專利名稱：大竹蟶糜蛋白酶基因SgChy及其重組蛋白的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體講是從大竹蟶cDNA文庫(kù)中獲得一種糜蛋白酶基因SgChy的全長(zhǎng)cDNA序列，對(duì)其結(jié)構(gòu)域進(jìn)行了重組表達(dá)，并分析了該重組產(chǎn)物的糜蛋白酶活性。
背景技術(shù)：
絲氨酸蛋白酶(serineprotease)家族包括諸多成員，它們參與消化、凝血、免疫反應(yīng)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、激素激活和發(fā)育等過(guò)程。糜蛋白酶(chymotrypsin)是絲氨酸蛋白酶中的一種，能切斷蛋白質(zhì)肽鏈中酪氨酸和苯丙氨酸的羧端肽鏈，從而有效酶解蛋白質(zhì)，在蛋白消化中發(fā)揮著重要的作用。糜蛋白酶在現(xiàn)存物種中廣泛存在。目前為止，糜蛋白酶的研究主要集中在哺乳動(dòng)物中，近年來(lái)，陸續(xù)出現(xiàn)了有關(guān)魚(yú)類和海洋無(wú)脊椎動(dòng)物中糜蛋白酶的研究·報(bào)道，研究者從草魚(yú)、鯽魚(yú)和凡納濱對(duì)蝦、扇貝的消化腺，鯉魚(yú)的胰腺，鱈魚(yú)和虹鱒的幽門和以及鍉魚(yú)內(nèi)臟團(tuán)中分離鑒定出糜蛋白酶，其中對(duì)于海洋脊椎動(dòng)物尤其是海洋魚(yú)類糜蛋白酶的研究報(bào)道較多，而在海洋無(wú)脊椎動(dòng)物中相關(guān)研究比較少，未見(jiàn)關(guān)于大竹蟶糜蛋白酶的報(bào)道。本發(fā)明對(duì)于大竹蟶糜蛋白酶基因的克隆、編碼蛋白的重組以及重組蛋白的酶活性分析，填補(bǔ)了大竹蟶糜蛋白酶研究領(lǐng)域的空白。糜蛋白酶作為一種能分解變性蛋白質(zhì)的蛋白水解酶，具有重要的藥用價(jià)值。糜蛋白酶能清創(chuàng)消腫和去除壞死組織的作用，在對(duì)于各種炎癥、炎性水腫、血腫、潰瘍及血栓等有較好的療效，可用于創(chuàng)傷或手術(shù)后傷口愈合、抗炎、防止局部水腫、積血等；同時(shí)，還能促進(jìn)抗癌藥物向病灶滲透，具有一定的抗癌增效作用，可在局部大劑量使用，治療乳腺癌、宮頸癌和胃癌等多種腫瘤，無(wú)任何毒副作用或不良反應(yīng)。目前國(guó)內(nèi)獲得糜蛋白酶多采用從牛胰或豬胰中經(jīng)多重結(jié)晶結(jié)合透析法提取，該方法復(fù)雜、耗時(shí)長(zhǎng)、純化能力弱。本發(fā)明克隆了新的大竹蟶糜蛋白酶基因，對(duì)其編碼的蛋白進(jìn)行了重組表達(dá)，獲得了具有酶活性的重組蛋白，為生產(chǎn)糜蛋白酶提供了新思路，也為開(kāi)發(fā)新的天然海洋藥物奠定了理論基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是要填補(bǔ)有關(guān)大竹蟶糜蛋白酶研究的空白，克隆大竹蟶糜蛋白酶基因，對(duì)其結(jié)構(gòu)域進(jìn)行體外重組并分析其重組蛋白的活性，為開(kāi)發(fā)天然的海洋藥物奠定基礎(chǔ)。本發(fā)明的目的是由以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的克隆得到了一種大竹蟶糜蛋白酶基因，該基因具有SEQ ID No 1中的核苷酸序列，該序列全長(zhǎng)1186bp，5’非編碼區(qū)262bp，3’非編碼區(qū)186bp，有多聚腺苷酸尾巴，開(kāi)放閱讀框738bp，編碼245個(gè)氨基酸；氨基酸序列如SEQID No :2中所示，成熟肽分子量為27. 11^&，等電點(diǎn)為6.08 ;無(wú)信號(hào)肽，具有I個(gè)保守的TrypSPc結(jié)構(gòu)域。該基因編碼蛋白的重組產(chǎn)物具有糜蛋白酶活性。一種克隆大竹蟶糜蛋白酶基因SgChy并制備其重組蛋白的方法，所述的方法是從構(gòu)建的大竹蟶cDNA文庫(kù)中，利用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)分析得到糜蛋白酶基因的EST序列，將對(duì)應(yīng)的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化后測(cè)序得到基因cDNA全長(zhǎng)，以原核表達(dá)的方法構(gòu)建其重組質(zhì)粒，誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白，重組蛋白經(jīng)純化和復(fù)性后檢測(cè)其糜蛋白酶活性。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)克隆了一種大竹蟶糜蛋白酶基因SgChy的cDNA全長(zhǎng)，該基因具有SEQ ID No :1中的堿基序列，體外重組了該基因的編碼蛋白，其具有SEQ ID No :2中的氨基酸序列，該重組蛋白具有糜蛋白酶活性。該基因及其重組蛋白活性的研究，對(duì)于研制天然海洋消炎和抗癌藥物具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。本發(fā)明的實(shí)施例結(jié)合實(shí)驗(yàn)及說(shuō)明書(shū)核苷酸序列表進(jìn)一步說(shuō)明如下SEQ ID No : I為大竹蟶糜蛋白酶SgChy基因的核苷酸序列。SEQ ID No 2為大竹蟶糜蛋白酶SgChy基因編碼蛋白的氨基酸序列。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明的大竹蟶糜蛋白酶SgChy基因具有SEQ ID No 1的堿基序列，其編碼蛋白具有SEQ ID No :2的氨基酸序列，該重組蛋白具有糜蛋白酶活性。本發(fā)明的SgChy的基因克隆及其蛋白重組方法如下實(shí)施例I :所述的SgChy的基因克隆方法(I)大竹経cDNA文庫(kù)的構(gòu)建利用Trizol(Invitrogen)試劑從大竹経混合組織中提取總 RNA,根據(jù) ZAP-cDNA.⑧ Synthesis kit 及 ZAP-cDNA Gigapack III Gold CloningKit (Stratagene)試劑盒的使用說(shuō)明書(shū)純化RNA,通過(guò)合成第一鏈、第二鏈,加接頭，Xho I限制酶消化，獲得兩端具有不同粘性末端的完全單向cDNA。將該片段插入U(xiǎn)ni-ZAP XRVector (lambda phage)。經(jīng)包裝,滴度測(cè)定和擴(kuò)增，利用 Exassist Helper Phage 和 SOLR菌株從Uni-ZAP XR Vector上體外切割pBluescript⑧噬菌粒，大規(guī)模提取質(zhì)粒DNA進(jìn)行測(cè)序。(2)序列分析與目的基因EST序列的獲得獲得的EST數(shù)據(jù)用Phrap軟件聚類拼接，生成拼接而成的Contigs和未參與拼接的Singletons。將所獲的Contigs與Singletons分別進(jìn)行BLASTn和BLASTx分析。對(duì)由BLASTn和BLASTx得到的結(jié)果，根據(jù)相似性序列的功能分別將Contigs和Singletons做功能分類,通過(guò)序列比對(duì)查找所需目的基因的EST序列。(3)根據(jù)⑵步獲得的EST序列，轉(zhuǎn)化⑴步得到的對(duì)應(yīng)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞DH5 a (Transgen)中，培養(yǎng)后挑取選擇陽(yáng)性克隆，以引物Ml3_F (GTAAAACGACGGCCAG)和M13-R(CAGGAAACAGCTATGACC)對(duì)其進(jìn)行序列測(cè)定，獲得目的基因的cDNA全長(zhǎng)。SEQ ID No : I為大竹蟶糜蛋白酶SgChy基因的核苷酸序列。SEQ ID No 2為大竹蟶糜蛋白酶SgChy基因編碼蛋白的氨基酸序列。實(shí)施例2:大竹蟶糜蛋白酶SgChy基因的體外重組表達(dá)(I)利用 PCR 技術(shù)，以重組引物 ATGAGATCCATTAATGTCAAGTTGC 和CAGAAGCATGACTTCTTCATCAGAG克隆SgChy的編碼區(qū)成熟肽，反應(yīng)條件為94 °C預(yù)變性5min ;94°C變性30s，60°C退火30s，72 °C延伸60s，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；最后72 °C延伸IOmin0以I. 5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，用膠回收試劑盒(TaKaRa)進(jìn)行PCR產(chǎn)物的回收和純化，克隆入帶有His標(biāo)簽的pEASY-El表達(dá)載體(Transgen),再轉(zhuǎn)化入Transl-Tlphage resistant感受態(tài)細(xì)胞(Transgen)中，LB培養(yǎng)基平板培養(yǎng)后,挑取菌落，以 T7 (TAATACGACTCACTATAGGG)和 CAGAAGCATGACTTCTTCATCAGAG 分別作為正向和反向引物篩選，選取陽(yáng)性克隆進(jìn)行序列測(cè)定。以質(zhì)粒提取試劑盒(Promega)提取測(cè)序正確克隆的質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21 (DE3) -Transetta (Transgen)中，選取陽(yáng)性克隆在氨節(jié)濃度為50mg/ml的LB液體培養(yǎng)基中220rpm振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37°C。當(dāng)培養(yǎng)液濃度達(dá)到0D600為O. 5-0. 7時(shí)，加入終濃度為lmmol/L的IPTG，繼續(xù)培養(yǎng)4h。取Iml菌液離心，棄去上清后，加入100 μ I蛋白上樣緩沖液，100°C煮沸l(wèi)Omin，稍離心，棄去上清后，以SDS-PAGE檢測(cè)表達(dá)產(chǎn)物。剩余菌液離心后，利用His-tag融合蛋白純化試劑盒MagExtractor His-TagNPK-700 (TOYOBO)，按照操作步驟純化蛋白。(2)將(I)步中得到的純化蛋白經(jīng)含2mM的還原型谷胱甘肽、O. 2mM的氧化型谷胱甘肽、ImM EDTA、50mM Tris_HCl、50mM NaCl、10%甘油、1%甘氨酸的尿素-TBS甘油緩沖液(pH 8. O)透析復(fù)性，尿素濃度從6M逐漸替換到5M、4M、3M、2M、1M，最后一次透析至無(wú)尿素的透析液時(shí)不加甘油。純化蛋白在每個(gè)濃度梯度中4°C透析12h?！?shí)施例3:重組大竹蟶糜蛋白酶rSgChy的酶活性測(cè)定實(shí)施例2 (2)步得到的復(fù)性蛋白以15%的SDS-PAGE檢測(cè)后，以BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(碧云天)測(cè)定蛋白濃度，以50mM的Tris緩沖液調(diào)節(jié)蛋白濃度為O. lmg/ml。以含IOmM CaCl2 的 50mM Tris-HCl 緩沖液溶解 N-Succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe-pnitroanilide (Sigma)溶于，制成終濃度為 O. ImM 的 N-Succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe-pnitroanilide 溶液，取290 μ I與10 μ I含有I μ g復(fù)性蛋白的溶液在96孔酶標(biāo)板中混合，室溫作用lOmin。以等量牛糜蛋白酶(Sigma)代替復(fù)性蛋白作為陽(yáng)性對(duì)照，每個(gè)反應(yīng)設(shè)計(jì)3個(gè)平行。反應(yīng)后，測(cè)定反應(yīng)物410nm處的吸光值，以實(shí)驗(yàn)組/陽(yáng)性對(duì)照X100%為重組蛋白的酶活性。實(shí)驗(yàn)測(cè)得重組大竹蟶糜蛋白酶rSgChy的酶活性為65. 8%?？偨Y(jié)結(jié)果本發(fā)明克隆得到了大竹蟶糜蛋白酶SgChy基因，制備了其重組蛋白并驗(yàn)證了重組蛋白的酶活性。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員都會(huì)理解，在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)，對(duì)于上述實(shí)施例進(jìn)行修改，添加和替換都是可能的，都沒(méi)有超出本發(fā)明的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1.一種大竹蟶糜蛋白酶基因SgChy，其具有糜蛋白酶活性，來(lái)源于大竹蟶CDNA文庫(kù)。
2.權(quán)利要求I所述大竹蟶糜蛋白酶基因SgChy，其核苷酸序列如SEQID NO 1所示。
3.權(quán)利要求2所述大竹蟶糜蛋白酶基因的編碼蛋白，其氨基酸序列如SEQID No:2所/Jn ο
4.權(quán)利要求2所述的大竹蟶糜蛋白酶基因在制備糜蛋白酶類藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明是大竹蟶糜蛋白酶基因SgChy的分子克隆和體外重組表達(dá)技術(shù)，本發(fā)明利用構(gòu)建的大竹蟶cDNA文庫(kù)，克隆得到了大竹蟶糜蛋白酶基因SgChy的cDNA全長(zhǎng)序列，該基因的核苷酸序列如SEQ ID No1所示；利用原核重組表達(dá)技術(shù)表達(dá)了其編碼蛋白，該重組蛋白具有糜蛋白酶活性。該基因及其重組蛋白的研究為生產(chǎn)糜蛋白酶提供了新思路，也為開(kāi)發(fā)新的天然海洋藥物奠定了理論基礎(chǔ)。
文檔編號(hào)A61K38/48GK102787131SQ20121032251
公開(kāi)日2012年11月21日 申請(qǐng)日期2012年9月3日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月3日
發(fā)明者劉相全, 楊嘉龍, 楊建敏, 王忠全, 韋秀梅 申請(qǐng)人:山東省海洋水產(chǎn)研究所