專利名稱：靶向基因shRNA干擾豬藍(lán)耳病病毒增殖的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系的建立方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明設(shè)計一種抗豬藍(lán)耳病病毒轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系的構(gòu)建；具體地講，本發(fā)明設(shè)計能有效阻止豬藍(lán)耳病病毒增殖和復(fù)制的靶向基因ShRNA，并通過轉(zhuǎn)座子載體插入供體細(xì)胞的基因組，獲得能有效阻止藍(lán)耳病病毒感染的Marc-145細(xì)胞克隆。
背景技術(shù)：
豬繁殖與呼吸綜合癥于上世紀(jì)80年代末首次在美國發(fā)現(xiàn)，其致病病原為豬繁殖與呼吸綜合癥病毒(PRRS virus, PRRSV)，主要造成母豬繁殖障礙和大量仔豬死亡，仔豬發(fā)病率100%，死亡率50%以上，母豬流產(chǎn)率達(dá)30%以上，是一種重要的動物疫病。近年豬藍(lán)耳病在我國大面積暴發(fā)，防治高致病性藍(lán)耳病的根本有效措施主要依靠 疫苗，但成本高、手續(xù)煩瑣，而且價格非常昂貴，極大的增加了養(yǎng)殖成本，增加了豬農(nóng)的負(fù)擔(dān)，應(yīng)用范圍受到極大限制。豬藍(lán)耳病(PRRS)是嚴(yán)重危害養(yǎng)豬業(yè)的病毒性傳染病，死亡率極高，給我國養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。雖然國內(nèi)外對PRRS的疫苗研究非?；钴S，但到目前為止，仍沒有一種疫苗可對豬體產(chǎn)生完全安全的保護，普遍存在難以誘發(fā)較早和較高的抗體水平等問題。Marc-145細(xì)胞來源于猴腎細(xì)胞，從母細(xì)胞(MA 104細(xì)胞)克隆而得到，可連續(xù)傳代培養(yǎng)。Marc-145細(xì)胞是目前對PRRSV最敏感的細(xì)胞系之一。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的問題是提供一種靶向基因shRNA干擾豬生殖與呼吸綜合癥病毒增殖和復(fù)制的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系的構(gòu)建方法及相應(yīng)的重組載體PXL-BAC2-FRT-EGFP-NE0-shRNA的構(gòu)建方法，為開辟控制豬PRRS感染和減少其危害提供技術(shù)支持。為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種重組載體PXL-BAC2-FRT-EGFP-NE0-shRNA的構(gòu)建方法，包括以下步驟I )、設(shè)計靶向基因shRNA 0RF6-6e 5’-gatccGCCATAGAAACCTGGAAGTTTCAAGAGAACTTCCAGGTTTCTATGGCTTTTTTg-----3’3’-----gCGGTATCTTTGGACCTTCAAAGTTCTCTTGAAGGTCCAAAGATACCGAAAAAActta
a-5，；2)、構(gòu)建重組載體 PXL-BAC2-FRT-EGFP-NE0-shRNA 通過PCR 擴增 zsGFP 和 NEO 片段，將 0RF6_6e 所述的 shRNA 酶切(EcoRI-BamHI)連接到pMD18-TSimple載體上，并通過BglII-EcoRV酶切，回收、連接到PXL-BAC2 載體上，構(gòu)建了重組載體 PXL-BAC2-FRT-EGFP-NE0-shRNA。本發(fā)明還同時提供了一種靶向基因shRNA干擾豬藍(lán)耳病病毒增殖的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系的構(gòu)建方法設(shè)計能有效阻止豬藍(lán)耳病病毒增殖和復(fù)制的靶向基因shRNA(即，0RF6-6e)，并通過轉(zhuǎn)座子載體插入供體細(xì)胞的基因組，從而獲得能有效阻止藍(lán)耳病病毒感染的克隆細(xì)胞系。作為本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系的構(gòu)建方法的改進，利用重組載體PXL-BAC2-FRT-EGFP-NE0-shRNA進行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，包括以下步驟將重組載體PXL-BAC2-FRT-EGFP-NE0-shRNA 用 lipofectin2000 (Invitrogen)轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染Marc-145細(xì)胞；到細(xì)胞增長接近匯合時按I :10密度(即細(xì)胞密度稀釋10倍)傳代，繼續(xù)培養(yǎng)；培養(yǎng)基為含有10% (體積濃度)胎牛血清的DMEM (Gibco)基本培養(yǎng)基；S卩，該培養(yǎng)基的制備方法為在每升DMEM (Gibco)基本培養(yǎng)基中加入IOOml的胎牛血清；待細(xì)胞密度增至50% 70%匯合時，加入G418濃度為120(^g/ml的篩選培養(yǎng)基， 每3-5天更換一次G418濃度為120(^g/ml的篩選培養(yǎng)基；當(dāng)有大量細(xì)胞死亡(即超過80%的細(xì)胞死亡)時，改用G418濃度為60(^g/ml的篩選培養(yǎng)基維持篩選(即，將G418濃度減半進行篩選);每3-5天更換一次G418濃度為600Pg/ml的篩選培養(yǎng)基；篩選10 14天后,有抗性的克隆細(xì)胞出現(xiàn)，改用含有10% (體積濃度)胎牛血清的DMEM (Gibco)基本培養(yǎng)基進行培養(yǎng)(即停藥培養(yǎng))，待克隆細(xì)胞逐漸增大后，將克隆細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后利用有限稀釋法篩選陽性細(xì)胞單克隆；從而獲得靶向基因shRNA干擾豬藍(lán)耳病病毒增殖的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系；上述培養(yǎng)和篩選的條件均為于37°C，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。G418濃度為120(^g/ml的篩選培養(yǎng)基的制備方法為培養(yǎng)基中加入G418直至G418的濃度為120(^g/ml，該培養(yǎng)基為含有10% (體積濃度)胎牛血清的DMEM (Gibco)基本培養(yǎng)基。G418濃度為60(^g/ml的篩選培養(yǎng)基的制備方法為培養(yǎng)基中加入G418直至G418的濃度為60(^g/ml，該培養(yǎng)基為含有10% (體積濃度)胎牛血清的DMEM (Gibco)基本培養(yǎng)基。本發(fā)明還同時提供了利用上述方法構(gòu)建而得的靶向基因shRNA干擾豬藍(lán)耳病病毒增殖的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系的用途對PRRSV型病毒具有抑制作用。本發(fā)明的具體技術(shù)方案如下步驟(I)、設(shè)計能有效阻止豬藍(lán)耳病病毒的增殖和復(fù)制的靶向基因shRNA 1-1靶向基因shRNA設(shè)計根據(jù)PRRSV病毒的基因組序列，以0RF5和0RF6為目的基因，選取一段19bp長的核酸序列。該序列不要在5’和3’非翻譯區(qū)，以及起始密碼子后75bp ;將候選的19bp核酸序列，與相應(yīng)的基因組進行比對，以確定該序列是特異性的只針對目的基因，與其他基因沒有相似性。根據(jù)以上原則分別設(shè)計了 5對針對PRRSV-0RF5基因和5對針對PRRSV-0RF6基因的shRNA。1-2體外shRNA活性檢測設(shè)計合成的shRNA序列經(jīng)退火反應(yīng)形成具有粘性末端的雙鏈，直接連接到線性化的RNAi-Ready pSIREN-RetroQ-ZsGreen載體上，構(gòu)建成RNA干擾載體；將上述質(zhì)粒DNA,分別在轉(zhuǎn)染試劑介導(dǎo)下導(dǎo)入Marc-145細(xì)胞，24小時后進行熒光觀察，確定轉(zhuǎn)染效率(圖I)。轉(zhuǎn)染24小時后對細(xì)胞接種PRRSV病毒，接毒72小時后將上清懸液和細(xì)胞分開收集，通過Real-Time PCR方法檢測細(xì)胞中病毒相對表達(dá)量，分析所設(shè)計的shRNA對PRRSV型病毒的抑制作用(圖2)。由圖2可見，針對0RF5和0RF6設(shè)計的共10對shRNA均表現(xiàn)出抑制PRRSV病毒增殖復(fù)制的作用，但不同shRNA的抑制效果存在差異(O. 71%-67. 52%)。其中ORF6_6e的病毒相對表達(dá)量僅為O. 71%，表現(xiàn)出較顯著的對PRRSV病毒復(fù)制與增殖的抑制作用，可作為轉(zhuǎn)基因的候選shRNA序列。步驟(2)抗豬藍(lán)耳病病毒增殖的轉(zhuǎn)基因載體構(gòu)建2-1抗豬藍(lán)耳病病毒增殖的轉(zhuǎn)基因載體構(gòu)建。經(jīng)體外shRNA活性檢測，篩選出有效阻止PRRSV感染的shRNA，構(gòu)建轉(zhuǎn)基因重組載體PXL-BAC2-FRT-EGFP-NE0_shRNA (圖3)。2-2抗豬藍(lán)耳病病毒活性檢測。將構(gòu)建好的上述質(zhì)粒DNA，在轉(zhuǎn)染試劑介導(dǎo)下導(dǎo)入Marc-145細(xì)胞，24小時后進行熒光觀察，確定轉(zhuǎn)染效率。轉(zhuǎn)染24小時后對細(xì)胞接種PRRSV病毒，接毒48-72小時后將上清懸液和細(xì)胞分開收集，通過Real-Time PCR方法檢測病毒感染后，細(xì)胞中病毒相對表達(dá)量，分析轉(zhuǎn)基因重組載體PXL-BAC2-FRT-EGFP-NE0-shRNA對 PRRSV型病毒的抑制作用。步驟(3)抗豬藍(lán)耳病病毒增殖的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系的建立3-1建立轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系將上述轉(zhuǎn)基因重組載體PXL-BAC2-FRT-EGFP-NE0-shRNA和helper質(zhì)粒用Iipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染Marc-145細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)24小時，觀察熒光蛋白的表達(dá)情況。到細(xì)胞增長接近匯合時按I : 10密度傳代(即細(xì)胞密度稀釋10倍)，繼續(xù)培養(yǎng)。待細(xì)胞密度增至50% 70%匯合時，加入按最佳篩選濃度配制好的G418(120(^g/ml)篩選培養(yǎng)基。根據(jù)培養(yǎng)基的顏色和細(xì)胞生長情況，每3-5天更換一次篩選培養(yǎng)基。當(dāng)有大量細(xì)胞死亡時，可以把G418濃度減半維持篩選(也需每3-5天更換一次篩選培養(yǎng)基)；篩選10 14天后，可見有抗性的克隆出現(xiàn)，停藥培養(yǎng)，待其逐漸增大后；將細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后利用有限稀釋法篩選陽性細(xì)胞單克隆(圖4)。在熒光顯微鏡下觀察這些克隆GFP的表達(dá)情況。3-2抗豬藍(lán)耳病病毒活性檢測對轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系接種PRRSV病毒，接毒48-72小時后將上清懸液和細(xì)胞分開收集，通過Real-Time PCR方法檢測細(xì)胞中病毒相對表達(dá)量，分析轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系對PRRSV型病毒的抑制作用(圖5)。步驟(4)抗豬藍(lán)耳病病毒增殖的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞基因組中目標(biāo)插入基因檢測4-1抗豬藍(lán)耳病病毒增殖的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞基因組中GFP和Neomycinlr插入片段的檢測以轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系為材料抽提細(xì)胞基因組(模板)，分別設(shè)計GFP引物(1400bp)和Neomycinlr引物序列2000bp)進行PCR擴增。PCR擴增的條件為94°C預(yù)變性5分鐘，再以94°C/45sec，55°C/45sec，72°C/3min，共35個循環(huán)，最后72°C延長10分鐘?？蓮霓D(zhuǎn)基因細(xì)胞系的基因組中擴增獲得GFP基因和Neomycinlr基因，表明該兩基因分別被重組到豬基因組中(圖6)。4-2抗豬藍(lán)耳病病毒增殖的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞cDNA中GFP和Neomycinlr插入片段的檢測以轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系為材料抽提細(xì)胞RNA進行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA (模板)，分別設(shè)計GFP引物(1400bp)和Neomycinlr引物序列2000bp)進行PCR擴增。PCR擴增的條件為94°C預(yù)變性5分鐘，再以94°C/45sec，55°C/45sec，72°C/3min，共35個循環(huán)，最后72°C延長10分鐘。可從轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系的cDNA中擴增獲得GFP基因和Neomycinlr基因，表明該兩基因分別被重組到豬基因組中(圖7)。4-3抗豬藍(lán)耳病病毒增殖的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞基因組中shRNA插入片段的檢測以轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系為材料抽提基因組，設(shè)計shRNA PCR擴增引物序列( 310bp )F AAGTAACAAAACTTTTATCG 和 R :ATTCCTTCATATTTGCATA。該擴增序列包含載體序列 LTR、shRNA(6e)和U6啟動子的序列。轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系可從基因組中擴增獲得shRNA基因(圖8)。
本發(fā)明的有益效果如下利用RNA干擾技術(shù)，建立一種能有效抑制豬藍(lán)耳病靶向基因增殖的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系，為從遺傳的角度根除豬藍(lán)耳病病毒的感染提供理論依據(jù)和試驗基礎(chǔ)。減少養(yǎng)豬的疫病控制成本，為生命科學(xué)研究提供科學(xué)依據(jù)，同時，利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系的建立從育種的角度為開辟控制豬藍(lán)耳病病毒感染和減少其危害的技術(shù)奠定基礎(chǔ)，是未來的重要發(fā)展趨勢。


圖I是含PRRSV-0RF6e_shRNA表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Marc-145細(xì)胞24 h后的熒光觀察圖(100 μm)；左圖代表含shRNA的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Marc-145細(xì)胞熒光蛋白表達(dá)情況；右圖代表對照組Marc-145細(xì)胞。圖2是pSIREN-shRNA抗病毒能力檢測圖；圖中Control代表對照，即未經(jīng)RNA干擾載體轉(zhuǎn)染；5b 5e、6a 6e分別代表用于轉(zhuǎn)染的RNA干擾載體含有PRRSV_0RF5b\5c\5d\5e和PRRSV-0RF6a\6b\6c\6d\6e shRNA 序列。圖3轉(zhuǎn)基因重組載體PXL-BAC2-FRT-EGFP-NE0-shRNA的構(gòu)建示意圖。圖4具有抑制PRRSV增殖能力的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系；上圖左(50μ m)為轉(zhuǎn)基因重組載體 PXL-BAC2-FRT-EGFP-NE0_shRNA 轉(zhuǎn)染Marc-145細(xì)胞后采用G418篩選10日的細(xì)胞；上圖右(IOOym)S :Marc_145細(xì)胞轉(zhuǎn)染后繼續(xù)通過G418篩選30天，觀察到陽性細(xì)胞單克隆化形成的單個細(xì)胞島；下圖(100 μ m)為將上述單克隆細(xì)胞逐步擴大培養(yǎng)篩選得到的形態(tài)和活力都較好的單克隆細(xì)胞株。圖5是轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系抑制PRRSV增殖效果圖；對照(Control),即未經(jīng)RNA干擾載體轉(zhuǎn)染的Marc-145細(xì)胞PRRSV攻毒后的病毒
表達(dá)量；Xl-Bac II -FRT-EGFP-NEO-N:陽性對照，即經(jīng)Xl-Bac II -FRT-EGFP-NEO-N 陽性干擾載體轉(zhuǎn)染的Marc-145細(xì)胞PRRSV攻毒后的病毒表達(dá)量；Xl-Bac II -FRT-EGFP-NE0_6e:經(jīng) Xl-Bac II -FRT-EGFP-NE0_6e 干擾載體轉(zhuǎn)染的Marc-145細(xì)胞PRRSV攻毒后的病毒表達(dá)量。圖6轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系基因組中擴增獲得GFP和Neomycinlr基因序列。
圖7轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系cDNA中擴增獲得GFP和Neomycinlr基因序列。圖8轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系基因組中擴增犾得shRNA基因序列；6e代表含PRRSV-0RF6e-shRNA轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系擴增獲得shRNA基因序列310bp);陰代表模板米用對照細(xì)胞系；H20代表PCR反應(yīng)體系中添加水，不加模板；陽代表以轉(zhuǎn)基因重組載體PXL-BAC2-FRT-EGFP-NE0-shRNA為模板；M代表DNA分子量標(biāo)記。
具體實施例方式實施例I、針對豬藍(lán)耳病病毒的增殖和復(fù)制的靶向基因shRNA的設(shè)計、合成、載體構(gòu)建根據(jù)PRRSV-0RF5和PRRSV-0RF6蛋白基因的結(jié)構(gòu)序列和shRNA序列設(shè)計原則，分別針對PRRSV-0RF5和PRRSV-0RF6各設(shè)計了 5對shRNA序列；這10對shRNA序列具體如下表I和表2所述表 I、針對 PRRSV-0RF5 的 shRNA 設(shè)計
權(quán)利要求
1.重組載體PXL-BAC2-FRT-EGFP-NE0-shRNA的構(gòu)建方法，其特征在于包括以下步驟 1)、設(shè)計靶向基因shRNA0RF6_6e 5’-gatccGCCATAGAAACCTGGAAGTTTCAAGAGAACTTCCAGGTTTCTATGGCTTTTTTg-----3’3’-----gCGGTATCTTTGGACCTTCAAAGTTCTCTTGAAGGTCCAAAGATACCGAAAAAActtaa-5’ ； 2)、構(gòu)建重組載體PXL-BAC2-FRT-EGFP-NE0-shRNA 通過PCR擴增zsGFP和NEO片段，將0RF6_6e所述的shRNA酶切(EcoRI-BamHI )連接到pMD18-T Simple載體上，并通過BglII-EcoRV酶切，回收、連接到PXL-BAC2載體上，構(gòu)建了重組載體 PXL-BAC2-FRT-EGFP-NE0-shRNA。
2.靶向基因shRNA干擾豬藍(lán)耳病病毒增殖的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系的構(gòu)建方法，其特征在于設(shè)計能有效阻止豬藍(lán)耳病病毒增殖和復(fù)制的靶向基因shRNA，并通過轉(zhuǎn)座子載體插入供體細(xì)胞的基因組，從而獲得能有效阻止藍(lán)耳病病毒感染的克隆細(xì)胞系。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系的構(gòu)建方法，其特征在于利用重組載體PXL-BAC2-FRT-EGFP-NE0-shRNA進行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，包括以下步驟 將重組載體 PXL-BAC2-FRT-EGFP-NE0-shRNA 用 lipofectin2000 轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染Marc-145 細(xì)胞； 到細(xì)胞增長接近匯合時按I :10密度傳代，繼續(xù)培養(yǎng)；培養(yǎng)基為含有10%胎牛血清的DMEM基本培養(yǎng)基； 待細(xì)胞密度增至50% 70%匯合時，加入G418濃度為120(^g/ml的篩選培養(yǎng)基，每3飛天更換一次G418濃度為120(^g/ml的篩選培養(yǎng)基；當(dāng)有超過80%的細(xì)胞死亡時，改用G418濃度為60(^g/ml的篩選培養(yǎng)基維持篩選，每3 5天更換一次G418濃度為60(^g/ml的篩選培養(yǎng)基，篩選10 14天后，有抗性的克隆細(xì)胞出現(xiàn)，改用含有10%胎牛血清的DMEM基本培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，待克隆細(xì)胞逐漸增大后，將克隆細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后利用有限稀釋法篩選陽性細(xì)胞單克??；從而獲得靶向基因shRNA干擾豬藍(lán)耳病病毒增殖的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系； 上述培養(yǎng)和篩選的條件均為于37°C，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)； G418濃度為120(^g/ml的篩選培養(yǎng)基的制備方法為培養(yǎng)基中加入G418直至G418的濃度為120(^g/ml，該培養(yǎng)基為含有10%胎牛血清的DMEM基本培養(yǎng)基； G418濃度為60(^g/ml的篩選培養(yǎng)基的制備方法為培養(yǎng)基中加入G418直至G418的濃度為60(^g/ml，該培養(yǎng)基為含有10%胎牛血清的DMEM基本培養(yǎng)基。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述方法構(gòu)建而得的靶向基因shRNA干擾豬藍(lán)耳病病毒增殖的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系的用途，其特征是對PRRSV型病毒具有抑制作用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種靶向基因shRNA干擾豬藍(lán)耳病病毒增殖的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系的構(gòu)建方法，設(shè)計能有效阻止豬藍(lán)耳病病毒增殖和復(fù)制的靶向基因shRNA，并通過轉(zhuǎn)座子載體插入供體細(xì)胞的基因組，從而獲得能有效阻止藍(lán)耳病病毒感染的克隆細(xì)胞系。本發(fā)明還同時公開了重組載體PXL-BAC2-FRT-EGFP-NEO-shRNA的構(gòu)建方法，包括設(shè)計靶向基因shRNA--ORF6-6e，通過PCR擴增zsGFP和NEO片段，將ORF6-6e的shRNA酶切連接到pMD18-T Simple載體上，并通過酶切，回收、連接到PXL-BAC2載體上。本發(fā)明還同時公開了該轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系的用途對PRRSV型病毒具有抑制作用。
文檔編號A61P31/14GK102876699SQ201210365489
公開日2013年1月16日 申請日期2012年9月27日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月27日
發(fā)明者繆云根, 周芳 申請人:浙江大學(xué)