(zhì)，所述基質(zhì)為成型品形式(例如膜或微囊)。緩釋基質(zhì)的例子包括聚酯、水凝膠(例如聚(甲基丙烯酸-2-羥基乙基酯)或聚(乙烯醇))、聚交酯(美國(guó)專利3，773，919)、L-谷氨酸和7-乙基-L-谷氨酸酯的共聚物、非降解性乙烯-乙酸乙烯酯、降解性乳酸-乙醇酸共聚物(如LUPRON DEPOT TM(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林組成的可注射微球體))、乙酸異丁酸蔗糖酯和聚-D- (-) -3-羥基丁酸。 在某些實(shí)施方式中，治療包括本發(fā)明抗體和化療劑或多種不同化療劑的混合物的聯(lián)合施用。施用抗體進(jìn)行的治療可以在施用化療藥物之前、同時(shí)或之后進(jìn)行。本發(fā)明想到的化療藥物包括本領(lǐng)域已知并且可以商購(gòu)獲得的化學(xué)物質(zhì)或藥物，例如多柔比星、5-氟尿嘧啶、阿糖胞苷(“Ara-C”)、環(huán)磷酰胺、塞替派、白消安、細(xì)胞毒素(Cytoxin)、泰素、甲氨蝶呤、順鉬、美法侖、長(zhǎng)春堿和卡鉬。聯(lián)合施用可以包括共施用和依次施用，所述共施用可以是單個(gè)藥物制劑的施用，也可以是使用分開的制劑的施用，所述依次施用可以是以任意順序的施用，但通常是在一定的時(shí)間內(nèi)施用以使所有的活性劑能夠同時(shí)發(fā)揮它們的生物活性。所述化療劑的制劑和劑量給藥方案可以根據(jù)制造商的說明書使用，或者由本領(lǐng)域熟練從業(yè)者根據(jù)經(jīng)驗(yàn)確定。化療藥物的制劑和劑量方案在Chemotherapy Service Ed. ,M. C. Perry,Williams 和 Wilkins, Baltimore, Md. (1992)中也有描述。在另外的實(shí)施方式中，治療包括本發(fā)明抗體和放射療法的聯(lián)合施用。施用抗體進(jìn)行的治療可以在施用放射療法之前、同時(shí)或之后進(jìn)行?？梢允褂帽绢I(lǐng)域熟練從業(yè)者確定的所述放射療法的任何劑量給藥方案。在另外的實(shí)施方式中，治療可以包括本發(fā)明抗體和抗另外腫瘤相關(guān)抗原的其他抗體的聯(lián)合施用，所述其他抗體包括但不限于與EGFR、HER2和VEGF結(jié)合的抗體。而且治療可以包括一種或多種細(xì)胞因子的施用，該治療可以伴隨癌細(xì)胞的手術(shù)去除或治療醫(yī)生認(rèn)為必要的其他治療。對(duì)于疾病的治療，本發(fā)明抗體的適當(dāng)劑量取決于待治療疾病的類型、疾病的嚴(yán)重性和疾病的進(jìn)程、疾病的響應(yīng)性、施用該抗體的目的是治療性目的還是預(yù)防性目的、先前的療法、患者的臨床病史等，所有這些都根據(jù)治療醫(yī)生的判斷?？贵w可以施用一次，也可以在持續(xù)數(shù)天至數(shù)月的系列治療中施用，或直至實(shí)現(xiàn)痊愈或者達(dá)到疾病狀態(tài)的消減(例如腫瘤尺寸的減小)。優(yōu)化劑量方案可以根據(jù)患者體內(nèi)的藥物累積確定結(jié)果來計(jì)算，并且可以根據(jù)個(gè)別抗體的相對(duì)效力的不同而改變。主治醫(yī)生可以容易地確定最優(yōu)劑量、劑量給藥方法和重復(fù)頻率。劑量通常為0. 01 μ g 100mg/kg體重,并且可以每天、每周、每月或每年施用一次或多次。主治醫(yī)生可以根據(jù)藥物在體液或組織中的滯留時(shí)間和濃度來估算劑量給藥的重復(fù)頻率。本發(fā)明提供了包含本文所述抗體并可以用以實(shí)施本文所述方法的試劑盒。在某些實(shí)施方式中，所述試劑盒包含位于一個(gè)或多個(gè)容器中的針對(duì)癌干細(xì)胞標(biāo)記物的至少一種純化抗體。在一些實(shí)施方式中，所述試劑盒包含進(jìn)行檢測(cè)測(cè)定必需的和/或足以進(jìn)行該檢測(cè)測(cè)定的所有組分，包括所有的對(duì)照、進(jìn)行測(cè)定的說明以及用于結(jié)果分析和呈現(xiàn)的任何必需軟件。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)容易地知道，本發(fā)明公開的抗體可以容易地加入到本領(lǐng)域公知的已確立的試劑盒形式之一中。本發(fā)明所公開的實(shí)施方式可以參考以下實(shí)施例進(jìn)行進(jìn)一步的說明，所述實(shí)施例詳細(xì)地描述了本發(fā)明所公開的抗體的制備以及使用本發(fā)明所公開的抗體的方法。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道，可以在不脫離本公開內(nèi)容范圍的情況下對(duì)材料和方法進(jìn)行諸多改變。相同的附圖標(biāo)記在整個(gè)附圖中都盡可能地表示相同或相似的對(duì)象。實(shí)施例實(shí)施例IFZD抗體的制備抗原制備將人類FZD受體的胞外域的重組多肽片段制備為用于抗體制備的抗原。使用標(biāo)準(zhǔn)重組DNA技術(shù)來分離編碼FZDlO的第I 227個(gè)氨基酸(SEQ ID NO I)、FZD7的第I 255個(gè)氨基酸(SEQ ID NO 2)、FZD5的第I 233個(gè)氨基酸(SEQ ID NO. 3)、FZD6的第I 207個(gè)氨基酸(SEQ ID NO 4)、FZD4的第I 224個(gè)氨基酸(SEQ ID NO 5)和FZD8的第I 158個(gè)氨基酸(SEQ ID NO 6)的多核苷酸。這些多核苷酸以框內(nèi)N末端連接到人類Fe標(biāo)簽或組氨酸標(biāo)簽上，并克隆到轉(zhuǎn)運(yùn)質(zhì)粒載體中，以在昆蟲細(xì)胞中進(jìn)行桿狀病毒介導(dǎo)的表達(dá)。使用標(biāo)準(zhǔn)的轉(zhuǎn)染、感染和細(xì)胞培養(yǎng)程序來制得表達(dá)相應(yīng)FZD多肽的重組昆蟲細(xì)胞(O' Reilley
Baculovirus expression vectors A Laboratory Manual,Oxford 0xford UniversityPress (1994))。使用切割預(yù)測(cè)軟件SignalP 3. O模擬勾畫人類FZD受體的內(nèi)源性信號(hào)序列的切害I]，但是實(shí)際的體內(nèi)切割點(diǎn)可能由于氨基酸偶聯(lián)或定向而不同。FZD10的預(yù)測(cè)切割位于第20 21個(gè)氨基酸之間，因此FZD10抗原蛋白包含約第21個(gè)氨基酸 第227個(gè)氨基酸。FZD7的預(yù)測(cè)切割位于第31 32個(gè)氨基酸之間，因此FZD7抗原蛋白包含約第32個(gè)氨基酸 第255個(gè)氨基酸。FZD5的預(yù)測(cè)切割位于第26 27個(gè)氨基酸之間，因此FZD5抗原蛋白包含約第27個(gè)氨基酸 第233個(gè)氨基酸。FZD6的預(yù)測(cè)切割位于第17 18個(gè)氨基酸之間，因此 FZD6抗原蛋白包含約第18個(gè)氨基酸 第207個(gè)氨基酸。FZD4的預(yù)測(cè)切割位于第39 40個(gè)氨基酸之間，因此FZD4抗原蛋白包含約第40個(gè)氨基酸 第224個(gè)氨基酸。FZD8的預(yù)測(cè)切割位于第27 28個(gè)氨基酸之間，因此FZD8抗原蛋白包含約第28個(gè)氨基酸 第158個(gè)氨基酸。使用蛋白A和Ni++螯合劑親和色譜法從昆蟲細(xì)胞條件介質(zhì)(conditionedmedium)中純化出抗原蛋白。利用PBS(pH=7)將經(jīng)純化的抗原蛋白透析、濃縮至lmg/ml,并在免疫用制劑中過濾滅菌。免疫用經(jīng)純化的FZD10、FZD7、FZD5、FZD6、FZD4 和 FZD8 抗原蛋白(抗體溶液；MountainView, CA)按照標(biāo)準(zhǔn)的技術(shù)免疫小鼠(n=3)。在初免后約70天，采用ELISA和FACS分析來篩查個(gè)體小鼠的血液的抗原識(shí)別(如下詳述)。選擇抗體滴度最高的兩只動(dòng)物進(jìn)行最后的抗原加強(qiáng)(antigen boost),之后分離出脾細(xì)胞用于雜交瘤制備。雜交瘤細(xì)胞在96孔板中按I個(gè)細(xì)胞/孔鋪板，通過針對(duì)抗原蛋白的ELISA和FACS分析篩查每個(gè)板孔的上清液。選擇數(shù)個(gè)抗體滴度高的雜交瘤并在靜態(tài)瓶裝培養(yǎng)物中擴(kuò)大培養(yǎng)。使用蛋白A或蛋白G瓊脂糖色譜法從雜交瘤上清液純化出抗體。純化的單克隆抗體用FACS再次測(cè)試并進(jìn)行同種型分析以選擇IgG和IgM抗體。表位作圖為了鑒定能夠識(shí)別包含富含半胱氨酸域的FZD胞外域的特定區(qū)域的抗體，進(jìn)行表位作圖。使用標(biāo)準(zhǔn)重組DNA技術(shù)，制備在編碼FZD胞外域的片段的多核苷酸上游包含CMV啟動(dòng)子的哺乳動(dòng)物表達(dá)質(zhì)粒載體。然后利用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，將重組蛋白表達(dá)在所培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染后24 48小時(shí)，收獲細(xì)胞，并在SDS-PAGE丙烯酰胺凝膠上分離細(xì)胞裂解蛋白，以使用來自經(jīng)FZD抗原免疫的小鼠的抗體進(jìn)行Western印跡?？梢杂肳nt蛋白通過 ELISA進(jìn)一步分析識(shí)別FZD的配體結(jié)合域的抗體的競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合。為了鑒定胞外域中為抗FZD的抗體所識(shí)別的特定表位，使用了 SPOT系統(tǒng)(SigmaGenosys, The Woodlands, TX)。采用SPOT合成技術(shù),合成由一個(gè)氨基酸重疊的并覆蓋整個(gè)FZD胞外域的一系列十殘基線性肽，并將其共價(jià)結(jié)合到纖維素膜上。所述膜在室溫下與封閉緩沖液一起預(yù)溫育8小時(shí)，并用抗體在4°C雜交過夜。然后洗膜、與偶聯(lián)有辣根過氧化物酶(HRP) (Amersham Bioscience, Piscataway, NJ)的二抗溫育、再洗并用含有 3_ 氨基 _9_ 乙基咔唑的信號(hào)顯色液使之可視。由此確定被抗體識(shí)別的特定表位。FACS 分析為了選擇由雜交瘤克隆生成的識(shí)別天然細(xì)胞表面FZD蛋白的單克隆抗體，采用了FACs分析。HEK293細(xì)胞單獨(dú)用編碼相應(yīng)FZD (FZDlO)的全長(zhǎng)cDNA克隆的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染或用該表達(dá)載體與表達(dá)GFP的載體(FZD7、FZD5、FZD6、FZD4和FZD8)共轉(zhuǎn)染。在FZD10、FZD7、FZD6和FZD4表達(dá)載體的情況中，F(xiàn)lag表位標(biāo)簽在氨基末端導(dǎo)入，使得可以驗(yàn)證帶標(biāo)簽的FZD受體在細(xì)胞表面上的表達(dá)。轉(zhuǎn)染后24 48小時(shí)，將細(xì)胞收集到懸浮液中并在冰上與抗FZD抗體、FLAG抗體、免疫血清(用于FZD5表達(dá)細(xì)胞)或用以檢測(cè)背景抗體結(jié)合的對(duì)照IgG溫育。洗滌細(xì)胞，用偶聯(lián)有熒光發(fā)色團(tuán)的抗小鼠二抗檢測(cè)一抗。然后通過FACS分選所標(biāo)記的細(xì)胞，以鑒定特異性識(shí)別相應(yīng)FZD受體的細(xì)胞表面表達(dá)的抗FZD抗體。鑒定到識(shí)別FZDlO (圖 1A) ；FZD7 (圖 IB) ；FZD5 (圖 1C) ；FZD6 (圖 ID) ；FZD4(圖 1E)和 FZD8 (圖 1F)的抗體。類似地，使用如用于小鼠免疫的抗原一樣結(jié)合的胞外配體，生成識(shí)別FZD1、FZD2、FZD3和FZD9的抗體。嵌合抗體鑒定特異性識(shí)別FZD受體的單克隆抗體后，修飾這些抗體以克服在使用嚙齒動(dòng)物抗體作為治療劑時(shí)人類抗小鼠抗體(HAMA)免疫應(yīng)答。通過RT-PCR從雜交瘤細(xì)胞分離出所選單克隆抗體的重鏈和輕鏈的可變區(qū)，并將該可變區(qū)分別框內(nèi)連接到哺動(dòng)物表達(dá)載體中的人類IgGl重鏈和K輕鏈恒定區(qū)上。作為選擇，使用諸如TCAE 5. 3等人類Ig表達(dá)載體，該載體含有在同一質(zhì)粒上的人類IgGl重鏈和K輕鏈恒定區(qū)基因(Preston等，1998, Infection& Immunity 66 :4137 42)。編碼嵌合重鏈和輕鏈的表達(dá)載體然后共轉(zhuǎn)染到中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞以生成嵌合抗體。通過ELISA和FACS比較嵌合抗體與鼠類親本抗體的免疫反應(yīng)性和親和性。人源化抗體由于嵌合抗體治療物仍經(jīng)常具有抗原性，而產(chǎn)生人類抗嵌合抗體(HACA)免疫應(yīng)答，因此可以對(duì)抗FZD受體的嵌合抗體進(jìn)一步進(jìn)行人源化。為了產(chǎn)生人源化抗體，使用重組DNA技術(shù)，將抗體的特異性決定基序的關(guān)鍵位置(可能包括來自3條短的高變序列或互補(bǔ)決定區(qū)(CDR))和/或正確定位如上所述的抗體重鏈和輕鏈可變域的CDR區(qū)所需的骨架區(qū)分別構(gòu)建入人類重鏈和輕鏈抗體基因的種系DNA序列中，然后克隆到哺乳動(dòng)物表達(dá)載體中，以用于在CHO細(xì)胞表達(dá)。通過ELISA和FACS比較人源化抗體與親本嵌合抗體的免疫反應(yīng)性和親和性。另外，可以使用可變區(qū)的定位誘變或高密度誘變來優(yōu)化人源化抗體的特異性、親和性等。人類抗體 在一些實(shí)施方式中，使用噬菌體展示技術(shù)來分離特異性識(shí)別FZD受體的胞外域的人類抗體。篩查含有展示為單鏈Fv或展示為fab域的人類抗體可變區(qū)的噬菌體展示抗體文庫(kù)對(duì)上述FZD受體抗原的特異性的、高親和性的識(shí)別作用。然后將所鑒定到的可變區(qū)抗體序列再轉(zhuǎn)化成含有人類IgGl重鏈和K輕鏈的Ig表達(dá)載體的形式，以用于在CHO細(xì)胞中表達(dá)人類抗體。實(shí)施例2識(shí)別多個(gè)FZD家族成員的抗體的制備為了靶向多于一個(gè)的人類FZD受體，制備特異性識(shí)別多個(gè)FZD受體家族成員的抗體。融合到人類Fe的包含N末端Frizzled或Fri、FZD4、FZD5和FZD8中任一個(gè)的配體結(jié)合域的可溶性蛋白結(jié)合并防止通過包括β_連環(huán)蛋白的穩(wěn)定化在內(nèi)的機(jī)制來傳遞信號(hào)的所有類別的Wnt配體(包括Wntl、Wnt2、Wnt3、Wnt3a和Wnt7b)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(圖2)。具體地說，將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染有8xTCF熒光素酶報(bào)告基因的HEK 293細(xì)胞與其量不斷加大的FZD Fe可溶性受體在不同Wnt配體(包括Wntl、Wnt2、Wnt3、Wnt3a和Wnt7b)存在的情況下溫育。FZD4Fc、FZD5Fc和FZD8Fc融合蛋白抑制了由所有5個(gè)Wnt配體介導(dǎo)的Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(圖2)。因此，在某些實(shí)施方式中，生成了特異性識(shí)別FZD4、FZD5和FZD8受體中的兩個(gè)以上受體的抗體。在某些實(shí)施方式中，按照實(shí)施例I中詳細(xì)描述的方法，用一種或多種FZD受體抗原免疫小鼠來制得抗體。然后測(cè)試所制得的抗各FZD受體的抗體與其他FZD受體的交叉反應(yīng)性。然后按照下文詳細(xì)描述的方法鑒定和測(cè)試特異性識(shí)別FZD2和FZD6 ；FZD7和FZDlO ；FZD4和FZD5 ；FZD4和FZD8 ；FZD5和FZD8 ；以及FZD4、FZD5和FZD8的抗體防止腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的能力。在某些實(shí)施方式中，使用噬菌體展示文庫(kù)來鑒定識(shí)別多個(gè)FZD家族成員的抗體。使用人類FZD受體的N末端胞外域中高度同源的區(qū)域來篩查文庫(kù)中展示特異性識(shí)別兩個(gè)以上FZD受體的抗原結(jié)合域的噬菌體。例如，將人類FZD受體的同源區(qū)表達(dá)為FZD-Fc蛋白，并以10 μ g/mL將重組蛋白包被在適當(dāng)?shù)谋砻嫔?。然后通過兩輪富集淘選(pan)人類噬菌體文庫(kù)(參見例如Griffiths等，EMBO J. 12 :715 34)。之后，從噬菌體回收編碼抗原結(jié)合域的基因，并通過將該抗原結(jié)合域與恒定區(qū)連接，構(gòu)建完整的人類抗體分子，以用于在適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞系中表達(dá)。在某些實(shí)施方式中，按照下文詳細(xì)描述的方法，鑒定和測(cè)試識(shí)別FZD2和 FZD6 ；FZD7 和 FZDlO ；FZD4 和 FZD5 ；FZD4 和 FZD8 ；FZD5 和 FZD8 ；以及 FZD4、FZD5 和 FZD8的抗體防止腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的能力。在某些實(shí)施方式中，開發(fā)了通過借助規(guī)范Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑干擾信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)來拮抗Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的抗體。例如，通過噬菌體展示法鑒定了特異性識(shí)別FZD4、FZD5和FZD8中的兩種以上FZD的抗體。在某些實(shí)施方式中，開發(fā)了通過激活拮抗性非規(guī)范Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑來拮抗fct信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的抗體。例如，通過噬菌體展示法鑒定了特異性識(shí)別FZD6和FZD2的抗體。實(shí)施例3用以評(píng)價(jià)抗FZD受體的抗體的體外測(cè)定本實(shí)施例描述了代表性的體外測(cè)定，該體外測(cè)定用于測(cè)試所生成的抗FZD受體的抗體對(duì)細(xì)胞增殖、途徑激活和細(xì)胞毒性的活性。 增殖測(cè)定使用Taqman分析定量不同癌細(xì)胞系所表達(dá)的FZD受體。在96孔組織培養(yǎng)微型板中，按IO4個(gè)細(xì)胞/孔的密度對(duì)鑒定為表達(dá)FZD受體的細(xì)胞系進(jìn)行鋪板并讓其展開24小時(shí)。隨后在含有2%FCS的新鮮DMEM中再將細(xì)胞培養(yǎng)12小時(shí)，此時(shí)將抗FZD抗體與對(duì)照抗體在存在ΙΟμπιοΙ/L BrdU的情況下加到培養(yǎng)基中。BrdU標(biāo)記后，去除培養(yǎng)基并將細(xì)胞于室溫下在乙醇中固定30分鐘，并與過氧化物酶偶聯(lián)的抗BrdU單克隆抗體(BMG 6H8克隆，F(xiàn)ab片段)反應(yīng)90分鐘。在含有四甲基聯(lián)苯胺的溶液中使底物顯色，在15分鐘后用25 μ I的lmol/LH2S04終止。使用450nm的濾波器以自動(dòng)ELISA讀板儀(UV Microplate Reader ；Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA)測(cè)量顏色反應(yīng)。所有試驗(yàn)都進(jìn)行3次重復(fù)。與對(duì)照抗體比較而確定抗FZD抗體抑制細(xì)胞增殖的能力。途徑激活測(cè)定在某些實(shí)施方式中，在體外確定了抗FZD受體的抗體阻斷Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的激活的能力。例如，將培養(yǎng)在補(bǔ)充有抗生素和10%FCS的DMEM中的HEK293細(xì)胞與1)用以激活Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的Wnt7B和FZDlO表達(dá)載體；2)用以測(cè)量規(guī)范Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)水平的在螢火蟲熒光素酶報(bào)告基因上游含有3或8個(gè)拷貝的TCF結(jié)合域的TCF/Luc野生型或突變型報(bào)告基因載體(Gazit等，1999,Oncogene 18 :5959 66);和3)用于作為轉(zhuǎn)染效率的內(nèi)部對(duì)照的海腎(Renilla)熒光素酶報(bào)告基因(Promega ;Madison，WI)進(jìn)行共轉(zhuǎn)染。然后向細(xì)胞培養(yǎng)基中加入抗FZDlO和對(duì)照抗體。轉(zhuǎn)染后48小時(shí),使用雙突光素酶測(cè)定試劑盒(Promega ；Madison,WI)測(cè)量熒光素酶水平,其中將螢火蟲熒光素酶活性標(biāo)準(zhǔn)化為海腎熒光素酶活性。以3次重復(fù)進(jìn)行3個(gè)獨(dú)立的試驗(yàn)。由此確定FZDlO抗體抑制Wnt途徑激活的能力。在一些實(shí)施方式中，在體外確定了抗人類FZDlO受體的抗體干擾Wnt配體結(jié)合的能力。例如，用fct應(yīng)答性熒光素酶報(bào)告基因T0PFLASH(UpState Group LLC ;貨號(hào)為21-170)和Wnt3A表達(dá)載體轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞以激活被轉(zhuǎn)染細(xì)胞中的內(nèi)源性Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。將含有FZD5的框內(nèi)連接到人類IgGl Fe的胞外域(第I 233個(gè)氨基酸)的可溶性FZD5Fe添加到轉(zhuǎn)染細(xì)胞的培養(yǎng)基中，以單獨(dú)與Wnt3A結(jié)合(圖3 ；HT培養(yǎng)基，Wnt3A，右側(cè)條)或在存在所生成的抗FZD5的各抗體的情況下與Wnt3A結(jié)合(圖IC ;44M1_32)。根據(jù)熒光素酶活性測(cè)量，在沒有FZD5抗體的情況下，F(xiàn)ZD5 Fe完全消除了轉(zhuǎn)染細(xì)胞中的Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，但是干擾FZD5 Fe與Wnt3A的配體結(jié)合的FZD5抗體的加入恢復(fù)了 Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(圖3)。在一些實(shí)施方式中，體外確定了特異性結(jié)合兩個(gè)以上人類FZD受體(例如FZD2和FZD6)的抗體通過例如用作非規(guī)范Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的激動(dòng)劑而拮抗FZD介導(dǎo)的規(guī)范Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的能力。例如，使用fct應(yīng)答性熒光素酶報(bào)告基因T0PFLASH轉(zhuǎn)染HEK 293細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后48小時(shí)，將特異性識(shí)別人類FZD2和FZD6或同種型對(duì)照的抗體與諸如Wnt_3a等Wnt配體一起添加到培養(yǎng)基中。然后通過測(cè)量熒光素酶活性來確定存在或者不存在抗體的情況下規(guī)范fct信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的激活。補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒素測(cè)定在某些實(shí)施方式中，使用表達(dá)FZD受體的癌細(xì)胞系或從患者樣品中分離到的作為異種移植物傳代到免疫受損小鼠中的癌干細(xì)胞(如下文所詳述)，測(cè)量由抗FZD受體的抗體介導(dǎo)的補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性(CDC)。按IO6個(gè)細(xì)胞/ml，將細(xì)胞懸浮在200 μ I的補(bǔ)充有抗生素和5%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基中。然后將懸浮細(xì)胞與200 μ I血清或熱滅活血清或抗FZD受體或?qū)φ湛贵w的混合，設(shè)3個(gè)重復(fù)。將細(xì)胞混合物于37°C在5%C02中溫育I 4小 時(shí)。然后收集所處理的細(xì)胞，并將其重懸于稀釋在培養(yǎng)基中的100μ I FITC-標(biāo)記的膜聯(lián)蛋白V并在室溫溫育10分鐘。加入稀釋在HBSS中的100 μ I碘化丙啶溶液(25 μ g/ml)，并在室溫下溫育5分鐘。收集細(xì)胞，將其懸浮在培養(yǎng)基中，并用流式細(xì)胞術(shù)分析。FITC染色細(xì)胞的流式細(xì)胞術(shù)分析提供了總細(xì)胞計(jì)數(shù)，而死細(xì)胞的碘化丙啶吸收(作為總細(xì)胞數(shù)的百分比)用于測(cè)量在血清和抗FZD抗體存在下的細(xì)胞死亡(與熱滅活血清和對(duì)照抗體相比)。由此確定抗FZD抗體介導(dǎo)補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性的能力。抗體依賴性細(xì)胞胞毒測(cè)定在某些實(shí)施方式中，使用表達(dá)FZD受體的癌細(xì)胞系或從患者樣品中分離到的作為異種移植物傳代到免疫受損小鼠的癌干細(xì)胞(如下文所詳述)，測(cè)量由抗FZD受體的抗體介導(dǎo)的抗體依賴性細(xì)胞胞毒(ADCC)。按IO6個(gè)細(xì)胞/ml，將細(xì)胞懸浮在200 μ I的補(bǔ)充有抗生素和5%FBS的不含酚紅的RPMI 1640培養(yǎng)基中。通過Ficoll-Paque密度梯度離心從肝素化外周血中分離出外周血單核細(xì)胞(PBMC)，以用作效應(yīng)細(xì)胞。然后在至少一種FZD受體的抗體或?qū)φ湛贵w存在的情況下，將靶細(xì)胞⑴與PBMC效應(yīng)細(xì)胞(E)按25 :1，10 :1和5 :1的E/T比混合在96孔板中。對(duì)照包括在抗體存在的情況下單獨(dú)溫育靶細(xì)胞和單獨(dú)溫育效應(yīng)細(xì)胞。將細(xì)胞混合物于37°C在5%C02中溫育I 6小時(shí)。然后用比色測(cè)定法(CytoTox96Non-radioactive Cytotoxicity Assay ；Promega ；Madison, WI)測(cè)量所釋放的乳酸脫氫酶(LDH, 一種細(xì)胞裂解時(shí)釋放的穩(wěn)定的胞質(zhì)酶)。用標(biāo)準(zhǔn)96孔板讀板儀收集在490nm處的吸收數(shù)據(jù)并進(jìn)行背景校正。根據(jù)下式計(jì)算特異細(xì)胞毒性的百分比％細(xì)胞毒性=IOOX (試驗(yàn)LDH釋放一效應(yīng)器自發(fā)LDH釋放一靶自發(fā)LDH釋放)/ (靶最大LDH釋放一靶自發(fā)LDH釋放)。由此確定抗FZD受體的抗體介導(dǎo)抗體依賴性細(xì)胞胞毒的能力。實(shí)施例4體內(nèi)使用抗FZD受體的抗體防止腫瘤生長(zhǎng)本實(shí)施例描述了抗FZD受體的抗體在防止異種移植物模型內(nèi)的腫瘤生長(zhǎng)中的應(yīng)用。在某些實(shí)施方式中，制備來自患者樣品(例如實(shí)體瘤活檢樣品或胸腔積液)的已作為異種移植物傳代到小鼠中的腫瘤細(xì)胞，以再傳代到試驗(yàn)動(dòng)物中。在無(wú)菌條件下取出腫瘤組織，切成小塊，用無(wú)菌刀片完全切碎，并通過酶消化和機(jī)械破碎獲得單細(xì)胞懸浮液。具體地說，將胸腔積液細(xì)胞或所得腫瘤塊與超純膠原酶III于培養(yǎng)基中混合(200 250單位膠原酶/mL)并在37°C溫育3 4小時(shí)，期間每15 20分鐘通過IOmL移液器上下吸打。通過45 μ M尼龍網(wǎng)過濾所消化的細(xì)胞，用RPMI/20%FBS洗滌，并用HBSS洗滌兩次。然后將解離的腫瘤細(xì)胞皮下注射到NOD/SCID小鼠的乳腺脂肪墊中以引發(fā)腫瘤生長(zhǎng)。在某些實(shí)施方式中，在注射到試驗(yàn)動(dòng)物之前，首先根據(jù)細(xì)胞表面標(biāo)記物將所解離的腫瘤細(xì)胞分選為致瘤性細(xì)胞和非致瘤性細(xì)胞。具體地說，用含有2%熱滅活牛血清(HICS)的Hepes緩沖鹽水溶液(HBSS)洗滌按上述解離的腫瘤細(xì)胞2次，并以IO6個(gè)細(xì)胞/100 μ I重新懸浮。加入抗體，在冰上溫育細(xì)胞20分鐘，然后用HBSS/2%HICS洗滌兩次?？贵w包括抗 ESA (Biomeda，F(xiàn)oster City, CA)、抗 CD44、抗 CD24 和種系標(biāo)記物抗 CD2、抗 CD3、抗 CD10、抗 CD16、抗 CD18、抗 CD31、抗 CD64 和抗 CD140b(統(tǒng)稱為 Lin ；PharMingen, San Jose, CA)。將抗體直接偶聯(lián)到熒光染料上以對(duì)表達(dá)這些標(biāo)記物的細(xì)胞進(jìn)行陽(yáng)性或陰性選擇。通過選擇抗H2Kd+細(xì)胞而排除小鼠細(xì)胞，并通過使用存活力染料(viability dye) 7AAD排除死細(xì)胞。在 FACSVantage (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ)上實(shí)施流式細(xì)胞術(shù)。利用側(cè)向角散射圖和前向角散射圖排除細(xì)胞團(tuán)塊。然后將所分離的ESA+、CD44+、CD24-/低、Lin-致瘤 性細(xì)胞皮下注射到N0D/SCID小鼠中以引發(fā)腫瘤生長(zhǎng)。在某些實(shí)施方式中，分析了抗FZD6和抗FZD5抗體減緩UM-C4結(jié)腸腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的能力。將解離的UM-C4細(xì)胞(10，000個(gè)細(xì)胞/只動(dòng)物)皮下注射到6 8周齡的NOD/SCID小鼠的脅腹區(qū)。腫瘤細(xì)胞注射后兩天，按每周兩次，用10mg/kg的抗FZD6或抗FZD5受體的抗體對(duì)動(dòng)物進(jìn)行腹膜內(nèi)注射(i. P.)。每周監(jiān)測(cè)腫瘤的生長(zhǎng)直至檢測(cè)到生長(zhǎng)，之后，在總共8周的時(shí)間內(nèi)每周對(duì)點(diǎn)腫瘤生長(zhǎng)進(jìn)行兩次測(cè)量。與注射PBS的對(duì)照相比，用抗FZD6抗體23M2和抗FZD5抗體44M13治療動(dòng)物可以顯著減緩腫瘤的生長(zhǎng)(圖4)。實(shí)施例5使用抗FZD受體的抗體對(duì)腫瘤進(jìn)行體內(nèi)治療本實(shí)施例描述了抗FZD受體的抗體在治療異種移植物模型內(nèi)的癌癥中的應(yīng)用。在某些實(shí)施方式中，制備來自患者樣品(例如實(shí)體瘤活檢樣品或胸腔積液)的已作為異種移植物傳代到小鼠中的腫瘤細(xì)胞，以再傳代到試驗(yàn)動(dòng)物中。取出腫瘤組織，切成小塊，用無(wú)菌刀片完全切碎，并通過酶消化和機(jī)械破碎獲得單細(xì)胞懸浮液。然后將解離的腫瘤細(xì)胞皮下注射到N0D/SCID小鼠的乳腺脂肪墊(用于乳腺腫瘤)、注射到脅腹(用于非乳腺腫瘤)中以引發(fā)腫瘤生長(zhǎng)。作為選擇，按上文所詳細(xì)描述的方法分離ESA+、⑶44+、⑶24-/低、Lin-致瘤性腫瘤細(xì)胞并進(jìn)行注射。注射腫瘤細(xì)胞后，監(jiān)測(cè)動(dòng)物的腫瘤生長(zhǎng)。一旦腫瘤的平均尺寸達(dá)到約150mm 200mm,即開始進(jìn)行抗體處理。在總共6周內(nèi)，按每周2 5次，通過腹膜內(nèi)注射，使每只動(dòng)物接受100 μ g FZD受體的抗體或?qū)φ湛贵w。在這些6周過程中，每周評(píng)價(jià)腫瘤尺寸兩次。由此確定FZD受體的抗體防止進(jìn)一步的腫瘤生長(zhǎng)或減小腫瘤尺寸的能力(與對(duì)照抗體比較)。在抗體處理終點(diǎn)，收獲腫瘤以進(jìn)行進(jìn)一步分析。在某些實(shí)施方式中，一部分腫瘤通過免疫熒光法分析以評(píng)價(jià)抗體對(duì)腫瘤的穿透和腫瘤反應(yīng)。一部分各獲自抗FZD受體的抗體處理小鼠和對(duì)照抗體處理小鼠的腫瘤在液氮中鮮凍，包埋在0. C. T.中，并用低溫恒溫器切成位于載玻片上的10 μ m切片。在一些實(shí)施方式中,各個(gè)腫瘤的一部分用福爾馬林固定、石蠟包埋并用超薄切片機(jī)切成位于載玻片上的ΙΟμπι切片。對(duì)所述切片進(jìn)行后固定并與生色團(tuán)標(biāo)記的特異性識(shí)別所注射抗體的抗體溫育，以檢測(cè)腫瘤活檢樣品中存在的抗FZD受體的抗體或?qū)φ湛贵w。另外，可以使用以下抗體或方法來評(píng)價(jià)抗體處理對(duì)例如血管生成、腫瘤生長(zhǎng)和腫瘤形態(tài)的效果例如檢測(cè)不同腫瘤和腫瘤募集的細(xì)胞類型的抗體例如抗VE連環(huán)蛋白(CD144)或抗PECAM-I (CD31)抗體以檢測(cè)血管內(nèi)皮細(xì)胞、抗平滑肌α-肌動(dòng)蛋白抗體以檢測(cè)血管平滑肌細(xì)胞、抗Ki67抗體以檢測(cè)增殖細(xì)胞、TUNEL測(cè)定以檢測(cè)垂死細(xì)胞、抗β -連環(huán)蛋白抗體以檢測(cè)fct信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，以及抗胞內(nèi)域(ICD)Notch片段抗體以檢測(cè)Notch信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。在某些實(shí)施方式中，還評(píng)價(jià)了抗FZD受體的抗體處理對(duì)腫瘤細(xì)胞基因表達(dá)的效果。從一部分各獲自FZD抗體處理小鼠和對(duì)照抗體處理小鼠的腫瘤中提取總RNA，并用該總RNA進(jìn)行定量RT-PCR。分析FZD受體、Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的組分(包括例如Wntl和β-連環(huán)蛋白)以及所加入的先前鑒定到的癌干細(xì)胞標(biāo)記物(例如CD44)相對(duì)于作為內(nèi)部對(duì)照的管家基因GAPDH的表達(dá)水平。由此確定FZD受體的抗體處理時(shí)腫瘤細(xì)胞基因表達(dá)的變化。
另外，評(píng)價(jià)了抗FZD受體的抗體處理對(duì)腫瘤中的癌干細(xì)胞的存在的效果。將來自FZD抗體處理小鼠和對(duì)照抗體處理小鼠的腫瘤樣品切成小塊，用無(wú)菌刀片完全切碎，并通過酶消化和機(jī)械破碎獲得單細(xì)胞懸浮液。然后按上文所詳細(xì)描述的方法，根據(jù)ESA+、CD44+、CD24-/低、Lin-表面細(xì)胞標(biāo)記物表達(dá)，采用FACS分析，分析所解離的腫瘤細(xì)胞的致瘤性癌干細(xì)胞的存在。然后可以根據(jù)ESA+、CD44+、CD24-/低、Lin-表達(dá)評(píng)價(jià)抗FZD抗體處理后所分離的細(xì)胞的致瘤性。將分離自FZD抗體處理小鼠和對(duì)照抗體處理小鼠的ESA+、⑶44+、⑶24-/低、Lin-癌干細(xì)胞再皮下注射到N0D/SCID小鼠的乳腺脂肪墊中。然后根據(jù)形成可靠腫瘤(consistent tumor formation)所需的被注射細(xì)胞的數(shù)量,確定癌干細(xì)胞的致瘤性。實(shí)施例6使用抗FZD受體的抗體治療人類癌癥本實(shí)施例描述了使用用以靶向腫瘤的抗FZD受體的抗體治療癌癥的方法，所述腫瘤包含其中已經(jīng)檢測(cè)到FZD受體表達(dá)的癌干細(xì)胞和/或腫瘤細(xì)胞。首先，可以從腫瘤活檢樣品確定癌干細(xì)胞標(biāo)記物表達(dá)的存在。在無(wú)菌條件下從診斷患有癌癥的患者的活檢樣品取出腫瘤細(xì)胞。在一些實(shí)施方式中，將組織活檢樣品鮮凍在液氮中，包埋在O.C.T.中并利用低溫恒溫器切成位于載玻片上的ΙΟμπι切片。在一些實(shí)施方式中，將組織活檢樣品用福爾馬林固定、石蠟包埋，并用超薄切片機(jī)切成位于載玻片上的IOym切片。將切片與抗FZD受體的抗體溫育，以檢測(cè)蛋白表達(dá)。還可以確定癌干細(xì)胞的存在。將組織活檢樣品切成小塊，用無(wú)菌刀片完全切碎，并對(duì)細(xì)胞進(jìn)行酶消化和機(jī)械破碎，以獲得單細(xì)胞懸浮液。然后將所解離的腫瘤細(xì)胞與抗ESA、抗⑶44、抗⑶24、抗Lin和抗FZD抗體溫育，以檢測(cè)癌干細(xì)胞，并通過上文所詳細(xì)描述的流式細(xì)胞術(shù)確定ESA+、CD44+、CD24-/低、Lin-、FZD+腫瘤干細(xì)胞的存在。用抗FZD受體的抗體治療其腫瘤經(jīng)診斷表達(dá)FZD受體的癌癥患者。在某些實(shí)施方式中，純化上述制得的抗FZD受體的人源化或人類單克隆抗體并與適當(dāng)?shù)乃帉W(xué)可接受的載質(zhì)配制用于注射。在一些實(shí)施方式中，在至少10周內(nèi)，按每月至少一次，使用FZD抗體對(duì)患者進(jìn)行治療。在一些實(shí)施方式中，在至少約14周內(nèi)，按每周至少一次，使用FZD抗體對(duì)患者進(jìn)行治療?？贵w的每次施用量應(yīng)當(dāng)是藥學(xué)有效劑量。在一些實(shí)施方式中，施用約2mg/ml 約100mg/ml的抗FZD的抗體。在一些實(shí)施方式中，施用約5mg/ml 約40mg/ml的抗FZD的抗體。所述抗體可以在常規(guī)放射治療方案或使用一種或多種化療劑(例如奧沙利鉬、氟尿嘧啶、亞葉酸或鏈佐星)的化療方案之前、同時(shí)或之后施用。例如根據(jù)腫瘤消退、新腫瘤發(fā)生情況減少、腫瘤抗原表達(dá)降低、癌干細(xì)胞數(shù)量減少或評(píng)估疾病預(yù)后的其他手段，對(duì)患者進(jìn)行監(jiān)測(cè)，以確定這樣的治療是否已經(jīng)產(chǎn)生抗 腫瘤反應(yīng)。從本文所公開的發(fā)明的說明和實(shí)踐考慮，本發(fā)明的其他實(shí)施方式對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。所述說明和實(shí)施例應(yīng)當(dāng)視為僅為示例目的，本發(fā)明的實(shí)際范圍和精神由所附權(quán)利要求書給出。序列表SEQ ID NO IFZDlO N-末端胞外域MQRPGPRLWLVLQVMGSCAAISSMDMERP⑶GKCQPIEIPMCKDIGYNMTRMPNLMGHENQREAAIQLHEFAPLVEYGCHGHLRFFLCSLYAPMCTEQVSTPIPACRVMCEQARLKCSPIMEQFNFKWPDSLDCRKIPNKNDPNYLCMEAPNNGSDEPTRGSGLFPPLFRPQRPHSAQEHPLKDGGPGRGGCDNPGKFHHVEKSASCAPLCTPGVDVYWSREDKRFASEQ ID NO 2FZD7 N-末端胞外域MRDPGAAAPLSSLGLCALVLALLGALSAGAGAQPYHGEKGISVPDHGFCQPISIPLCTDLAYNQTILPNLLGHTNQEDAGLEVHQFYPLVKVQCSPELRFFLCSMYAPVCTVLDQAIPPCRSLCERARQGCEALMNKFGFQWPERLRCENFPVHGAGEICVGQNTSDGSGGPGGGPTAYPTAPYLPDLPFTALPPGASDGRGRPAFPFSCPRQLKVPPYLGYRFLGERDCGAPCEPGRANGLMYFKEEERRFARLSEQ ID NO 3FZD5 N-末端胞外域MARPDPSAPPSLLLLLLAQLVGRAAAASKAPVCQEITVPMCRGIGYNLTHMPNQFNHDTQDEAGLEVHQFffPLVEIQCSPDLRFFLCSMYTPICLPDYHKPLPPCRSVCERAKAGCSPLMRQYGFAWPERMSCDRLPVLGRDAEVLCMDYNRSEATTAPPRPFPAKPTLPGPPGAPASGGECPAGGPFVCKCREPFVPILKESHPLYNKVRTGQVPNCAVPCYQPSFSADERTSEQ ID NO 4FZD6 N-末端胞外域MEMFTFLLTCIFLPLLRGHSLFTCEPITVPRCMKMAY匪TFFPNLMGHYDQSIAAVEMEHFLPLANLECSPNLETFLCKAFVPTCIEQIHVVPPCRKLCEKVYSDCKKLIDTFGIRWPEELECDRLQYCDETVPVTFDPHTEFLGPQKKTEQVQRDIGFWCPRHLKTSGGQGYKFLGIDQCAPPCPNMYFKSDELEFAKSFIGTVSISEQ ID NO 5FZD4 N-末端胞外域MLAMAWRGAGPSVPGAPGGVGLSLGLLLQLLLLLGPARGFGDEEERRCDPIRISMCQNLGYNVTKMPNLVGHELQTDAELQLTTFTPLIQYGCSSQLQFFLCSVYVPMCTEKINIPIGPCGGMCLSVKRRCEPVLKEFGFAWPESLNCSKFPPQNDHNHMCMEGPGDEEVPLPHKTPIQPGEECHSVGTNSDQYIWVKRSLNCVLKCGYDAGLYSRSAKEFTDISEQ ID NO 6FZD8Fri 域
MEWGYLLEVTSLLAALALLQRSSGAAAASAKE LACQEITVPLCKGIGYNYTYMPNQFNHDTQDEAGLEVHQFWPLVEIQCSPDLKFFLCSMYTPICIEDYKKPLPPCRSVCERAKAGCAPLMRQYGFAWPDRMRCDRLPEQGNPDTLCMDYNRTDLTT
權(quán)利要求
1.一種重組多肽，所述重組多肽包含融合到人類Fe的人類Frizzled(FZD)受體的片段，其中所述人類FZD受體的片段由人類FZD受體的Fri域組成，該可溶性受體抑制Wnt介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，并且所述人類FZD受體選自由FZD8、FZD4和FZD5組成的組。
2.如權(quán)利要求I所述的重組多肽，所述重組多肽抑制由fct介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，所述Wnt選自由 Wntl、Wnt2、Wnt3、Wnt3a 和 Wnt7b 組成的組。
3.如權(quán)利要求I所述的重組多肽，其中所述人類FZD受體是FZD8。
4.如權(quán)利要求3所述的重組多肽，其中FZD8Fri域由SEQID NO 6的約第28個(gè)氨基酸殘基 第158個(gè)氨基酸殘基組成。
5.如權(quán)利要求4所述的重組多肽，其中FZD8Fri域由SEQID NO 6的第28個(gè)氨基酸殘基 第158個(gè)氨基酸殘基組成。
6.一種重組多肽，所述重組多肽包含融合到人類Fe的人類FZD8受體的片段，其中所述人類FZD8受體的片段由SEQ ID NO 6組成。
7.—種分離的多核苷酸,所述多核苷酸包含編碼權(quán)利要求I 6中任一項(xiàng)所述的重組多肽的多核苷酸。
8.—種載體,所述載體包含權(quán)利要求7所述的多核苷酸。
9.一種分離的細(xì)胞,所述分離的細(xì)胞包含權(quán)利要求8所述的載體。
10.一種抑制細(xì)胞內(nèi)Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的方法，所述方法包括使所述細(xì)胞與有效量的權(quán)利要求I 5中任一項(xiàng)所述的重組多肽接觸。
11.一種組合物,所述組合物包含權(quán)利要求I 5中任一項(xiàng)所述的重組多肽。
12.如權(quán)利要求11所述的組合物，其中所述組合物是無(wú)菌液體組合物。
13.如權(quán)利要求12所述的組合物，其中所述組合物適于對(duì)受試對(duì)象施用。
14.如權(quán)利要求12所述的組合物，其中所述組合物能夠抑制細(xì)胞內(nèi)的Wnt介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。
15.權(quán)利要求I 5中任一項(xiàng)所述的重組多肽在制備適于治療癌的藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于診斷和治療癌癥的組合物和方法。本發(fā)明描述了一種分離的抗體，所述抗體特異性結(jié)合兩種以上人類FZD受體的胞外域，并抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)。本發(fā)明還描述了一種治療癌癥的方法，所述方法包括施用抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)有效量的本發(fā)明所公開的抗體。
文檔編號(hào)A61P35/00GK102827287SQ20121028514
公開日2012年12月19日 申請(qǐng)日期2006年10月31日 優(yōu)先權(quán)日2005年10月31日
發(fā)明者奧斯丁·格尼, 約翰·萊維茨基, 桑吉維·薩蒂亞爾, 蒂莫西·霍伊 申請(qǐng)人:昂考梅德藥品有限公司