含雞傳染性法氏囊病病毒亞單位抗原的疫苗組合物及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種含雞傳染性法氏囊病病毒亞單位抗原的疫苗組合物，該疫苗組合物含有免疫量的重組VP2蛋白和佐劑；該亞單位基因工程疫苗組合物能夠有效地防治雞傳染性法氏囊病，該重組抗原蛋白采用的純化技術(shù)顯著減少了疫苗組合物中內(nèi)毒素的含量，明顯降低雞個(gè)體的副反應(yīng)，大大提高了疫苗的安全性。
【專利說明】含雞傳染性法氏囊病病毒亞單位抗原的疫苗組合物及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種含雞傳染性法氏囊病病毒亞單位抗原的疫苗組合物，屬于獸藥領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]傳染性法氏囊病是由傳染性法氏囊病病毒(Infectious BursalDiseaseVirus, IBDV)導(dǎo)致的一種高度接觸性傳染病。以法氏囊腫大、肝臟損傷為主要特征，能引起雛雞的免疫抑制。該病呈世界性分布，我國也時(shí)有發(fā)生，造成了嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失。
[0003]雞傳染性法氏囊病活疫苗主要分為傳染性法氏囊病囊體組織滅活疫苗和傳染性法氏囊病毒細(xì)胞培養(yǎng)滅活疫苗；滅活疫苗目前在市場(chǎng)上存在有20多種，包括2512HEP、LZD228、Lukert、228E、D78 及 B2 等。
[0004]IBDV的VP2上至少包含3組抗原表位即中和性抗原表位、非中和性抗原表位及毒力相關(guān)性抗原表位，VP2具有血清型特異性位點(diǎn)，并能誘導(dǎo)產(chǎn)生抗病毒的血清中和抗體，是IBDV的主要保護(hù)性抗原基因。動(dòng)物免疫試驗(yàn)表明，大腸桿菌表達(dá)的IBDV VP2免疫SPF雞后在抵抗強(qiáng)毒攻擊的同時(shí)，會(huì)伴隨著很強(qiáng)的副作用，可能與疫苗中包括大量的大腸桿菌產(chǎn)內(nèi)毒素有關(guān)。而酵母表達(dá)的IBDV VP2免疫SPF雞后，能夠產(chǎn)生特異性抗體，并在一定程度上抵抗超強(qiáng)毒的致死性攻擊，但還不能保護(hù)法氏囊組織完全不受侵害和損傷，免疫效果尚不如常規(guī)滅活疫苗和大腸桿菌產(chǎn)的亞單位疫苗，這可能是與酵母表達(dá)的過程中VP2蛋白中的過度糖基化、免疫劑量和佐劑 配比等因素有關(guān)。
[0005]隨著我國養(yǎng)雞業(yè)的集約化發(fā)展，傳染性法氏囊病已成為危害養(yǎng)雞業(yè)的一種主要傳染病，變異株和超強(qiáng)株的出現(xiàn)，使該病防制的難度加大，目前雖然研制了多種商品化的弱毒疫苗和滅活疫苗，但其安全性和制作工藝尚有不盡人意之處。如為抵抗超強(qiáng)毒的攻擊，使用中強(qiáng)毒力的毒株研制活疫苗，給IBD的防制帶來極大的隱患；滅活苗存在著抗原制備的困難。因此，亟需免疫原性好、安全性高的新型疫苗問世。用大腸桿菌、酵母、桿狀病毒表達(dá)IBDV vp2等系統(tǒng)，普遍存在表達(dá)量低，副反應(yīng)大，保護(hù)率不高等缺點(diǎn)。用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)研究開發(fā)亞單位疫苗和活菌載體疫苗的研究也進(jìn)行了多年，但已知的研究結(jié)果是，大腸桿菌表達(dá)IBDVVP2蛋白無免疫原性或形成不溶性包涵體無法用作疫苗。
[0006]Rong J 等人(Jun Rong, Taipin Cheng, Xiaona Liu, Taozhen Jiang, HongGu, Guolin Zou，預(yù)防雛雞傳染性法氏囊病的新型重組VP2疫苗，Vaccine 23(2005)4844 -4851)在大腸桿菌中表達(dá)出VP2蛋白，請(qǐng)參見圖1，蛋白免疫印跡分析重組蛋白，蛋白條帶用辣根過氧化物酶標(biāo)簽顯色，泳道I和2分別為E.coli BL21/pET28a克隆的可溶性提取物，泳道3和4分別為E.coli BL21/pET28a-VP2克隆的可溶性提取物；并證實(shí)VP2亞單位疫苗能有效保護(hù)雞受到高致病性傳染性法氏囊病病毒的侵襲。然而，現(xiàn)有技術(shù)中存在以下兩種問題:
[0007]1、現(xiàn)有技術(shù)所得到的VP2蛋白多以包涵體形式存在，生產(chǎn)成本高。[0008]2、現(xiàn)有技術(shù)純化后的蛋白中內(nèi)毒素含量高，會(huì)引起嚴(yán)重的負(fù)反應(yīng)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]因此，本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是:
[0010]1、減少包涵體的形成，增加VP2蛋白的可溶性表達(dá)的量，降低生產(chǎn)成本。
[0011]2、采用新的純化技術(shù)減少VP2蛋白中內(nèi)毒素的含量，降低負(fù)反應(yīng)。
[0012]本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，將雞傳染性法氏囊病病毒VP2 cDNA克隆到表達(dá)載體中，優(yōu)化重組蛋白分離、純化技術(shù)，提供一種E.Coli VP2菌種和用所述菌種生產(chǎn)IBD基因工程亞單位疫苗和生產(chǎn)IBD基因工程疫苗的方法及應(yīng)用。
[0013]本發(fā)明首先要解決的技術(shù)問題是將雞傳染性法氏囊病病毒VP2cDNA克隆到表達(dá)載體中，提供一種適合在大腸桿菌中高效表達(dá)的雞傳染性法氏囊病病毒重組VP2 cDNA。
[0014]本發(fā)明提供了一種DNA序列，所述序列實(shí)質(zhì)上編碼含有SEQ.N0.2的氨基酸序列，本發(fā)明中的術(shù)語“實(shí)質(zhì)上含有”是指本發(fā)明的基因或多肽在保持其功能的范圍內(nèi)，序列號(hào)I的核酸序列，序列號(hào)2的氨基酸序列可以發(fā)生置換、插入或缺失等變異。
[0015]本發(fā)明所要解決的第一個(gè)技術(shù)問題是提供一個(gè)含有SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的大腸桿菌表達(dá)載體及含有所述表達(dá)載體的大腸桿菌，并能表達(dá)SEQ ID NO:2所不氨基酸序列的蛋白質(zhì)，與Genebank公布的超強(qiáng)毒株VP2基因序列同源性較高。
[0016]本發(fā)明所要解決的第一個(gè)技術(shù)問題是通過以下技術(shù)途徑實(shí)現(xiàn)的:
[0017]—種重組大腸桿菌表達(dá)載體,含有IBDV VP2基因核苷酸序列。
`[0018]本發(fā)明提供了一種重組DNA表達(dá)載體，所述DNA表達(dá)載體的多克隆位點(diǎn)間包含所述實(shí)質(zhì)上編碼含有SEQ.N0.2的DNA序列，所述表達(dá)載體包括pCold III表達(dá)載體。
[0019]本發(fā)明的重組大腸桿菌表達(dá)載體可通過本領(lǐng)域的常規(guī)方法構(gòu)建而成，即將IBDVVP2基因插入到大腸桿菌表達(dá)載體合適的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)之間，使IBDV VP2基因可操作的與大腸桿菌表達(dá)調(diào)控序列相連接。作為本發(fā)明的一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案，優(yōu)選為將IBDVVP2基因核苷酸序列插入到大腸桿菌表達(dá)載體pCold III的多克隆位點(diǎn)之間，使所述核苷酸序列位于冷休克基因(CspA)啟動(dòng)子和lac Z啟動(dòng)子的下游并受其調(diào)控，得到重組大腸桿菌表達(dá)載體。
[0020]本發(fā)明所述構(gòu)建的重組大腸桿菌表達(dá)載體可通過常規(guī)的方法轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，所述的宿主細(xì)胞類型可為DH5c1、BL21。作為本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，優(yōu)選為將重組大腸桿菌表達(dá)載體采用CaCl2轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化BL21 (DE3)大腸桿菌株(E Col1.BL21 (DE3))。
[0021]本發(fā)明所要解決的第二個(gè)技術(shù)問題是提供一種雞傳染性法氏囊病病毒重組VP2蛋白，所述重組蛋白具有雞傳染性法氏囊病病毒天然蛋白的生物學(xué)活性和免疫原性。
[0022]本發(fā)明提供了一種雞傳染性法氏囊病病毒重組VP2蛋白，所述蛋白實(shí)質(zhì)上含有SEQ.N0.2的氨基酸序列。
[0023]本發(fā)明所要解決的第二個(gè)技術(shù)問題是通過以下技術(shù)途徑實(shí)現(xiàn)的:
[0024]一種雞傳染性法氏囊病病毒重組VP2蛋白，所述重組VP2蛋白主要由IBDV VP2基因核苷酸序列所編碼。
[0025]本發(fā)明所要解決的第三個(gè)技術(shù)問題是提供一種制備雞傳染性法氏囊病病毒重組VP2蛋白的方法。[0026]本發(fā)明提供了一種制備雞傳染性法氏囊病病毒重組VP2蛋白的方法，所述方法包括以下步驟:
[0027]用所述的重組DNA表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌，誘導(dǎo)所述重組VP2蛋白的表達(dá)，回收并純化表達(dá)的所述重組VP2蛋白；
[0028]其中，所述大腸桿菌包括DH5 a、BL21。
[0029]本發(fā)明所要解決的第四個(gè)技術(shù)問題是提供一種純化雞傳染性法氏囊病病毒重組抗原蛋白的方法，所述方法能有效地清除重組抗原蛋白中的絕大部分內(nèi)毒素。
[0030]純化所述重組抗原蛋白的方法包括以下步驟:
[0031]將表達(dá)的所述重組抗原蛋白溶液和終濃度為1%的Triton X-114渦旋振蕩；所述溶液混勻后在冰上放置5分鐘，冷卻后，所述溶液立即放入37°C水浴中溫浴5min，使得所述溶液產(chǎn)生新的兩相；然后所述溶液在37°C離心60s ;離心過后，吸取所述溶液上部水相，使用所述水相再次用Triton X-114提純,整個(gè)操作循環(huán)3次。
[0032]本發(fā)明所要解決的第五個(gè)技術(shù)問題是提供一種含雞傳染性法氏囊病病毒亞單位抗原的疫苗組合物，其中，所述疫苗組合物中內(nèi)毒素含量為l(Tl00EU/ml。
[0033]優(yōu)選地，所述雞傳染性法氏囊病毒亞單位抗原為免疫量的重組VP2蛋白，所述疫苗組合物包括佐劑；更優(yōu)選地，所述的重組VP2蛋白AGP抗原效價(jià)在1:8-1:64之間，所述佐劑為油佐劑。
[0034]本發(fā)明提供的所述的亞單位基因工程疫苗組合物可進(jìn)一步包含其他抗原，所述抗原包括雞新城疫抗原、雞傳染性支氣管炎抗原。
[0035]本發(fā)明所述重組VP2蛋白可按照本領(lǐng)域常規(guī)的方法制備成蛋白亞單位基因工程疫苗。`
[0036]本發(fā)明提供了一種制備含雞傳染性法氏囊病病毒亞單位抗原的疫苗組合物的方法，用PBS磷酸鹽緩沖液將所述重組VP2蛋白溶液稀釋至600 μ g/mL,然后將所述重組蛋白溶液與佐劑按1:2的比例混勻，乳化。
[0037]本發(fā)明提供了一種含雞傳染性法氏囊病病毒亞單位抗原的疫苗組合物預(yù)防和治療雞傳染性法氏囊病的應(yīng)用。
[0038]本發(fā)明提供的所述的亞單位抗原的疫苗組合物能夠有效地防治雞傳染性法氏囊病，并顯著減少了疫苗組合物中內(nèi)毒素的含量，明顯降低雞個(gè)體的副反應(yīng)，大大提高了疫苗的安全性。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0039]圖1為現(xiàn)有技術(shù)中重組VP2的Western-blotting分析；
[0040]圖2為內(nèi)毒素檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線圖；
[0041]圖3為Triton X-114清除粗提VP2蛋白中內(nèi)毒素效果圖；
[0042]圖4為IBDV-VP2基因工程亞單位疫苗對(duì)雞的體重增加的影響；
[0043]圖5為內(nèi)毒素清除與否對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的體重增加的影響；
[0044]圖6為IBDV-VP2基因工程亞單位疫苗與其它疫苗聯(lián)合使用對(duì)雞只體重增長的影響。
[0045]附圖標(biāo)記[0046]圖1蛋白免疫印跡分析重組蛋白，蛋白條帶用辣根過氧化物酶標(biāo)簽顯色，泳道I和2分別為E.coli BL21/pET28a克隆的可溶性提取物，泳道3和4分別為E.coli BL21/pET28a-VP2克隆的可溶性提取物。
【具體實(shí)施方式】
[0047]下面結(jié)合具體實(shí)施例來進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會(huì)隨著描述更為清楚。但這些實(shí)施例僅是范例性的，并不對(duì)本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
[0048]實(shí)施例1:pCold III _IBDV_VP2表達(dá)體系的構(gòu)建
[0049]1、實(shí)驗(yàn)材料
[0050]質(zhì)粒提取試劑盒購自天根生物；T4 DNA Ligase購自BioLab ;EcoRl、Sail限制性內(nèi)切酶、pCold III _DH5 α菌株購自TaKaRa ;瓊脂糖凝膠膠回收試劑盒購自天澤生物，其他試劑均為分析純。
[0051]2、實(shí)驗(yàn)步驟
[0052]2.1VP2 cDNA 制備
[0053]2.1.1 總 RNA 的提取
[0054]總RNA簡要過程 如下:將感染雞傳染性法氏囊病病毒超強(qiáng)毒LQ9株的SPF雞法氏囊用研磨器研磨。取200 μ L病料補(bǔ)加TE (IOmM Tris, ImM EDTA，ρΗ8.0)至500 μ L，加入5yL蛋白酶K和10% (W/V)十二烷基磺酸鈉(SDS)50 μ L，56°C水浴3小時(shí)。加入等體積苯酚/氯仿(1: 1，V/V)抽提3次，等體積氯仿抽提一次。移出上清至另一 1.5mL離心管，加入1/10體積的NaAc (3M, pH5.2)、等體積異丙醇，_20°C沉淀2小時(shí)。4°C、10000轉(zhuǎn)/分離心15分鐘，用75%乙醇洗一次。真空干燥，將RNA用無RNA酶去離子水0.5ml重新溶解。
[0055]2.1.2 VP2 cDNA 制備
[0056]根據(jù)VP2基因5’和3’末端的保守區(qū)序列合成寡聚核苷酸引物，每個(gè)引物的5’端包含一個(gè)方便將基因克隆到載體上的限制酶切位點(diǎn)。這對(duì)引物被用來進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增生成cDNA。合成寡聚核苷酸引物序列如下:
[0057]VP2-EcoRl-f:CCGGAATTCATGACAAACCTGCAAGATCAAAC
[0058]VP2-Sall-r:ACGCGTCGACTTACCTTAGGGCCCGGATTATGT
[0059]2.2含酶切位點(diǎn)的VP2片段擴(kuò)增
[0060]對(duì)上述制備的VP2 cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并利用瓊脂糖凝膠膠回收試劑盒回收，-20°C保存。
[0061]2.3pCold III質(zhì)粒 EcoRl、Sall 雙酶切
[0062]利用EcoRl、Sail對(duì)pCold III質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，形成具有粘性末端的連接片段，反
應(yīng)體系如下:
[0063]
【權(quán)利要求】
1.一種DNA序列，所述序列實(shí)質(zhì)上編碼含有SEQ.N0.2的氨基酸序列。
2.—種重組DNA表達(dá)載體，所述DNA表達(dá)載體的多克隆位點(diǎn)間包含如權(quán)利要求1所述的DNA序列,所述質(zhì)粒包括pCold III質(zhì)粒。
3.一種雞傳染性法氏囊病病毒重組VP2蛋白，所述蛋白實(shí)質(zhì)上含有SEQ.N0.2的氨基酸序列。
4.一種制備雞傳染性法氏囊病病毒重組VP2蛋白的方法，所述方法包括以下步驟: 用如權(quán)利要求2所述的重組DNA表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌，誘導(dǎo)所述重組VP2蛋白的表達(dá)，回收并純化表達(dá)的所述重組VP2蛋白； 其中，所述大腸桿菌包括DH5 a、BL21。
5.一種純化雞傳染性法氏囊病病毒重組抗原蛋白的方法，所述方法包括以下步驟: 將表達(dá)的所述重組抗原蛋白溶液和終濃度為1%的Triton X-114渦旋振蕩；所述溶液混勻后在冰上放置5分鐘，冷卻后，所述溶液立即放入37°C水浴中溫浴5min，使得所述溶液產(chǎn)生新的兩相；然后所述溶液在37°C離心60s ;離心過后，吸取所述溶液上部水相，使用所述水相再次用Triton X-114提純，整個(gè)操作循環(huán)3次。
6.一種含雞傳染性法氏囊病病毒亞單位抗原的疫苗組合物，其中，所述疫苗組合物中內(nèi)毒素含量為10~100EU/ml。
7.如權(quán)利要求6所述的疫苗組合物，其中，所述雞傳染性法氏囊病病毒亞單位抗原為免疫量的的重組VP2蛋白，·所述疫苗組合物包括佐劑；優(yōu)選地，所述的重組VP2蛋白AGP抗原效價(jià)在1:8-1:64之間，所述佐劑為油佐劑。
8.如權(quán)利要求6所述的疫苗組合物，所述疫苗組合物進(jìn)一步包含其他抗原，所述抗原包括雞新城疫抗原、雞傳染性支氣管炎抗原。
9.一種制備如權(quán)利要求7所述的疫苗組合物的方法，用PBS磷酸鹽緩沖液將所述重組VP2蛋白溶液稀釋至600 μ g/mL，然后將所述重組蛋白溶液與佐劑按1:2的比例混勻，乳化。
10.權(quán)利要求6~7任一項(xiàng)所述的疫苗組合物在預(yù)防和治療雞傳染性法氏囊病的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】A61P31/14GK103849631SQ201210494909
【公開日】2014年6月11日 申請(qǐng)日期:2012年11月28日 優(yōu)先權(quán)日:2012年11月28日
【發(fā)明者】張?jiān)S科, 孫進(jìn)忠, 白朝勇 申請(qǐng)人:普萊柯生物工程股份有限公司