專(zhuān)利名稱(chēng)：用于制備抗鰻利斯頓氏菌的卵黃抗體的滅活疫苗制法的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種滅活疫苗的制備方法，特別是涉及一種用于制備抗鰻利斯頓氏菌的卵黃抗體的滅活 疫苗制法。
背景技術(shù)：
鰻利斯頓氏菌作為水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物的病原菌早已被確認(rèn)，該菌最早由意大利的
Canestrini于1893年首次從發(fā)生“紅疫”的鰻鱺中分離到。現(xiàn)已知其能引起硬頭鱒、大麻
哈魚(yú)、大菱鲆、香魚(yú)、鰻魚(yú)、太平洋鮭、螄魚(yú)、竹莢魚(yú)、真鯛、鱸魚(yú)、鰈魚(yú)、鱈魚(yú)、鮐魚(yú)、各種熱帶
淡水魚(yú)以及蝦、蟹、牡蠣、文蛤、鮑等多種水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物發(fā)生致死性的弧菌病。由鰻利斯頓氏
菌引起的疾病給水產(chǎn)動(dòng)物養(yǎng)殖生產(chǎn)造成了很大的損失，因此，對(duì)鰻利斯頓氏菌引起的疾病
的有效預(yù)防，以最大限度地降低其危害程度，將能顯著地提高水產(chǎn)動(dòng)物養(yǎng)殖生產(chǎn)的經(jīng)濟(jì)效.、
Mo目前養(yǎng)殖戶(hù)大多使用化學(xué)合成藥物或抗生素類(lèi)藥物控制水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物弧菌病的發(fā)生與流行，市場(chǎng)上缺乏一種適用于水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物苗期幼體的使用方便的抗鰻利斯頓氏菌的免疫制劑。因此，開(kāi)發(fā)研制抗鰻利斯頓氏菌的疫苗，對(duì)于有效控制水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物鰻利斯頓氏菌病的發(fā)生與流行具有重要的應(yīng)用前景。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種提高水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物免疫力、降低海水魚(yú)養(yǎng)殖生產(chǎn)中由病原鰻利斯頓氏菌所造成的危害、以滿(mǎn)足水產(chǎn)動(dòng)物養(yǎng)殖生產(chǎn)上的抗病需求的用于制備抗鰻利斯頓氏菌的卵黃抗體的滅活疫苗制法。本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是通過(guò)以下的技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的。本發(fā)明是一種用于制備抗鰻利斯頓氏菌的卵黃抗體的滅活疫苗制法，其特點(diǎn)是該方法以病原鰻利斯頓氏菌BHl Uistonella anguillarum BHl)經(jīng)甲醛溶液滅活后作為免疫原，以白油、司班80和硬脂酸鋁作油乳劑，以黃芪浸出液作為免疫增強(qiáng)劑，乳化制備成油乳劑滅活疫苗；其具體步驟如下
(1)將病原鰻利斯頓氏菌BHl菌株接種在普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂肉湯培養(yǎng)基上，28-30°C搖床培養(yǎng)24h，加入體積終濃度O. 3%的甲醛28°C滅活48h，離心得滅活菌體；
(2)取黃芪用蒸餾水浸泡30-60min后煎煮，過(guò)濾，濃縮至終濃度為原藥lg/mL，得黃芪浸出液；
(3 )將白油加熱至50-55 V，加入硬脂酸鋁，硬脂酸鋁與白油的重量體積比為1-3 :100g / ml，繼續(xù)加熱至65-70°C，加入司班80，司班80與白油的體積比為5-7 :100，直至終溫度115-120°C，維持15-20 min，制得油相，冷卻備用；
(4)將滅活菌體與黃芪浸出液混合，制得疫苗水相；水相中病原鰻利斯頓氏菌BHl免疫原為10ncells/mL，黃芪浸出液為lg/mL，水相中還加入了終體積濃度為4%的吐溫80 ；
(5)將油相和水相按體積比2:1混合乳化研磨5min，制得黃芪和白油為聯(lián)合佐劑的鰻利斯頓氏菌油乳劑滅活疫苗。本發(fā)明所述的病原鰻利斯頓氏菌(Zi1SiofldJa anguillarum BHl)已經(jīng)在公開(kāi)文獻(xiàn)《半滑舌鰨病原鰻利斯頓氏菌表型及分子特征研究》中所公開(kāi)(菌株BHl )，上述公開(kāi)文獻(xiàn)發(fā)表于《海洋學(xué)報(bào)》，2009，31 (5):112-121。菌株BHl的DNA序列長(zhǎng)度及Genebank登錄號(hào)見(jiàn)下表
該菌株BHl為公知公用材料，現(xiàn)保存在淮海工學(xué)院海洋學(xué)院實(shí)驗(yàn)室，在本專(zhuān)利申請(qǐng)日起二十年內(nèi)，公眾如果需要，淮海工學(xué)院海洋學(xué)院實(shí)驗(yàn)室可對(duì)外發(fā)放。本發(fā)明方法制得的鰻利斯頓氏菌油乳劑滅活疫苗的使用方法是采用頸部皮下注射免疫的方法免疫成年產(chǎn)蛋雞，第I次免疫劑量為O. 5 mL，一周后按前述方法加強(qiáng)免疫，免疫劑量為O. 5 mL，一周后按前述方法繼續(xù)加強(qiáng)免疫，免疫劑量為I mL，一周后按前述方法再加強(qiáng)免疫，免疫劑量為O. 5 mL，共免疫4次，收集被免疫雞所產(chǎn)雞蛋，分離出卵黃，并測(cè)定其抗體效價(jià)。免疫結(jié)束后第I周至第2周卵黃抗體效價(jià)維持在213左右，第3周以后卵黃抗體效價(jià)為214左右。然后將所獲得的高免雞蛋作為原料，經(jīng)冷凍干燥(蛋黃液厚度6_，凍干時(shí)間IOh)制備成含有抗鰻利斯頓氏菌的高免卵黃抗體的蛋黃粉，按5%左右比例添加在配合飼料中投喂使用。本發(fā)明方法制得的鰻利斯頓氏菌油乳劑滅活疫苗可以得到抗鰻利斯頓氏菌的高免卵黃抗體，高免卵黃抗體的使用能增強(qiáng)半滑舌鰨等海水魚(yú)類(lèi)對(duì)病原鰻利斯頓氏菌的免疫力，提高半滑舌鰨等海水魚(yú)類(lèi)養(yǎng)殖的成活率，增加半滑舌鰨等海水魚(yú)類(lèi)養(yǎng)殖的產(chǎn)量，提高半滑舌鰨等海水魚(yú)類(lèi)養(yǎng)殖生產(chǎn)的經(jīng)濟(jì)效益。從根本上解決了目前半滑舌鰨等海水魚(yú)類(lèi)養(yǎng)殖生產(chǎn)過(guò)程中易發(fā)生鰻利斯頓氏菌所致疾病的問(wèn)題。
具體實(shí)施例方式以下進(jìn)一步描述本發(fā)明的具體技術(shù)方案，以便于本領(lǐng)域的技術(shù)人員進(jìn)一步地理解本發(fā)明，而不構(gòu)成對(duì)其權(quán)利的限制。實(shí)施例1，一種用于制備抗鰻利斯頓氏菌的卵黃抗體的滅活疫苗制法，該方法以病原鰻利斯頓氏菌BHl UAstonella anguillarum BHl)經(jīng)甲醒溶液滅活后作為免疫原，以白油、司班80和硬脂酸鋁作油乳劑，以黃芪浸出液作為免疫增強(qiáng)劑，乳化制備成油乳劑滅活疫苗；其具體步驟如下
(1)將病原鰻利斯頓氏菌BHl菌株接種在普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂肉湯培養(yǎng)基上，30°C搖床培養(yǎng)24h，加入體積終濃度O. 3%的甲醛28°C滅活48h，離心得滅活菌體；
(2)取黃芪用蒸餾水浸泡60min后煎煮，過(guò)濾，濃縮至終濃度為原藥lg/mL，得黃芪浸出
液；
(3)將白油加熱至50°C，加入硬脂酸鋁，硬脂酸鋁與白油的重量體積比為I:100 g /ml，繼續(xù)加熱至65°C，加入司班80，司班80與白油的體積比為5 :100，直至終溫度115°C，維持15min，制得油相，冷卻備用；(4)將滅活菌體與黃芪浸出液混合，制得疫苗水相；水相中病原鰻利斯頓氏菌BHl免疫原為10ncells/mL，黃芪浸出液為lg/mL，水相中還加入了終體積濃度為4%的吐溫80 ；
(5)將油相和水相按體積比2:1混合乳化研磨5min，制得黃芪和白油為聯(lián)合佐劑的鰻利斯頓氏菌油乳劑滅活疫苗。實(shí)施例2，一種用于制備抗鰻利斯頓氏菌的卵黃抗體的滅活疫苗制法，該方法以病原鰻利斯頓氏菌BHl UAstonella anguillarum BHl)經(jīng)甲醒溶液滅活后作為免疫原，以白油、司班80和硬脂酸鋁作油乳劑，以黃芪浸出液作為免疫增強(qiáng)劑，乳化制備成油乳劑滅活疫苗；其具體步驟如下
(1)將病原鰻利斯頓氏菌BHl菌株接種在普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂肉湯培養(yǎng)基上，29°C搖床培養(yǎng)24h，加入體積終濃度O. 3%的甲醛28°C滅活48h，離心得滅活菌體；
(2)取黃芪用蒸餾水浸泡60min后煎煮，過(guò)濾，濃縮至終濃度為原藥lg/mL，得黃芪浸出
液；
(3)將白油加熱至52°C，加入硬脂酸鋁，硬脂酸鋁與白油的重量體積比為3:100 g /ml，繼續(xù)加熱至68 V，加入司班80，司班80與白油的體積比為7 :100，直至終溫度118°C，維持18 min，制得油相，冷卻備用；
(4)將滅活菌體與黃芪浸出液混合，制得疫苗水相；水相中病原鰻利斯頓氏菌BHl免疫原為10ncells/mL，黃芪浸出液為lg/mL，水相中還加入了終體積濃度為4%的吐溫80 ；
(5)將油相和水相按體積比2:1混合乳化研磨5min，制得黃芪和白油為聯(lián)合佐劑的鰻利斯頓氏菌油乳劑滅活疫苗。實(shí)施例3，一種用于制備抗鰻利斯頓氏菌的卵黃抗體的滅活疫苗制法，該方法以病原鰻利斯頓氏菌BHl UAstonella anguillarum BHl)經(jīng)甲醒溶液滅活后作為免疫原，以白油、司班80和硬脂酸鋁作油乳劑，以黃芪浸出液作為免疫增強(qiáng)劑，乳化制備成油乳劑滅活疫苗；其具體步驟如下
(1)將病原鰻利斯頓氏菌BHl菌株接種在普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂肉湯培養(yǎng)基上，28°C搖床培養(yǎng)24h，加入體積終濃度O. 3%的甲醛28°C滅活48h，離心得滅活菌體；
(2)取黃芪用蒸餾水浸泡45min后煎煮，過(guò)濾，濃縮至終濃度為原藥lg/mL，得黃芪浸出
液；
(3)將白油加熱至55°C，加入硬脂酸鋁，硬脂酸鋁與白油的重量體積比為2:100 g /ml，繼續(xù)加熱至70°C，加入司班80，司班80與白油的體積比為6 :100，直至終溫度120°C，維持20 min，制得油相，冷卻備用；
(4)將滅活菌體與黃芪浸出液混合，制得疫苗水相；水相中病原鰻利斯頓氏菌BHl免疫原為10ncells/mL，黃芪浸出液為lg/mL，水相中還加入了終體積濃度為4%的吐溫80 ；
(5)將油相和水相按體積比2:1混合乳化研磨5min，制得黃芪和白油為聯(lián)合佐劑的鰻利斯頓氏菌油乳劑滅活疫苗。實(shí)施例4，取實(shí)施例3制得的鰻利斯頓氏菌油乳劑滅活疫苗進(jìn)行的應(yīng)用實(shí)驗(yàn)。I.鰻利斯頓氏菌油乳劑滅活疫苗免疫產(chǎn)蛋雞。鰻利斯頓氏菌油乳劑滅活疫苗采用頸部皮下注射免疫的方法免疫成年產(chǎn)蛋雞，第I次免疫劑量為O. 5 mL，一周后按前述方法加強(qiáng)免疫，免疫劑量為O. 5 mL，一周后按前述方法繼續(xù)加強(qiáng)免疫，免疫劑量為I mL，一周后按前述方法再加強(qiáng)免疫，免疫劑量為O. 5 mL，共免疫4次，收集被免疫雞所產(chǎn)雞蛋，分離出卵黃作高免卵黃抗體，并測(cè)定其抗體效價(jià)。免疫結(jié)束后第I周至第2周卵黃抗體效價(jià)維持在213，第3周以后卵黃抗體效價(jià)為214。2.用抗鰻利斯頓氏菌的高免卵黃抗體進(jìn)行的免疫實(shí)驗(yàn)及其結(jié)果。實(shí)驗(yàn)時(shí)間2011年度4月 5月。實(shí)驗(yàn)地點(diǎn)江蘇省淮海工學(xué)院水產(chǎn)動(dòng)物病害實(shí)驗(yàn)室。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物半滑舌鰨和大菱鲆。高免卵黃抗體與方法使用所述的方法制得的抗鰻利斯頓氏菌的高免卵黃抗體。使用時(shí)以所獲得的高免雞蛋作為原料，經(jīng)冷凍干燥(蛋黃液厚度6_，凍干時(shí)間IOh)制備成含有抗鰻利斯頓氏菌的高免卵黃抗體的蛋黃粉，按5%比例添加在配合飼料中投喂使用。試驗(yàn)用半滑舌鰨和大菱鲆投喂抗鰻利斯頓氏菌的高免卵黃抗體飼料2d后，分別 用濃度為 I. 56X 108CFU/mL 的獲利斯頓氏菌 BHl {Listonella anguillarum BHl)菌懸液 注射感染受免半滑舌鰨和大菱鲆，感染劑量為O. 3mL。試驗(yàn)期為7d，并持續(xù)投喂抗鰻利斯頓氏菌的高免卵黃抗體飼料。對(duì)照組為用濃度I. 56X 108CFU/mL 的鰻利斯頓氏菌ΒΗ1(ΖΥ5· ο/7<977<3 anguillarumBHl)菌懸液注射感染投喂普通飼料的半滑舌鰨和大菱鲆，感染劑量為O. 3mL。實(shí)驗(yàn)結(jié)果半滑舌鰨和大菱鲆經(jīng)實(shí)驗(yàn)例I所述的抗鰻利斯頓氏菌的高免卵黃抗體和使用方法進(jìn)行免疫后，兩種海水魚(yú)都能產(chǎn)生一定的免疫保護(hù)力，其免疫保護(hù)率分別為85%、75%。見(jiàn)下表
權(quán)利要求
1. 一種用于制備抗鰻利斯頓氏菌的卵黃抗體的滅活疫苗制法，其特征在于該方法以病原鰻利斯頓氏菌BHl {Listonella anguillarum BHl)經(jīng)甲醛溶液滅活后作為免疫原，以白油、司班80和硬脂酸鋁作油乳劑，以黃芪浸出液作為免疫增強(qiáng)劑，乳化制備成油乳劑滅活疫苗；其具體步驟如下 (1)將病原鰻利斯頓氏菌BHl菌株接種在普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂肉湯培養(yǎng)基上，28-30°C搖床培養(yǎng)24h，加入體積終濃度O. 3%的甲醛28°C滅活48h，離心得滅活菌體； (2)取黃芪用蒸餾水浸泡30-60min后煎煮，過(guò)濾，濃縮至終濃度為原藥lg/mL，得黃芪浸出液； (3 )將白油加熱至50-55 V，加入硬脂酸鋁，硬脂酸鋁與白油的重量體積比為1-3 :100g / ml，繼續(xù)加熱至65-70°C，加入司班80，司班80與白油的體積比為5_7 :100，直至終溫度115-120°C，維持15-20 min，制得油相，冷卻備用； (4)將滅活菌體與黃芪浸出液混合，制得疫苗水相；水相中病原鰻利斯頓氏菌BHl免疫原為10ncells/mL，黃芪浸出液為lg/mL，水相中還加入了終體積濃度為4%的吐溫80 ； (5)將油相和水相按體積比2:1混合乳化研磨5min，制得黃芪和白油為聯(lián)合佐劑的鰻利斯頓氏菌油乳劑滅活疫苗。
全文摘要
一種用于制備抗鰻利斯頓氏菌的卵黃抗體的滅活疫苗制法，該方法先將病原鰻利斯頓氏菌BH1菌株滅活、離心得滅活菌體；然后制得黃芪浸出液；再由白油、硬脂酸鋁、司班80制得油相，滅活菌體與黃芪浸出液混合制得疫苗水相；最后將油相和水相按體積比2:1混合乳化研磨5min，制得黃芪和白油為聯(lián)合佐劑的副溶血弧菌油乳劑滅活疫苗。該疫苗可以得到抗鰻利斯頓氏菌的高免卵黃抗體，高免卵黃抗體的使用能增強(qiáng)半滑舌鰨等海水魚(yú)類(lèi)對(duì)病原鰻利斯頓氏菌的免疫力，提高其成活率，增加其產(chǎn)量，提高半滑舌鰨等海水魚(yú)類(lèi)養(yǎng)殖生產(chǎn)的經(jīng)濟(jì)效益。從根本上解決了目前半滑舌鰨等海水魚(yú)類(lèi)養(yǎng)殖生產(chǎn)過(guò)程中易發(fā)生鰻利斯頓氏菌所致疾病的問(wèn)題。
文檔編號(hào)A61K39/395GK102836431SQ201210335928
公開(kāi)日2012年12月26日 申請(qǐng)日期2012年9月12日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月12日
發(fā)明者張曉君, 畢可然, 陳麗, 閆斌倫, 秦國(guó)民 申請(qǐng)人:淮海工學(xué)院