人類notch1引誘物的制作方法
【專利摘要】本文提供Notch1融合蛋白。這些融合蛋白包含連續(xù)氨基酸，所述氨基酸的序列開始于所述融合蛋白的N端并與人類Notch1受體蛋白的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域和抗體的Fc部分中的氨基酸序列相同。所述人類Notch1受體蛋白的所述細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域(ECD)的所述氨基酸序列以存在于EGF樣重復(fù)序列(10)的N端的氨基酸開始，并至少延伸到EGF樣重復(fù)序列(23)的C端氨基酸。所述人類Notch1受體蛋白的所述ECD的N端部分可延伸到EGF樣重復(fù)序列(24)的C端氨基酸或可延伸到EGF樣重復(fù)序列(36)的C端氨基酸。還提供了這些融合蛋白的組合物。還提供了使用本文中描述的所述融合蛋白治療年齡相關(guān)性黃斑變性(AMD)、糖尿病性視網(wǎng)膜病變以及癌癥的方法。
【專利說明】人類N0TCH1引誘物
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本申請(qǐng)案要求2011年10月4日申請(qǐng)的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)案第61/543，186號(hào)的優(yōu)先權(quán)，所述申請(qǐng)案的內(nèi)容特此以引用的方式并入。
[0002]在整個(gè)本申請(qǐng)案中，按作者和括號(hào)內(nèi)的出版日期引用各種公開案。這些公開案的完整引文可見于本說明書的結(jié)尾處或每一實(shí)驗(yàn)部分的結(jié)尾處。這些公開案的揭示內(nèi)容特此以引用的方式并入本申請(qǐng)案中，以更充分描述本發(fā)明所屬領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0003]Notch蛋白在涉及脈管系統(tǒng)、造血系統(tǒng)以及神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育決定中起關(guān)鍵作用。因此，對(duì)其功能的了解是了解如何在發(fā)育期間和在成人組織中控制細(xì)胞命運(yùn)決定和承諾的關(guān)鍵。迄今，若干關(guān)于Notch或Notch配體基因破壞的報(bào)導(dǎo)已描述血管表型，強(qiáng)調(diào)此路徑是指導(dǎo)血管發(fā)育的機(jī)制的基本部分。異常Notch活性與人類病理學(xué)有關(guān)；包括癌癥和血管性病癥(CADASIL)兩者。對(duì)腫瘤血管生成中Notch的分析最近才開始；然而對(duì)Notch的可能下游標(biāo)靶的發(fā)現(xiàn)表明在與血管生成相關(guān)的病理過程中的作用。舉例來說，VEGFR-3與腫瘤血管生成和腫瘤淋巴管生成兩者有關(guān)。若干其它可能Notch標(biāo)靶的表達(dá)或功能也與腫瘤血管生成相關(guān)；包括印hrinB2、Id3、血管生成素I以及TOGF-B。對(duì)這些標(biāo)靶在Notch基因功能中的作用的見解將明顯促 進(jìn)未來對(duì)人類病理學(xué)中Notch的分析。
[0004]本發(fā)明的其它背景可見于美國(guó)專利申請(qǐng)公開案第US2011-0008342A1號(hào)，其全部?jī)?nèi)容特此以引用的方式并入本申請(qǐng)案中，以更充分描述本發(fā)明所屬領(lǐng)域。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明提供一種融合蛋白，其包含連續(xù)氨基酸，所述氨基酸的序列開始于融合蛋白的N端并與以下中的氨基酸序列相同:
[0006](a)人類Notchl受體蛋白的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域，之后為
[0007](b)抗體的Fe部分，
[0008]其中人類Notchl受體蛋白的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域
[0009]⑴以存在于EGF樣重復(fù)序列10的N端的氨基酸開始，且
[0010](ii)至少延伸到EGF樣重復(fù)序列23的C端氨基酸。
[0011 ] 在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明的融合蛋白包含氨基酸序列，所述氨基酸序列與延伸到EGF樣重復(fù)序列24的C端氨基酸的人類Notchl受體蛋白的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列相同。在另一實(shí)施例中，融合蛋白包含氨基酸序列，所述氨基酸序列與延伸到EGF樣重復(fù)序列36的C端氨基酸的人類Notchl受體蛋白的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列相同。
[0012]在一個(gè)目前優(yōu)選實(shí)施例中，本發(fā)明的融合蛋白包含NotchlEGF樣重復(fù)序列10-24(在本文中也指示為Notchl引誘物10-24)。此融合蛋白結(jié)合于JAGGED-1而不結(jié)合于D114使蛋白能夠避免由D114路徑抑制引起的令人不愉快的副作用，如肝毒性、血管贅瘤或心臟和肺中的壞死。[0013]由于其對(duì)JAGGED-1的配體特異性，還考慮并預(yù)期Notchl引誘物10_24融合蛋白將展示抗JAGGED相關(guān)腫瘤惡性疾病(如乳癌、頭頸部鱗狀細(xì)胞癌(HNSCC))和其中JAGGED配體被報(bào)導(dǎo)為由生長(zhǎng)因子高度表達(dá)或誘導(dǎo)的相關(guān)癌癥的優(yōu)異抗腫瘤活性。
[0014]另外，考慮了此融合蛋白相對(duì)于來自先前描述的Notchl融合蛋白的經(jīng)轉(zhuǎn)染細(xì)胞的分泌概況將具有優(yōu)異的分泌概況。此又將為蛋白純化提供改進(jìn)的效率。
[0015]本發(fā)明進(jìn)一步提供包含所述融合蛋白和載劑的組合物。
[0016]本發(fā)明還提供了一種治療罹患年齡相關(guān)性黃斑變性(AMD)的個(gè)體的方法，所述方法包含以有效治療個(gè)體的AMD的量向個(gè)體投與本發(fā)明的融合蛋白。
[0017]另外，本發(fā)明提供了一種治療罹患糖尿病性視網(wǎng)膜病變的個(gè)體的方法，所述方法包含以有效治療個(gè)體的糖尿病性視網(wǎng)膜病變的量向個(gè)體投與本發(fā)明的融合蛋白。
[0018]本發(fā)明再進(jìn)一步提供了一種治療罹患癌癥的個(gè)體的方法，所述方法包含以有效治療個(gè)體的癌癥的量向個(gè)體投與本發(fā)明的融合蛋白。
[0019]本發(fā)明還提供了一種治療罹患年齡相關(guān)性黃斑變性(AMD)的個(gè)體的方法，所述方法包含以有效治療個(gè)體的AMD的量向個(gè)體投與融合蛋白，其中所述融合蛋白包含連續(xù)氨基酸，所述氨基酸的序列開始于融合蛋白的N端并與以下中的氨基酸序列相同:
[0020](a)人類Notchl 受體蛋白的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域，之后為
[0021](b)抗體的Fe部分，
[0022]其中人類Notchl受體蛋白的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域
[0023](i)包含存在于EGF樣重復(fù)序列9的N端的氨基酸，且
[0024](ii)至少延伸到EGF樣重復(fù)序列13的C端氨基酸，
[0025]其限制條件為如果N端氨基酸是EGF樣重復(fù)序列I的N端氨基酸，那么C端氨基酸并非EGF樣重復(fù)序列36的C端氨基酸。
[0026]本發(fā)明還提供了一種治療罹患糖尿病性視網(wǎng)膜病變的個(gè)體的方法，所述方法包含以有效治療個(gè)體的糖尿病性視網(wǎng)膜病變的量向個(gè)體投與融合蛋白，其中所述融合蛋白包含連續(xù)氨基酸，所述氨基酸的序列開始于融合蛋白的N端并與以下中的氨基酸序列相同:
[0027](a)人類Notchl受體蛋白的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域，之后為
[0028](b)抗體的Fe部分，
[0029]其中人類Notchl受體蛋白的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域
[0030](i)包含存在于EGF樣重復(fù)序列9的N端的氨基酸，且
[0031](ii)至少延伸到EGF樣重復(fù)序列13的C端氨基酸，
[0032]其限制條件為如果N端氨基酸是EGF樣重復(fù)序列I的N端氨基酸，那么C端氨基酸并非EGF樣重復(fù)序列36的C端氨基酸。
[0033]本發(fā)明進(jìn)一步提供了一種治療罹患癌癥的個(gè)體的方法，所述方法包含以有效治療個(gè)體的癌癥的量向個(gè)體投與融合蛋白，其中所述融合蛋白包含連續(xù)氨基酸，所述氨基酸的序列開始于融合蛋白的N端并與以下中的氨基酸序列相同:
[0034](a)人類Notchl受體蛋白的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域，之后為
[0035](b)抗體的Fe部分，
[0036]其中人類Notchl受體蛋白的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域
[0037](i)包含存在于EGF樣重復(fù)序列9的N端的氨基酸，且[0038](ii)至少延伸到EGF樣重復(fù)序列13的C端氨基酸，
[0039]其限制條件為如果N端氨基酸是EGF樣重復(fù)序列I的N端氨基酸，那么C端氨基酸并非EGF樣重復(fù)序列36的C端氨基酸。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0040]圖1a-1b:截短型Notchl引誘物變體的示意圖。圖1a是Notchl引誘物1_36和Notchl引誘物1-24的示意圖，所述Notchl引誘物各自與Dl 14和JAGGED-1兩者相互作用并充當(dāng)泛Notch抑制劑。圖1b是四個(gè)截短型Notchl引誘物變體10-36、14-36、10-24以及14-24的示意圖。
[0041]圖2a_2b:截短型Notchl引誘物變體在293T細(xì)胞中的表達(dá)和分泌。圖2a展示總細(xì)胞溶解產(chǎn)物和上清液的蛋白印跡法以及Notchl引誘物1-13、1-24以及1_36的分子量。圖2b展示總細(xì)胞溶解物和上清液的蛋白印跡法以及Notchl引誘物10-36、14-36、10-24以及14-24的分子量。
[0042]圖3a_3c:引誘物1_13、1_24以及1-36的Notch報(bào)導(dǎo)某閔分析。圖3a含有多個(gè)與熒光素酶基因連接的CSL結(jié)合位點(diǎn)的Notch報(bào)導(dǎo)基因構(gòu)筑體的示意圖。圖3b顯示表達(dá)DLL4的HELA細(xì)胞的結(jié)果。圖3c顯示表達(dá)JAGGED-1的HELA細(xì)胞的結(jié)果。
[0043]圖4a_4b:引誘物10-26、14-36、10-24以及14-24的Notch報(bào)導(dǎo)基因分析。圖4a顯示表達(dá)DLL4的HELA細(xì)胞的結(jié)果。圖4b顯示表達(dá)JAGGED-1的HELA細(xì)胞的結(jié)果。
[0044]圖5a_5b:293T細(xì)胞溶解產(chǎn)物的使用抗Fe或抗FLAG抗體的免疫印跡法，所述293T細(xì)胞溶解產(chǎn)物經(jīng)Notchl引誘物和可溶性(圖5a)或全長(zhǎng)(圖5b)Notchl配體共轉(zhuǎn)染。
[0045]圖6 =Notchl引誘物和Notchl的共免疫沉淀。
[0046]圖7a_7c:在第P2天注射表達(dá)不同Notchl引誘物的腺病毒之后P5小鼠視網(wǎng)膜的同工凝集素B4染色。圖7a是對(duì)照引誘物、Notchl引誘物1_13、NotchlO-24引誘物以及DAPT。圖 7b 是 Fc、Notchl 引誘物 1-13,Notchl 引誘物 10-24 以及 Notchl 引誘物 1-24。在圖7c中定量視網(wǎng)膜的血管區(qū)域。平均血管覆蓋區(qū)域土S.D.*P值〈0.05。
[0047]圖8a_8d:表汰Notchl引誘物的HUVEC的基因表達(dá)剖析。圖8a、8b、8c以及8d中分別闡述Notch受體(Notchl、Notch2、Notch3以及Notch4)的mRNA轉(zhuǎn)錄物的定量RT-PCR。
[0048]圖9a_9b:表汰Notchl引誘物的HUVEC的基因表達(dá)剖析。圖9a中為HEYl的mRNA轉(zhuǎn)錄物的定量RT-PCR。圖9b中為HEY2的mRNA轉(zhuǎn)錄物的定量RT-PCT0
[0049]圖1Oa-1Ob:表汰Notchl引誘物的HUVEC的基因表達(dá)剖析。圖1Oa中為HEYL的mRNA轉(zhuǎn)錄物的定量RT-PCR。圖1Ob中為HESl的mRNA轉(zhuǎn)錄物的定量RT-PCT0
[0050]圖1la-1le:表汰Notchl引誘物的HUVEC的基因表達(dá)剖析。圖1la中為DLL4的mRNA轉(zhuǎn)錄物的定量RT-PCR ;圖1lb中為JAGGED-1的mRNA轉(zhuǎn)錄物的定量RT-PCR ;圖1le中為VEGFR-1的mRNA轉(zhuǎn)錄物的定量RT-PCR ;圖1ld中為VEGFR-2的mRNA轉(zhuǎn)錄物的定量RT-PCR ；且圖1le中為VEGFR-3的mRNA轉(zhuǎn)錄物的定量RT-PCR。
[0051]M 12a-12c:VEGF 受體的流式細(xì)胞術(shù)。表達(dá) VEGFR-1 (圖 12a) ；VEGFR-2 (圖 12b)以及VEGFR-3 (圖12c)的Notch引誘物的HUVEC的直方圖。
[0052]圖13a和13b:表汰Notchl引誘物的HUVEC的基因表達(dá)剖析。圖13a和13b兩者中為全長(zhǎng)VEGFR-1和可溶性VEGFR-1的mRNA轉(zhuǎn)錄物的定量RT-PCR。[0053]圖14:在小鼠乳房腫瘤細(xì)胞(Mm5MT)、人類胰臟癌細(xì)胞(KPl)、小鼠路易斯肺癌細(xì)胞(LLC)以及小鼠黑色素瘤細(xì)胞(B16-F10)中表達(dá)的Notch受體和配體的基因表達(dá)剖析。
[0054]圖15a-15d:Notch引誘物1_13、10-24以及1_24對(duì)Mm5MT和KPl腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡的作用。圖15a為在Mm5MT-FGFT細(xì)胞中的腫瘤增殖研究的結(jié)果。圖15b為在KPl-VEGF中的增殖研究的結(jié)果。在右上象限中指示凋亡細(xì)胞的百分比。平均凋亡細(xì)胞百分比土S.D.。圖15c為在Mm5MT-FGF4中的細(xì)胞凋亡研究的結(jié)果。圖15d為在KPl-VEGF中的細(xì)胞凋亡研究的結(jié)果。
[0055]圖16a_16c:圖16a為小鼠血清中Fe、Notchl引誘物1_13、10_24以及1-24的蛋白印跡法分析，在所述小鼠中靜脈內(nèi)注射表達(dá)Notchl引誘物1-13、10-24以及1_24或作為對(duì)照的Fe的腺病毒。圖16b和16c為通過抗人類IgG Fe抗體免疫染色且經(jīng)DAPI對(duì)比染色的腫瘤切片。比例尺:30微米。[0056]圖17a_17c:圖17a為表達(dá)Notchl引誘物1_13、10-24、1_24或作為對(duì)照的Fe的小鼠的成像。Notchl引誘物降低Mm5MT腫瘤的生長(zhǎng)。通過Xenogen IVIS成像系統(tǒng)評(píng)估發(fā)光信號(hào)的總輻射率來監(jiān)測(cè)腫瘤生長(zhǎng)，且結(jié)果顯示于圖17b中。在即將收集腫瘤之前最后一天測(cè)量腫瘤重量，且結(jié)果顯示于圖17c中。
[0057]圖18a_18c:圖18a為表達(dá)Notchl引誘物1-13、10-24、1-24或作為對(duì)照的Fe的小鼠的成像。Notchl引誘物降低KPl腫瘤的生長(zhǎng)。通過Xenogen IVIS成像系統(tǒng)評(píng)估發(fā)光信號(hào)的總輻射率來監(jiān)測(cè)腫瘤生長(zhǎng)，且結(jié)果顯示于圖18b中。在即將收集腫瘤之前最后一天測(cè)量腫瘤重量，且結(jié)果顯示于圖18c中。
[0058]圖19a-19b =Notchl引誘物對(duì)腫瘤脈管系統(tǒng)的作用。針對(duì)內(nèi)皮粘蛋白(綠色)和D114(紅色)對(duì)腫瘤切片進(jìn)行免疫染色，且結(jié)果顯示于圖19a中。腫瘤脈管系統(tǒng)的定量是基于腫瘤切片中的內(nèi)皮粘蛋白陽性區(qū)域，且結(jié)果是在圖1%中。
[0059]圖20a_20b:腫瘤內(nèi)皮含量的免疫熒光分析。針對(duì)內(nèi)皮粘蛋白和D114對(duì)KPl腫瘤進(jìn)行免疫染色，且結(jié)果顯示于圖20a中。腫瘤脈管系統(tǒng)的定量是基于KPl腫瘤切片中的內(nèi)皮粘蛋白陽性區(qū)域，且結(jié)果是在圖20b中。
[0060]圖21a_21b =Notchl引誘物對(duì)腫瘤脈管系統(tǒng)的作用。在腫瘤收集之前2分鐘，將熒光黃偶聯(lián)的凝集素(IOOyg)注射到小鼠中。針對(duì)內(nèi)皮粘蛋白(紅色)和所灌注凝集素(綠色)對(duì)腫瘤切片進(jìn)行免疫染色，且所灌注凝集素與腫瘤血管相關(guān)。免疫染色的結(jié)果是在圖21a中。血管相關(guān)凝集素的量反映功能腫瘤脈管系統(tǒng)，且結(jié)果顯示于圖21b中。
[0061]圖22a_22b:針對(duì)內(nèi)皮粘蛋白(綠色)和NG2(紅色)對(duì)腫瘤切片進(jìn)行共免疫染色，且結(jié)果闡述于圖22a中。測(cè)量NG2陽性區(qū)域的百分比作為腫瘤中的周細(xì)胞募集的參數(shù)，且結(jié)果顯示于圖22b中。
[0062]圖23a_23c:來自不同Notch引誘物組的具有發(fā)光信號(hào)的LLC腫瘤負(fù)載小鼠的第12天照片是在圖23a中?；诳傒椛渎时O(jiān)測(cè)并定量腫瘤生長(zhǎng)，且結(jié)果闡述于圖23b中。在第12天腫瘤收集之前測(cè)量腫瘤重量，且結(jié)果顯示于圖23c中。
[0063]圖24a_24c:來自不同Notch引誘物組的具有發(fā)光信號(hào)的B16-F10腫瘤負(fù)載小鼠的第12天照片是在圖24a中。基于總輻射率監(jiān)測(cè)并定量腫瘤生長(zhǎng)，且結(jié)果闡述于圖24b中。在第12天腫瘤收集之前測(cè)量腫瘤重量，且結(jié)果顯示于圖24c中。
[0064]圖25a_25b:在第12天從LLC腫瘤負(fù)載小鼠收集肺和肝，在30mg/mL D-熒光素中孵育并通過Xenogen IVIS成像系統(tǒng)分析。成像結(jié)果闡述于圖25a中?？傒椛渎式Y(jié)果闡述于圖25b中。
[0065]圖26a-26c:在第12天從B16-F10腫瘤負(fù)載小鼠收集肺和肝，在30mg/mL D-熒光素中孵育并使用Xenogen IVIS成像系統(tǒng)分析。來自Fe組的肺成像闡述于圖26a和26b中且肝成像闡述于圖26c中。
[0066]圖27a_27c:Notchl引誘物誘導(dǎo)輕度杯狀細(xì)朐增牛。與泛Notch抑制劑、Notchl引誘物1-24和1-36類似，配體特異性引誘物使杯狀細(xì)胞數(shù)目略微增加。保存小腸的正常結(jié)構(gòu)并與對(duì)照比較。結(jié)果顯示于圖27a中。計(jì)算每視野的平均杯狀細(xì)胞數(shù)目，且結(jié)果顯示于圖27b中。圖27c顯示腫瘤負(fù)載小鼠對(duì)Notchl引誘物耐受良好。未觀測(cè)到處理組與對(duì)照之間的重量變化有顯著差異。平均重量變化土S.D.(η = 5)。
[0067]圖28:人類NOTCHl蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)。
[0068]圖29:人類Notchl引誘物10-24的核酸序列闡沭于SEQ ID NO: 2中。人類Notchl信號(hào)肽對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO: 2的核苷酸1-69，EGF樣重復(fù)序列10-24對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO: 2的核苷酸70-1788，且人類Fe對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO: 2的核苷酸1789-2502。人類Notchl引誘物10-24的氨基酸序列闡述 于SEQ ID Ν0:3中。
[0069]圖30:人類Notchl引誘物10-36的核酸序列闡沭于SEQ ID NO:4中。人類Notchl信號(hào)肽對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:4的核苷酸1-69，EGF樣重復(fù)序列10-36對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:4的核苷酸70-3243，且人類Fe對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO: 4的核苷酸3244-3957。人類Notchl引誘物10-36的氨基酸序列闡述于SEQ ID Ν0:5中。
[0070]圖31:人類Notchl引誘物14-24的核酸序列闡沭于SEQ ID NO:6中。人類Notchl信號(hào)肽對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:6的核苷酸1-69，EGF樣重復(fù)序列14-24對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:6的核苷酸70-1320，且人類Fe對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO: 6的核苷酸1321-2034。人類Notchl引誘物14-24的氨基酸序列闡述于SEQ ID Ν0:7中。
[0071]圖32:人類Notchl引誘物14-36的核酸序列闡沭于SEQ ID NO:8中。人類Notchl信號(hào)肽對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:8的核苷酸1-69，EGF樣重復(fù)序列14-36對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:8的核苷酸70-2775，且人類Fe對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO: 8的核苷酸2776-3489。人類Notchl引誘物14-36的氨基酸序列闡述于SEQ ID Ν0:9中。
[0072]圖33a_33c =Notchl引誘物變體展示對(duì)體外和視網(wǎng)膜血管生成的獨(dú)特作用。圖33a顯示使用HUVEC纖維蛋白珠粒發(fā)芽分析的Notchl引誘物評(píng)估。7天后，內(nèi)皮細(xì)胞形成管樣結(jié)構(gòu)。表達(dá)NI1—13引誘物的HUVEC顯示顯著增加的發(fā)芽。相比之下，表達(dá)N1.24或NI1—24引誘物的HUVEC形成較短、較細(xì)的芽，與Fe對(duì)照相反。在圖33b中定量含有管腔的芽的數(shù)目。平均芽數(shù)目±3.0.撲值〈0.05。視網(wǎng)膜用a SMA免疫染色以鑒定血管平滑肌細(xì)胞。Ν11(ι_24和NI1—24引誘物顯著降低沿視網(wǎng)膜動(dòng)脈的血管平滑肌細(xì)胞覆蓋。結(jié)果顯示于圖33c中。
[0073]圖34a_34c =Notchl引誘物增加內(nèi)皮細(xì)胞i千移。以1.0 X IO5個(gè)細(xì)胞/孔將慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的HUVEC接種于24孔板中，并過夜使其變得匯合。接著，在每一孔中制造劃痕，且對(duì)遷移到受傷區(qū)域中的HUVEC進(jìn)行拍照(圖34a)，并使用TScratch程序定量。平均遷移率土S.D.*P值〈0.03(圖34b)。圖34c顯示，Notchl引誘物增加內(nèi)皮細(xì)胞增殖。以1.0X104個(gè)細(xì)胞/孔將經(jīng)Fc、Notchl引誘物1-13、1-24、1-36或NlIC慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的HUVEC接種于24孔板中。在第I天和第4天定量細(xì)胞數(shù)目。平均細(xì)胞數(shù)目±3.0.撲值〈0.005。[0074]圖35a_35b:表汰Notchl引誘物的HUVEC顯示內(nèi)皮網(wǎng)絡(luò)和分支增加。圖35a.在24孔板中以1.0X IO5個(gè)細(xì)胞/孔將HUVEC接種于膠原層之間并培養(yǎng)4天。圖34b.通過計(jì)數(shù)分支點(diǎn)數(shù)目來定量HUVEC形成網(wǎng)絡(luò)的能力。HUVEC-N1IC和HUVEC-Notch4/in13由于其缺乏適當(dāng)網(wǎng)絡(luò)而不包括在內(nèi)。平均分支點(diǎn)數(shù)目±3.0.撲值〈0.005。
[0075]圖36:針對(duì)Notch配體、JAGGED-1以及DLL4的定量實(shí)時(shí)PCR。與普通培養(yǎng)板或膠原凝膠上的HUVEC比較，在纖維蛋白凝膠上培養(yǎng)的HUVEC顯著上調(diào)JAGGED-1表達(dá)且同時(shí)下調(diào)DLL4表達(dá)。mRNA轉(zhuǎn)錄物的平均相對(duì)值土 S.D.*P值〈0.002。
[0076]圖37a-37b:Notchl 引誘物 1_13、10_24 以及 1_24 減少 Mm5MTFGF4 中的集落形成。圖37a.在24孔板中以3X IO3個(gè)細(xì)胞/孔將Mm5MT_FGF4、KP1-VEGF, LLC以及B16-F10腫瘤細(xì)胞接種于半固體瓊脂培養(yǎng)基中，并培養(yǎng)3周。向培養(yǎng)物中添加3mg/ml MTT以使集落可視化。圖37b.進(jìn)行集落區(qū)域的定量。集落區(qū)域的平均百分比±5.0.撲值〈0.001。
[0077]圖38 =Notchl引誘物阻斷異種移植腫瘤生長(zhǎng)。使用皮下注射到裸小鼠中的Mm5MT-FGF4、KPl-VEGF、LLC或B16-F10評(píng)估腫瘤生長(zhǎng)。腫瘤移植后3天靜脈內(nèi)注射編碼不同Notchl引誘物變體的Ad。在Notchl引誘物治療組中腫瘤顯著較小。在收集時(shí)測(cè)量腫瘤重量。平均腫瘤重量±3.0.樸值〈0.05(11 = 4-5)。
[0078]圖39a-39c:Notchl 引誘物 1_24 和 1_36 類似地降低 Mm5MT_FGF4 (圖 39a)和KPl-VEGF腫瘤(圖39b)的生長(zhǎng)。由長(zhǎng)度(L)和寬度(W)計(jì)算腫瘤體積(V) (V = 0.5XLXW)，其是每周測(cè)量一次。平均腫瘤體積土S.D.*P值〈0.05。Notchl引誘物1-24和1_36顯著減少腫瘤脈管系統(tǒng)。CD31免疫熒光顯示來自Notchl引誘物組的腫瘤中的血管含量降低且結(jié)構(gòu)被破壞。比例尺:30微米。數(shù)據(jù)顯示于圖39c中。
[0079]圖40a_40b =Notchl引誘物阻斷異種移植腫瘤生長(zhǎng)。圖40a顯示，Notchl1-13引誘物阻斷D114/Notch活性且引起腫瘤脈管系統(tǒng)增加，而Notchl.24或Notchl1—24引誘物減少所有腫瘤模型中的腫瘤血管。通過內(nèi)皮粘蛋白免疫熒光(綠色)分析腫瘤脈管系統(tǒng)。圖40b顯示對(duì)圖40a影像中來自多個(gè)腫瘤切片的內(nèi)皮粘蛋白陽性區(qū)域定量的數(shù)據(jù)。內(nèi)皮粘蛋白陽性區(qū)域的平均百分比土S.D.*P值〈0.003 (η = 4-5)。比例尺:30微米。
[0080]S41a-41c =Notchl引誘物破壞腫瘤血管生成，減少灌注且誘導(dǎo)缺氧。針對(duì)內(nèi)皮粘蛋白(紅色)和所灌注凝集素(綠色)對(duì)來自經(jīng)熒光黃偶聯(lián)的凝集素注射的小鼠的腫瘤切片進(jìn)行免疫染色。內(nèi)皮粘蛋白相關(guān)的凝集素的量反映功能性腫瘤脈管系統(tǒng)和正常灌注。用APC偶聯(lián)的抗缺氧探針抗體(紅色)和DAPI (藍(lán)色)對(duì)來自經(jīng)缺氧探針腹膜內(nèi)注射的小鼠的腫瘤切片進(jìn)行免疫染色，并針對(duì)腫瘤缺氧定量。數(shù)據(jù)顯示于圖41a中。凝集素陽性區(qū)域的平均百分比土S.D.*P值〈0.006 (η = 4-5)顯示于圖41b中。缺氧探針陽性區(qū)域的平均百分比土S.D.*P值〈0.002，#P值〈0.05 (η = 4-5)顯示于圖41c中。來自引誘物治療的小鼠的腫瘤顯示缺氧和壞死顯著增加。比例尺:30微米。
[0081]圖42a_42c:Notchl引誘物破壞腫瘤血管生成。Mm5MT_FGF4腫瘤切片的IV型膠原(紅色)和內(nèi)皮粘蛋白(綠色)免疫熒光。IV型膠原的存在與腫瘤脈管系統(tǒng)相關(guān)，表明Notchl引誘物抑制腫瘤血管生成，而不引起血管消退。影像顯示于圖42a中。平均IV型膠原陽性區(qū)域和平均內(nèi)皮粘蛋白陽性區(qū)域土S.D.分別顯示于圖42b和42c中*P值〈0.002。
[0082]圖43a_43d:靶向JAGGED-1的Notchl引誘物破壞腫瘤中的壁細(xì)胞-內(nèi)皮細(xì)胞相互作用。針對(duì)內(nèi)皮粘蛋白(綠色)和NG2(紅色)對(duì)腫瘤切片進(jìn)行共免疫染色。影像顯示于圖43a中。比例尺:10微米。測(cè)量NG2陽性區(qū)域的百分比作為腫瘤中周細(xì)胞覆蓋的參數(shù)。內(nèi)皮粘蛋白或NG2陽性區(qū)域的平均百分比土S.D.分別顯示于圖43a和43b中。圖43d顯示NG2陽性/內(nèi)皮粘蛋白陽性區(qū)域*P值〈0.02 (η = 4-5)。
[0083]圖44:靶向JAGGED-1的Notchl引誘物破壞腫瘤中的壁細(xì)胞-內(nèi)皮細(xì)胞相互作用。針對(duì)內(nèi)皮粘蛋白(綠色)和a SMA(紅色)對(duì)腫瘤切片進(jìn)行共免疫染色。覆蓋有血管平滑肌細(xì)胞的大血管通常位于腫瘤外周。比例尺:10微米。
[0084]圖45:針對(duì)Notch下游標(biāo)靶HEYl、HEY2、HEYL, HESl對(duì)表達(dá)NI引誘物或JAGGED-1shRNA 的 HUVEC 進(jìn)行的定量 RT-PCR。
[0085]圖46:針對(duì)VEGF受體對(duì)表達(dá)Notchl引誘物或JAGGED-1shRNA的HUVEC進(jìn)行的定量RT-PCR和流式細(xì)胞術(shù)。
[0086]圖47a_47b:圖47a顯示針對(duì)VEGF等體對(duì)表汰Notchl引誘物的HUVEC或講行的定量RT-PCR。圖47b顯示可溶性VEGFR-1的酶聯(lián)免疫吸附分析的結(jié)果。
[0087]圖48a_48b:對(duì)腫瘤切片的VEGFR-1免疫熒光證實(shí)NIich24引誘物和1_24增加可溶性VEGFR-1表達(dá)。免疫熒光影像顯示于圖48A中。平均VEGFR-1陽性區(qū)域土S.D.顯示于圖48b中*P值〈0.02。比例尺:30微米。
[0088]圖49 jNotchl引誘物對(duì)其它Dll和Jag家族成員的配體特異性。在與表達(dá)Notch配體的HeLa細(xì)胞共培養(yǎng)的表達(dá)全長(zhǎng)大鼠Notchl和IICSL-Luc的HeLa細(xì)胞中測(cè)量Notch信號(hào)活化。僅Nll-13、Nl1J4以及NV36引誘物抑制DLLl誘導(dǎo)的Notch信號(hào)傳導(dǎo)，表明EGF樣重復(fù)序列1-9對(duì)抑制DLLl誘導(dǎo)的Notch信號(hào)傳導(dǎo)是必不可少的。然而，Nl1^13引誘物并不抑制JAG2。僅NIich24能阻斷JAG2，暗示Notchl的EGF樣重復(fù)序列10-24賦予JAGGED特異性。平均熒光素酶誘導(dǎo)倍數(shù)土 S.D.*P值〈0.005。
【具體實(shí)施方式】
[0089]術(shù)語
[0090]如本申請(qǐng)案中所用，除非本文中另外明確提供，否則以下術(shù)語中的每一者應(yīng)具有下文所述含義。
[0091]“投與”可使用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的任何方法來實(shí)現(xiàn)或進(jìn)行。所述方法包含例如損害內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、脂質(zhì)體介導(dǎo)、經(jīng)粘膜、經(jīng)腸、局部、經(jīng)鼻、口服、經(jīng)肛門、經(jīng)眼或經(jīng)耳遞送方式。
[0092]“粘附”應(yīng)意指通過任何方式附接。在一個(gè)實(shí)施例中，粘附意指通過共價(jià)鍵附接。在另一實(shí)施例中，粘附意指以非共價(jià)方式附接。
[0093]“氨基酸”、“氨基酸殘基”以及“殘基”在本文中可互換使用以指代并入蛋白質(zhì)、多肽或肽中的氨基酸。氨基酸可為例如天然存在的氨基酸或可以類似于天然存在的氨基酸的方式起作用的天然氨基酸的類似物。
[0094]如本文中所用的“C端”和“N端”氨基酸是指分別在給定蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域或氨基酸序列模體的羧基或氨基末端處或緊鄰其的氨基酸，以使得在所述C端氨基酸或N端氨基酸更遠(yuǎn)處無蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域或氨基酸序列模體的結(jié)構(gòu)、功能或表征所必需的氨
基酸殘基。
[0095]“抗體”應(yīng)包括(但不限于)(a)包含兩條重鏈和兩條輕鏈且識(shí)別抗原的免疫球蛋白分子；(b)多克隆或單克隆免疫球蛋白分子；以及(c)其單價(jià)或二價(jià)片段。免疫球蛋白分子可源自于普通已知類別中的任一者，所述類別包括(但不限于)IgA、分泌型IgA、IgG、IgE以及IgM。IgG亞類為本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知，且包括(但不限于)人類IgGl、IgG2、IgG3以及IgG4?？贵w可為天然存在和非天然存在的抗體兩者。此外，抗體包括嵌合抗體、完全合成抗體、單鏈抗體以及其片段?？贵w可為人類或非人類抗體?？赏ㄟ^重組方法使非人類抗體人類化，以降低其在人類中的免疫原性。抗體片段包括(但不限于)Fab和Fe片段。在一個(gè)實(shí)施例中，“抗體的Fe部分”是通過免疫球蛋白的木瓜蛋白酶消化所獲得的可結(jié)晶片段且稱為免疫球蛋白的“效應(yīng)區(qū)”，所述片段由兩條利用二硫鍵連接的重鏈的C端半部分組成。在另一實(shí)施例中，“抗體的Fe部分”意指重鏈的一個(gè)C端半部分的全部或?qū)嵸|(zhì)上全部。
[0096]關(guān)于抗體，“人類化”意指其中CDR區(qū)外的一些、大部分或所有氨基酸經(jīng)源自于人類免疫球蛋白分子的相應(yīng)氨基酸置換的抗體。氨基酸的小添加、缺失、插入、取代或修飾是可容許的，只要其不消除抗體結(jié)合給定抗原的能力即可。適合的人類免疫球蛋白分子包括(但不限于)IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgA以及IgM分子。各種公開案描述如何制造人類化抗體，例如美國(guó)專利第4,816, 567號(hào)、第5，225，539號(hào)、第5，585, 089號(hào)以及第5,693, 761號(hào)以及PCT國(guó)際公開案第W090/07861號(hào)。[0097]如本文中所用的術(shù)語“組合物”，如在醫(yī)藥組合物中，打算涵蓋包含活性成分和組成載劑的惰性成分的產(chǎn)物，以及直接或間接由所述成分中的兩者或兩者以上的組合、復(fù)合或聚集產(chǎn)生、或由所述成分中的一或多者的解離產(chǎn)生、或由所述成分中的一或多者的其它反應(yīng)類型或相互作用產(chǎn)生的任何產(chǎn)物。
[0098]如本文中所用的“有效量”是指能夠治療患有腫瘤、疾病或病癥的個(gè)體的量。因此，有效量將隨所治療個(gè)體以及待治療的病狀而變。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可執(zhí)行常規(guī)滴定實(shí)驗(yàn)以測(cè)定所述充足量。化合物的有效量將視個(gè)體和所用特定給藥途徑而變化?；谒龌衔铮隽靠蛇B續(xù)遞送，如通過連續(xù)泵送或以周期性間隔(例如在單獨(dú)一或多次情況下)進(jìn)行。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員無需過度實(shí)驗(yàn)即可測(cè)定多個(gè)量的特定化合物的所需時(shí)間間隔。在一個(gè)實(shí)施例中，有效量是在約1μ g/kg-10mg/kg之間。在另一實(shí)施例中，有效量是在約10 μ g/kg-lmg/kg之間。在另一實(shí)施例中，有效量是100 μ g/kg。
[0099]如與Notch受體蛋白結(jié)合使用的“細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域”意指Notch的全部或一部分，其
(i)存在于細(xì)胞外(即，作為跨膜部分或細(xì)胞內(nèi)部分存在)和(ii)與完整Notch受體蛋白所結(jié)合的細(xì)胞外配體結(jié)合。Notch的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域可任選地包括信號(hào)肽(“sp”)?！凹?xì)胞外結(jié)構(gòu)域”、“E⑶”以及“胞外結(jié)構(gòu)域”是同義的。
[0100]“抑制”病癥或不希望的生物過程的發(fā)作應(yīng)意指減小病癥或過程發(fā)作的可能性或徹底預(yù)防病癥或過程發(fā)作。在優(yōu)選實(shí)施例中，抑制病癥或過程的發(fā)作意指徹底預(yù)防其發(fā)作。
[0101]“NotcWNotch蛋白”以及“Notch受體蛋白”是同義的。另外，術(shù)語“基于Notch的融合蛋白”和“Notch引誘物”是同義的。以下Notch氨基酸序列是已知的并特此以引用的方式并入:Notchl (Genbank 登錄號(hào) S18188 (大鼠))；Notch2 (Genbank 登錄號(hào) NP_077334 (大鼠))；Notch3 (Genbank 登錄號(hào) Q61982 (小鼠))；以及 Notch4 (Genbank 登錄號(hào) T09059 (小鼠))。以下Notch核酸序列為已知的并特此以引用的方式并入:Notchl (Genbank登錄號(hào)XM_342392(大鼠)和 NM_017617 (人類));Notch2 (Genbank 登錄號(hào) NM_024358 (大鼠)、M99437 (人類和 AF308601 (人類))；Notch3 (Genbank 登錄號(hào) NM_008716(小鼠)和XM_009303(人類))；以及 Notch4 (Genbank 登錄號(hào) ΝΜ_010929 (小鼠)和 NM_004557 (人類))。
[0102]術(shù)語“核酸”、“多核苷酸”以及“核酸序列”在本文中可互換使用，且每一者是指脫氧核糖核苷酸和/或核糖核苷酸的聚合物。脫氧核糖核苷酸和核糖核苷酸可為天然存在的或其合成類似物?！昂怂帷睉?yīng)意指任何核酸，包括(但不限于)DNA、RNA以及其雜合體。形成核酸分子的核酸堿基可為堿基A、C、G、T以及U以及其衍生物。這些堿基的衍生物為此項(xiàng)技術(shù)中所熟知，且例示于PCR系統(tǒng)、試劑以及消耗品(PCR Systems, Reagents and Consumables)(珀金埃爾默目錄1996-1997，美國(guó)新澤西州布蘭斯堡的羅氏分子系統(tǒng)公司(Perkin ElmerCataloguel996-1997, Roche Molecular Systems, Inc., Branchburg, New Jersey,USA))中。核酸包括(但不限于)反義分子和如核糖酶和DNA酶的催化性核酸分子。核酸還包括編碼肽類似物、片段或衍生物的核酸，所述肽類似物、片段或衍生物在一或多個(gè)氨基酸殘基的一致性方面不同于天然存在形式(缺失類似物，其含有少于所有指定殘基；取代類似物，其中一或多個(gè)殘基由 一或多個(gè)殘基置換；以及添加類似物，其中一或多個(gè)殘基添加到所述肽的末端或中間部分)，且共享天然存在形式的一些或所有性質(zhì)。
[0103]術(shù)語“多肽”、“肽”以及“蛋白”在本文中可互換使用，且每一者意指氨基酸殘基的聚合物。氨基酸殘基可為天然存在的或其化學(xué)類似物。多肽、肽以及蛋白質(zhì)還可包括如糖基化、脂質(zhì)附接、硫酸鹽化、羥基化以及ADP-核糖基化的修飾。
[0104]如本文中所用的“醫(yī)藥學(xué)上可接受的載劑”意指所述載劑與調(diào)配物的其它成分相容，且對(duì)其接受者無害，并涵蓋標(biāo)準(zhǔn)醫(yī)藥學(xué)上接受的載劑中的任一者。所述載劑包括例如0.01-0.1M且優(yōu)選包括0.05M磷酸鹽緩沖液或0.8%鹽水。另外，所述醫(yī)藥學(xué)上可接受的載劑可為水性或非水性溶液、懸浮液以及乳液。非水性溶劑的實(shí)例是丙二醇、聚乙二醇、如橄欖油的植物油以及如油酸乙酯的可注射有機(jī)酯。水性載劑包括水、醇性/水性溶液、乳液以及懸浮液，包括鹽水和緩沖介質(zhì)。腸胃外媒劑包括氯化鈉溶液、林格氏右旋糖(Ringer’sdextrose)、右旋糖和氯化鈉、乳酸林格氏和不揮發(fā)性油。靜脈內(nèi)媒劑包括流體和營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑，電解質(zhì)補(bǔ)充劑(如基于林格氏右旋糖的電解質(zhì)補(bǔ)充劑)等。還可存在防腐劑和其它添加劑，如抗菌劑、抗氧化劑、螯合劑、惰性氣體等。
[0105]“個(gè)體”應(yīng)意指任何生物體，包括(但不限于)哺乳動(dòng)物，如小鼠、大鼠、犬、豚鼠、雪貂、兔以及靈長(zhǎng)類動(dòng)物。在一個(gè)實(shí)施例中，個(gè)體是人類。
[0106]“治療”意指減緩、終止或逆轉(zhuǎn)疾病或病癥的進(jìn)展。如本文中所用的“治療”還意指改善與疾病或病癥相關(guān)的癥狀。疾病包括(但不限于)腫瘤血管生成、動(dòng)脈粥樣硬化、創(chuàng)傷愈合、早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變、子癲前癥、糖尿病性視網(wǎng)膜病變、缺血、中風(fēng)、心血管疾病、牛皮癬、淋巴水腫、腫瘤生成和腫瘤淋巴管生成、年齡相關(guān)性黃斑變性(AMD)、濕性AMD、胰臟癌和乳癌。
[0107]血管生成是在創(chuàng)傷愈合過程、女性月經(jīng)周期和子宮內(nèi)膜重塑期間以及在胚胎發(fā)育和器官生長(zhǎng)期間遇到。在病理學(xué)環(huán)境中，血管生成在如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、牛皮癬、黃斑變性、糖尿病性視網(wǎng)膜病變以及腫瘤生長(zhǎng)的不同疾病中起重要作用。
[0108]已有重要的體內(nèi)證據(jù)，包括臨床觀察，異常血管生成與包括類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、炎癥、癌癥、牛皮癬、退化性眼睛病狀等的多種疾病病狀有關(guān)。[0109] 使用Notch融合蛋白的其它疾病是代謝病癥，如(但不限于)糖尿病、肥胖、糖尿病前期、動(dòng)脈粥樣硬化、缺血、中風(fēng)、心血管疾病、調(diào)節(jié)胰島素的表達(dá)以及調(diào)節(jié)胰島素的功倉(cāng)泛。
[0110]Notch融合蛋白的使用也適用于代謝綜合癥，所述代謝綜合癥是指增加人患心血管疾病和糖尿病的風(fēng)險(xiǎn)的醫(yī)學(xué)病癥的組合。關(guān)于所述綜合癥的其它已知名稱是綜合癥X、胰島素抗性綜合癥、雷文氏綜合癥(Reaven’s syndrome)。所述綜合癥的若干特征包括:空腹高血糖、高血壓、中央型肥胖(也稱為內(nèi)臟性肥胖)、降低的高密度脂蛋白(LDL)、升高的甘油三酯、升高的尿酸水平。上文所列的空腹高血糖包括2型糖尿病或空腹葡萄糖受損以及葡萄糖耐受或胰島素抗性受損。除代謝綜合癥之外，Notch引誘物可具有糖尿病前期的適應(yīng)癥。
[0111]單位、前綴和符號(hào)可以其SI可接受形式表示。除非另有指示，否則核酸序列沿5’到3’取向從左到右寫，且氨基酸序列沿氨基端到羧基端取向從左到右寫。氨基酸在本文中可由其通常已知的三個(gè)字母符號(hào)或由IUPAC-1UB生物化學(xué)命名委員會(huì)(IUPAC-1UBBiochemical Nomenclature Commission)推薦的一個(gè)字母符號(hào)來提及。同樣地，核苷酸可由其通常接受的單個(gè)字母代碼來提及。
[0112]本文中使用以下縮寫:E⑶:細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域；IC:細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域:NE⑶/Fe:基于Notch 的融合蛋白；N1 =Notchl ；N2:Notch2 ；N3:Notch3 ；N4:Notch4 ；D11: δ 樣；DLL1: δ樣 I ;DLL4: δ 樣 4 JAG JAGGED ;JG JAGGED JAGGED-1 JAGGED I ；JG1 JAGGED I ；EC:內(nèi)皮細(xì)胞；HUVEC:人類臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞；m.0.1.:感染倍數(shù)；VEGF:血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子；VEGFR:血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體；sp:信號(hào)肽；H)GF:血小板衍生生長(zhǎng)因子；H)GFR:血小板衍生生長(zhǎng)因子受體；P1GF:胎盤生長(zhǎng)因子。
[0113]本發(fā)明的實(shí)施例
[0114]在一個(gè)實(shí)施例中，融合蛋白是包含連續(xù)氨基酸的融合蛋白，所述氨基酸的序列開始于融合蛋白的N端并與以下中的氨基酸序列相同:
[0115](a)人類Notchl受體蛋白的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域，之后為
[0116](b)抗體的Fe部分，
[0117]其中人類Notchl受體蛋白的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域
[0118]⑴以存在于EGF樣重復(fù)序列10的N端的氨基酸開始，且
[0119](ii)至少延伸到EGF樣重復(fù)序列23的C端氨基酸。
[0120]本發(fā)明的融合蛋白的另一實(shí)施例中包含與延伸到EGF樣重復(fù)序列24的C端氨基酸的人類Notchl受體蛋白的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列相同的氨基酸序列。
[0121]在另一實(shí)施例中，連續(xù)氨基酸的序列包含SEQ ID N0:3中所述以位置24的胱氨酸開始并以位置833的賴氨酸結(jié)束的序列。
[0122]本發(fā)明的融合蛋白的另一實(shí)施例中包含與延伸到EGF樣重復(fù)序列36的C端氨基酸的人類Notchl受體蛋白的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列相同的氨基酸序列。
[0123]在另一實(shí)施例中，連續(xù)氨基酸的序列包含SEQ ID NO:5中所述以位置24的胱氨酸開始并以位置1318的賴氨酸結(jié)束的序列。
[0124]在任何本發(fā)明的融合蛋白的另一實(shí)施例中，抗體的Fe部分是人類抗體的Fe部分。
[0125]在本發(fā)明的融合蛋白的另一實(shí)施例中，(a)人類Notchl受體蛋白的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域位于信號(hào)肽之后。在另一實(shí)施例中，信號(hào)肽是人類Notchl蛋白的信號(hào)肽或IgG重鏈的信號(hào)肽。
[0126]在任何本發(fā)明的融合蛋白的另一實(shí)施例中，人類Notchl受體蛋白的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列延伸到EGF樣重復(fù)序列24的C端氨基酸。在另一實(shí)施例中，融合蛋白包含SEQ ID NO:3中所述的連續(xù)氨基酸序列。
[0127]在任何本發(fā)明的融合蛋白的另一實(shí)施例中，人類Notchl受體蛋白的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列延伸到EGF樣重復(fù)序列36的C端氨基酸。在另一實(shí)施例中，融合蛋白包含SEQ ID NO:5中所述的連續(xù)氨基酸序列。
[0128]還提供了一種組合物，其包含任何本發(fā)明的融合蛋白和載劑。
[0129]在一個(gè)實(shí)施例中，融合蛋白以有效抑制JAGGED-1的活性的量存在于醫(yī)藥學(xué)上可接受的載劑中。
[0130]還提供了一種治療罹患年齡相關(guān)性黃斑變性(AMD)的個(gè)體的方法，所述方法包含以有效治療個(gè)體的AMD的量向個(gè)體投與任何本發(fā)明的融合蛋白。
[0131 ] 在一個(gè)實(shí)施例中，AMD是濕性AMD。在另一實(shí)施例中，AMD是干性AMD。
[0132]還提供了一種治療罹患糖尿病性視網(wǎng)膜病變的個(gè)體的方法，所述方法包含以有效治療個(gè)體的糖尿病性視網(wǎng)膜病變的量向個(gè)體投與任何本發(fā)明的融合蛋白。
[0133]在任何本發(fā)明的方法的一個(gè)實(shí)施例中，所述方法進(jìn)一步包含投與血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)的抑制劑。在另一實(shí)施例中，VEGF的抑制劑是VEGF-A、PGIF、VEGF-B, VEGF-C或VEGF-D的抑制劑。
[0134]在任何本發(fā)明的方法的一個(gè)實(shí)施例中，所述方法進(jìn)一步包含投與VEGF受體抑制劑。在另一實(shí)施例中，VEGF受體抑制劑是VEGFR-1或VEGFR-2抑制劑。
[0135]還提供了一種治療罹患癌癥的個(gè)體的方法，所述方法包含以有效治療個(gè)體的癌癥的量向個(gè)體投與任何本發(fā)明的融合蛋白。
[0136]在一個(gè)實(shí)施例中，癌癥是胰臟癌。在另一實(shí)施例中，癌癥是乳癌。
[0137]還提供了一種治療罹患年齡相關(guān)性黃斑變性(AMD)的個(gè)體的方法，所述方法包含以有效治療個(gè)體的AMD的量向個(gè)體投與融合蛋白，其中所述融合蛋白包含連續(xù)氨基酸，所述氨基酸的序列開始于融合蛋白的N端并與以下中的氨基酸序列相同:
[0138](a)人類Notchl受體蛋白的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域，之后為
[0139](b)抗體的Fe部分，
[0140]其中人類Notchl受體蛋白的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域
[0141](i)包含存在于EGF樣重復(fù)序列9的N端的氨基酸，且
[0142](ii)至少延伸到EGF樣重復(fù)序列13的C端氨基酸，
[0143]其限制條件為如果N端氨基酸是EGF樣重復(fù)序列I的N端氨基酸，那么C端氨基酸并非EGF樣重復(fù)序列36的C端氨基酸。
[0144]在一個(gè)實(shí)施例中，AMD是濕性AMD。在另一實(shí)施例中，AMD是干性AMD。
[0145]還提供了一種治療罹患糖尿病性視網(wǎng)膜病變的個(gè)體的方法，所述方法包含以有效治療個(gè)體的糖尿病性視網(wǎng)膜病變的量向個(gè)體投與融合蛋白，其中所述融合蛋白包含連續(xù)氨基酸，所述氨基酸的序列開始于融合蛋白的N端并與以下中的氨基酸序列相同:
[0146](a)人類Notchl受體蛋白的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域，之后為[0147](b)抗體的Fe部分，
[0148]其中人類Notchl受體蛋白的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域
[0149](i)包含存在于EGF樣重復(fù)序列9的N端的氨基酸，且
[0150](ii)至少延伸到EGF樣重復(fù)序列13的C端氨基酸，
[0151]其限制條件為如果N端氨基酸是EGF樣重復(fù)序列I的N端氨基酸，那么C端氨基酸并非EGF樣重復(fù)序列36的C端氨基酸。
[0152]在任何本發(fā)明的方法的一個(gè)實(shí)施例中，所述方法進(jìn)一步包含投與血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)的抑制劑。在另一實(shí)施例中，VEGF的抑制劑是VEGF-A、PGIF、VEGF-B, VEGF-C或VEGF-D的抑制劑。
[0153]在任何本發(fā)明的方法的一個(gè)實(shí)施例中，所述方法進(jìn)一步包含投與VEGF受體抑制劑。在另一實(shí)施例中，VEGF受體抑制劑是VEGFR-1或VEGFR-2抑制劑。
[0154]還提供了一種治療罹患癌癥的個(gè)體的方法，所述方法包含以有效治療個(gè)體的癌癥的量向個(gè)體投與融合蛋白，其中所述融合蛋白包含連續(xù)氨基酸，所述氨基酸的序列開始于融合蛋白的N端并與以下 中存在的氨基酸序列相同:
[0155](a)人類Notchl受體蛋白的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域，之后為
[0156](b)抗體的Fe部分，
[0157]其中人類Notchl受體蛋白的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域
[0158](i)包含存在于EGF樣重復(fù)序列9的N端的氨基酸，且
[0159](ii)至少延伸到EGF樣重復(fù)序列13的C端氨基酸，
[0160]其限制條件為如果N端氨基酸是EGF樣重復(fù)序列I的N端氨基酸，那么C端氨基酸并非EGF樣重復(fù)序列36的C端氨基酸。
[0161]在一個(gè)實(shí)施例中，癌癥是胰臟癌。在另一實(shí)施例中，癌癥是乳癌。
[0162]在任何本發(fā)明的方法的一個(gè)實(shí)施例中，人類Notchl受體蛋白的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列以存在于EGF樣重復(fù)序列9的N端的氨基酸開始并延伸到EGF樣重復(fù)序列23的C端氨基酸。
[0163]在任何本發(fā)明的方法的另一實(shí)施例中，人類Notchl受體蛋白的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列以存在于EGF樣重復(fù)序列9的N端的氨基酸開始并延伸到EGF樣重復(fù)序列36的C端氨基酸。
[0164]在任何本發(fā)明的方法的另一實(shí)施例中，人類Notchl受體蛋白的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列以存在于EGF樣重復(fù)序列I的N端的氨基酸開始并延伸到EGF樣重復(fù)序列13的C端氨基酸。
[0165]在任何本發(fā)明的方法的另一實(shí)施例中，人類Notchl受體蛋白的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列以存在于EGF樣重復(fù)序列I的N端的氨基酸開始并延伸到EGF樣重復(fù)序列24的C端氨基酸。
[0166]在任何本發(fā)明的融合蛋白的一個(gè)實(shí)施例中，人類Notchl受體蛋白的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列由EGF樣重復(fù)序列10-24組成。在另一實(shí)施例中，所述融合蛋白包含連續(xù)氨基酸，其序列闡述于SEQ ID N0:3中。
[0167]在任何本發(fā)明的融合蛋白的一個(gè)實(shí)施例中，人類Notchl受體蛋白的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列由EGF樣重復(fù)序列10-36組成。在另一實(shí)施例中，所述融合蛋白包含連續(xù)氨基酸，其序列闡述于SEQ ID N0:5中。
[0168]在任何本發(fā)明的融合蛋白的一個(gè)實(shí)施例中，人類Notchl受體蛋白的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列由EGF樣重復(fù)序列14-24組成。在另一實(shí)施例中，所述融合蛋白包含連續(xù)氨基酸，其序列闡述于SEQ ID N0:7中。
[0169]在任何本發(fā)明的融合蛋白的一個(gè)實(shí)施例中，人類Notchl受體蛋白的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列由EGF樣重復(fù)序列14-36組成。在另一實(shí)施例中，所述融合蛋白包含連續(xù)氨基酸，其序列闡述于SEQ ID N0:9中。
[0170]在任何本發(fā)明的融合蛋白的一個(gè)實(shí)施例中，抗體的Fe部分是人類抗體的Fe部分。在任何本發(fā)明的融合蛋白的另一實(shí)施例中，信號(hào)肽是人類Notchl蛋白的信號(hào)肽或IgG重鏈的信號(hào)肽。
[0171]還提供了一種醫(yī)藥組合物，其包含本文中描述的融合蛋白中的任一者和醫(yī)藥學(xué)上可接受的載劑。
[0172]本發(fā)明提供了一種治療個(gè)體的年齡相關(guān)性黃斑變性(AMD)的方法，所述方法包含以有效治療個(gè)體的量向個(gè)體投與任何一種本發(fā)明的融合蛋白的融合蛋白，由此治療個(gè)體的AMD。
[0173]在一個(gè)實(shí)施例中，融合蛋白是用于治療個(gè)體的年齡相關(guān)性黃斑變性的本發(fā)明的融合蛋白中的任一者。
[0174]本發(fā)明還提供了一種治療個(gè)體的年齡相關(guān)性黃斑變性(AMD)的方法，所述方法包含以有效減少血管生成的量向個(gè)體投與JAGGED-1抑制劑，由此治療個(gè)體的AMD。在一個(gè)實(shí)施例中，AMD是濕性AMD。在另一實(shí)施例中，JAGGED抑制劑是Notchl融合蛋白。
[0175]其它Notchl融合蛋白描述于例如2008年8月22日申請(qǐng)并代表紐約市的哥倫比亞大學(xué)理事會(huì)(The Trustees of Columbia University in the City of New York)的 PCT國(guó)際申請(qǐng)案第PCT/US2008/010045號(hào)中，所述申請(qǐng)案的全部?jī)?nèi)容特此以引用的方式并入本申請(qǐng)案中。在另一實(shí)施例中，Notchl融合蛋白是任何本文中描述的融合蛋白。
[0176]本發(fā)明還提供了 JAGGED-1抑制劑，其用于治療個(gè)體的年齡相關(guān)性黃斑變性。在一個(gè)實(shí)施例中，AMD是濕性AMD。在另一實(shí)施例中，JAGGED抑制劑是Notchl融合蛋白。在另一實(shí)施例中，Notchl融合蛋白是任何本文中描述的融合蛋白。
[0177]在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述方法進(jìn)一步包含投與血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)的抑制劑。在另一實(shí)施例中，VEGF的抑制劑是VEGF-A、PGIF、VEGF-B, VEGF-C或VEGF-D的抑制劑。
[0178]在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述方法進(jìn)一步包含投與VEGF受體抑制劑。在另一實(shí)施例中，VEGF受體抑制劑是VEGFR-1或VEGFR-2抑制劑。
[0179]本發(fā)明提供了一種治療個(gè)體的胰臟癌的方法，所述方法包含以有效治療個(gè)體的量向個(gè)體投與本文中描述的融合蛋白中的任一者，由此治療患有胰臟癌的個(gè)體。
[0180]在一個(gè)實(shí)施例中，融合蛋白是用于治療個(gè)體的胰臟癌的本發(fā)明的融合蛋白中的任
一者O
[0181]本發(fā)明提供了一種延遲或抑制腫瘤生長(zhǎng)的方法，其中所述腫瘤包含胰臟癌細(xì)胞，所述方法包含使腫瘤與有效延遲或抑制所述腫瘤的生長(zhǎng)的量的本文中描述的融合蛋白中的任一者接觸。[0182]在一個(gè)實(shí)施例中，融合蛋白是用于抑制腫瘤生長(zhǎng)的本發(fā)明的融合蛋白中的任一者，其中所述腫瘤包含胰臟癌。
[0183]本發(fā) 明提供了一種治療個(gè)體的乳癌的方法，所述方法包含以有效治療個(gè)體的量向個(gè)體投與本發(fā)明的融合蛋白中的任一者，由此治療個(gè)體的乳癌。
[0184]在一個(gè)實(shí)施例中，融合蛋白是用于治療個(gè)體的乳癌的本發(fā)明的融合蛋白中的任一者。
[0185]本發(fā)明提供了一種延遲或抑制腫瘤生長(zhǎng)的方法，其中所述腫瘤包含乳癌細(xì)胞，所述方法包含使腫瘤與呈有效延遲或抑制所述腫瘤的生長(zhǎng)的量的本發(fā)明的融合蛋白中的任一者的量接觸。
[0186]在一個(gè)實(shí)施例中，融合蛋白是用于抑制腫瘤生長(zhǎng)的本發(fā)明的融合蛋白中的任一者，其中所述腫瘤包含乳癌細(xì)胞。
[0187]在以下實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)部分中說明本發(fā)明。此部分經(jīng)闡述以幫助理解本發(fā)明，但不打算且不應(yīng)理解為以任何方式限制如其后權(quán)利要求書中所闡述的本發(fā)明。
[0188]實(shí)駘細(xì)節(jié)
[0189]第一系列的實(shí)驗(yàn)
[0190]引言
[0191]Notch信號(hào)傳導(dǎo)需要允許Notch受體和配體互相作用的細(xì)胞-細(xì)胞接觸。Notch細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的主要部分包含最多36個(gè)含有Ca2+結(jié)合共有序列的EGF樣重復(fù)序列。Notch配體在其細(xì)胞外區(qū)域中也含有EGF樣重復(fù)序列，但其可通過富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域的存在或不存在來區(qū)分。JAGGED配體家族含有16個(gè)EGF樣重復(fù)序列和富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域，δ樣配體家族含有8個(gè)或更少EGF樣重復(fù)序列。若干條證據(jù)顯示，DSL區(qū)域賦予Notch結(jié)合特異性且C端EGF樣重復(fù)序列有助于促進(jìn)結(jié)合(清水(Shimizu)等人；格利滕貝格(Glittenberg)等人；亨德森(Henderson)等人)。此處，顯示EGF樣重復(fù)序列11-13為Notch/Dll I和Notch/JAGGED-1相互作用所必需的(科德爾(Cordle)等人；漢布爾頓(Hambleton)等人)。
[0192]基于與作為Notch抑制劑的人類IgG Fe (Notchl引誘物)融合的大鼠Notchl細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的36-EGF樣重復(fù)序列產(chǎn)生新穎可溶性構(gòu)筑體(舟橋(Funahashi)等人)。已顯示，Notchl引誘物抑制由Notch配體JAGGED-U Dlll以及D114刺激的Notch活性。此發(fā)現(xiàn)暗示，Notch的EGF樣重復(fù)序列足以與Notch配體有效地相互作用且因此預(yù)防Notch受體被其配體活化。已研究Notch-配體特異性是否由細(xì)胞外EGF樣重復(fù)序列決定。另外，已充分確定Notch是抗血管生成療法的標(biāo)靶中的一者，因此已基于人類N0TCH1產(chǎn)生新的Notchl引誘物構(gòu)筑體用于治療目的。大鼠Notchl和人類N0TCH1蛋白質(zhì)序列是96%同源(92.6%一致)，且已顯示大鼠和人類Notchl引誘物在Notch信號(hào)傳導(dǎo)和功能分析中的活性無法區(qū)分。此處，使用人類Notchl引誘物，其將簡(jiǎn)單地稱為Notchl引誘物，在下一章節(jié)中用于體外研究以及體內(nèi)和腫瘤實(shí)驗(yàn)。
[0193]除對(duì)Notch路徑的廣泛遺傳和細(xì)胞研究以外，Notch-配體相互作用的分子表征仍難以捉摸。為增進(jìn)對(duì)Notch-配體識(shí)別的分子基礎(chǔ)的了解，還產(chǎn)生包括EGF樣重復(fù)序列1-13和1-24的Notchl引誘物截短片段。由于EGF樣重復(fù)序列11-13參與配體結(jié)合，故假設(shè)11-13可為仍保留配體結(jié)合活性的Notch的最短形式。Notchl引誘物1_36的分子量以其糖基化、分泌形式為約ISOkD或超過250kD，故探究其是否可經(jīng)修飾或縮短以使得其以較高含量產(chǎn)生并分泌用于治療目的。所用這些新的引誘物變體評(píng)估其抑制作用以及其配體特異性。本文中所述結(jié)果證明Notchl引誘物1-13充當(dāng)D114特異性抑制劑，且Notchl引誘物1-24充當(dāng)泛Notch抑制劑。
[0194]還成功地構(gòu)筑JAGGED-1特異性抑制劑。構(gòu)筑并測(cè)試第二代Notchl引誘物(包括10-24、10-36、14-24 以及 14-36)。證明僅 Notchl 引誘物 10-24 具有 JAGGED-1 特異性，并在基于內(nèi)皮細(xì)胞的分析、視網(wǎng)膜血管生成以及基因譜分析中呈現(xiàn)不同活性?；谄洳煌钚?，使用引誘物1-13、10-24以及1-24作為可能的抗腫瘤和抗血管生成劑來進(jìn)行腫瘤研究。[0195] 材料和方法
[0196]Notchl引誘物奪體的產(chǎn)牛
[0197]全長(zhǎng)Notchl引誘物1-36和Notch引誘物1-24的示意圖顯示于圖1(a)中。產(chǎn)生四個(gè)源自于Notchl引誘物1-36和1-24構(gòu)筑體的PCR突變誘發(fā)的截短型Notchl引誘物變體。這些是NotchlO-36引誘物、Notchl4-36引誘物、NotchlO-24引誘物以及Notchl4_24引誘物。這些引誘物的示意性代表圖闡述于圖1b中。人類Notchl的氨基酸序列闡述于SEQID NO:1中。人類Notchl弓丨誘物10-24的核酸序列闡述于SEQ ID N0:2中，且氨基酸序列闡述于SEQ ID N0:3中。人類Notchl引誘物10-36的核酸序列闡述于SEQ ID N0:4中，且氨基酸序列闡述于SEQ ID N0:5中。人類Notchl引誘物14-24的核酸序列闡述于SEQ IDN0:6中，且氨基酸序列闡述于SEQ ID N0:7中。人類Notchl引誘物14-26的核酸序列闡述于SEQ ID N0:8中，且氨基酸序列闡述于SEQ ID N0:9中。
[0198]截短型Notchl引誘物奪體在293T細(xì)朐中的表汰和分泌.[0199]使用基于pCCL的Notchl引誘物質(zhì)粒通過磷酸鈣轉(zhuǎn)染來轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后2天收集總細(xì)胞溶解產(chǎn)物，且使用兔抗人類Fe抗體進(jìn)行蛋白印跡法。Notchl引誘物1-13、
1-24以及1-36引誘物的分子量分別是83kD、127kD以及178kD。參見圖2a。Notchl引誘物10-36、14-36、10-24以及14-24的分子量分別是140Kd、128kD、91kD以及73kD。參見圖
2b ο
[0200]Notch報(bào)導(dǎo)某閔分析
[0201 ] 為了評(píng)估Notch弓丨誘物對(duì)Notch信號(hào)傳導(dǎo)的作用，利用含有多個(gè)與熒光素酶基因連接的CSL結(jié)合位點(diǎn)(IICSL-Luc)的Notch報(bào)導(dǎo)基因構(gòu)筑體。在與表達(dá)Notch配體的HeLa細(xì)胞共培養(yǎng)的表達(dá)Notchl和llCSL-Luc的HeLa細(xì)胞中測(cè)量Notch信號(hào)傳導(dǎo)的活化。所有Notch引誘物抑制DLL4誘導(dǎo)的Notch信號(hào)傳導(dǎo)。然而，Notchl-13并不抑制JAGGED-1。平均熒光素酶誘導(dǎo)倍數(shù)土 S.D.*P值〈0.002。參見圖3。顯示EGF樣重復(fù)序列1_9對(duì)于抑制DLL4誘導(dǎo)的Notch信號(hào)傳導(dǎo)必不可少(參見圖4a)。僅Notchl引誘物10_24能夠阻斷JAGGED-1，暗示EGF樣重復(fù)序列10-24可具有JAGGED-1特異性。參見圖4b。
[0202]Notchl引誘物與可溶件配體的共轉(zhuǎn)染
[0203]在293T細(xì)胞中將Notchl引誘物與可溶性配體(參見圖5a)或全長(zhǎng)配體(參見圖5b)共轉(zhuǎn)染。用 pcDNA3.1 引誘物和 pCRII1-DLL4_FLAG 或 pCRII 1-JAGGED-1-FLAG 或空載體共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞。還添加DSG(—種交聯(lián)劑)以使引誘物與配體的相互作用穩(wěn)定為蛋白質(zhì)復(fù)合物。接著，收集細(xì)胞溶解產(chǎn)物并通過蛋白A/G瓊脂糖沉淀。接著通過抗FLAG抗體對(duì)沉淀復(fù)合物進(jìn)行免疫印跡分析。Notchl引誘物1-13與DLL4相互作用，且Notchl引誘物10-24與JAGGED-1相互作用。
[0204]共免疫沉淀分析
[0205]使用Notchl引誘物和全長(zhǎng)Notchl受體進(jìn)行共免疫沉淀。通過蛋白A/G瓊脂糖沉淀細(xì)胞溶解產(chǎn)物，并使用抗Fe或抗Notchl抗體對(duì)其進(jìn)行印跡分析。Notchl引誘物并不與Notchl受體相互作用。參見圖6。
[0206]視網(wǎng)臘血管牛成
[0207]將50 μ I 表達(dá)不同引誘物(1-13、10-24、1-24 以及 1-36)的 5.0X 109ffu/ml 腺病毒或50μ12π^/πι1 DAPT皮下注射到Ρ2新生兒瞳孔中。在Ρ5時(shí)收集視網(wǎng)膜且固定并使用同工凝集素Β4針對(duì)視網(wǎng)膜脈管系統(tǒng)進(jìn)行免疫染色。通過血清的人類Fe蛋白印跡證實(shí)引誘物的表達(dá)和分泌。結(jié)果顯示于圖7a-7d中。Notchl引誘物1_13和10-24對(duì)視網(wǎng)膜血管生成展示相反作用。
[0208]某閔表汰剖析
[0209]i.原代細(xì)朐和癌癥細(xì)朐株
[0210]在37°C下將細(xì)胞培養(yǎng)物維持在5% CO2和95%潮濕空氣中。使HUVEC生長(zhǎng)在EGM-2培養(yǎng)基(馬里蘭州沃克斯維爾的隆薩集團(tuán)(Lonza Group, Walkersville, MD))。Mm5MT、LLC以及B16-F10是來自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type Culture Collection,ATCC，弗吉尼亞州馬納薩斯(Manassas，VA))。將癌癥細(xì)胞株維持于具有10 %胎牛血清(FBS)和青霉素-鏈霉素(Pen-Str印)的IX高葡萄糖DMEM(加利福尼亞州卡爾斯巴德的英杰公司(Invitrogen, Carlsbad, CA))中。
[0211]i1.表汰 Notchl 引誘物的 HUVEC
[0212]從慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的HUVEC收集RNA以用于反轉(zhuǎn)錄和定量RT-PCR。
[0213]對(duì)Notch受體(Notchl_Notch4)的mRNA轉(zhuǎn)錄物進(jìn)行定量RT-PCR。結(jié)果顯示于圖8a-8d中。平均相對(duì)值土 S.D.*P值〈0.03。
[0214]對(duì)HEYl和HEY2的mRNA轉(zhuǎn)錄物進(jìn)行定量RT-PCR。所有Notchl弓丨誘物均下調(diào)HEYl，但僅1-13和1-24下調(diào)HEY2。結(jié)果顯示于圖9a和9b中。平均相對(duì)值土S.D.*P值〈0.03。
[0215]對(duì)HEYL和HESl的mRNA轉(zhuǎn)錄物進(jìn)行定量RT-PCT。還通過Notchl引誘物在HUVEC中的表達(dá)下調(diào)Notch信號(hào)傳導(dǎo)的下游標(biāo)祀(HEYL和HES1)。結(jié)果顯不于圖1Oa和IOb中。平均相對(duì)值土 S.D.*P值〈0.03。
[0216]對(duì)DLL4、JAGGED-1、VEGFR-1、VEGFR-2 以及 VEGFR-3 的 mRNA 轉(zhuǎn)錄物進(jìn)行定量RT-PCR。Notchl引誘物1-13和10-24對(duì)VEGFR-1轉(zhuǎn)錄物具有不同作用。結(jié)果顯示于圖1la-1le中。平均相對(duì)值土S.D.*P值〈0.03。
[0217]ii1.癌癥細(xì)胞株的基因表達(dá)剖析
[0218]利用四種不同細(xì)胞株:小鼠乳房腫瘤細(xì)胞(Mm5MT)、人類胰臟癌細(xì)胞(KPl)、小鼠路易斯肺癌細(xì)胞(mouse Lewis lung carcinoma cell, LLC)以及小鼠黑色素瘤細(xì)胞(B16-F10)。從培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞分離RNA并進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。進(jìn)行PCR以探究所有Notch受體和配體在這些細(xì)胞株中的表達(dá)。PCR結(jié)果顯示于圖14中。
[0219]細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡細(xì)胞分析
[0220]使用不同Notchl引誘物變體慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)腫瘤細(xì)胞并評(píng)估其細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡。使用FITC偶聯(lián)的膜聯(lián)蛋白V抗體進(jìn)行細(xì)胞凋亡分析。在圖15c和15d的右上象限中指示凋亡細(xì)胞的百分比。
[0221]通過蛋白印跡和免疫染色的Notchl檢測(cè)
[0222]將表達(dá)Notchl引誘物1-13、10-24以及1_24或作為對(duì)照的Fe的腺病毒靜脈內(nèi)注射到成年小鼠中。進(jìn)行蛋白印跡分析，參見圖16a。收集腫瘤，且通過免疫熒光評(píng)估腫瘤切片中的引誘物含量。參見圖16b。結(jié)果闡述于圖16a和16b中。
[0223]腫瘤牛長(zhǎng)實(shí)齡
[0224]首先慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)Mm5MT_FGF4和KPl-VEGF腫瘤細(xì)胞以表達(dá)熒光素酶，從而使用熒光素酶活性或發(fā)光信號(hào)監(jiān)測(cè)腫瘤生長(zhǎng)。以2種方式進(jìn)行實(shí)驗(yàn):第一，通過慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)將不同Notchl引誘物或Fe直接引入腫瘤細(xì)胞中；第二通過使用腺病毒。在腫瘤收集之前將Hypoxyprobe?(組織中的缺氧標(biāo)記)和FITC偶聯(lián)的凝集素注射到小鼠中，以便分析腫瘤缺氧和血管灌注。通過使用Xenogen IVIS成像系統(tǒng)評(píng)估發(fā)光信號(hào)的總輻射率來監(jiān)測(cè)腫瘤生長(zhǎng)。平均總通量土S.D.*P值〈0.05 (η = 4-5)。結(jié)果闡述于圖17a_17c和18a_18c中。
[0225]腫瘤脈管系統(tǒng)表征
[0226]針對(duì)內(nèi)皮粘蛋白(Endomucin)陽性區(qū)域(綠色)和D114(紅色)對(duì)腫瘤切片進(jìn)行免疫染色。腫瘤脈管系統(tǒng)的定量是基于腫瘤切片中的內(nèi)皮粘蛋白陽性區(qū)域。平均內(nèi)皮粘蛋白陽性區(qū)域土S.D.*P值〈0.003(n = 4-5)。比例尺:30微米。結(jié)果闡述于圖19a和19b和圖20a和20b中。
[0227]腫瘤收集前2分鐘將熒光黃(fluorescein)偶聯(lián)的凝集素(100 μ g)注射到小鼠中。針對(duì)內(nèi)皮粘蛋白(紅色)和所灌注凝集素(綠色)對(duì)腫瘤切片進(jìn)行免疫染色，且所灌注凝集素與腫瘤血管相關(guān)。血管相關(guān)凝集素的量反映功能腫瘤脈管系統(tǒng)。平均凝集素陽性區(qū)域土S.D.*P值〈0.006(n = 4-5)。比例尺:30微米。結(jié)果闡述于圖21a和21b中。
[0228]在Mm5MT和KPl腫瘤切片h.的NG2和內(nèi)皮粘蛋白免瘡熒光.[0229]針對(duì)內(nèi)皮粘蛋白(綠色)和NG2 (紅色)對(duì)腫瘤切片進(jìn)行共免疫染色。測(cè)量NG2陽性區(qū)域的百分比作為腫瘤中周細(xì)胞募集的參數(shù)。平均NG2陽性區(qū)域土S.D.*P值〈0.02 (η=4-5)。比例尺:10微米。結(jié)果闡述于圖22a和22b中。
[0230]腫瘤侵入和轉(zhuǎn)移
[0231]使用表達(dá)熒光素酶的皮下LLC和B16-F10腫瘤評(píng)估腫瘤侵入和轉(zhuǎn)移中的Notchl引誘物活性。在第12天對(duì)來自不同引誘物組(1-13、10-24以及1-24)的具有發(fā)光信號(hào)的腫瘤負(fù)載小鼠采集照片?；诳傒椛渎时O(jiān)測(cè)腫瘤生長(zhǎng)并對(duì)其進(jìn)行定量。平均總通量土S.D.(η=5)。在腫瘤收集前第12天測(cè)量腫瘤重量。平均腫瘤重量土S.D.*P值〈0.05(n = 5)。結(jié)果闡述于圖23a-23c和24a_24c中。
[0232]在第12天從腫瘤負(fù)載小鼠收集肺和肝，在30mg/mL D-熒光素中孵育并通過Xenogen IVIS成像系統(tǒng)分析。對(duì)于LLC模型，第12天來自每一組的小鼠開始發(fā)生肺轉(zhuǎn)移，且組間腫瘤負(fù)荷并非顯著不同。任一組中均未發(fā)現(xiàn)肝轉(zhuǎn)移。平均總通量土S.D.(η = 5)。結(jié)果顯示于圖25a和25b中。
[0233]在第12天從腫瘤負(fù)載小鼠收集肺和肝，在30mg/mL D-熒光素中孵育并通過Xenogen IVIS成像系統(tǒng)分析。器官的成像展示肺(圖26a和26b)和肝(圖26c)中來自Fe組的轉(zhuǎn)移病灶。引誘物治療組中未發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移。B16-F10腫瘤負(fù)載小鼠顯示引誘物治療組中肺和肝轉(zhuǎn)移的發(fā)生延遲。[0234]結(jié)果
[0235]TAGGED-1特異件Notchl引誘物的構(gòu)筑
[0236]如由若干體外功能分析所示，Notchl引誘物變體呈現(xiàn)不同抑制活性，視Notch配體而定。顯示Notchl引誘物1-13僅抑制DLL4誘導(dǎo)的Notch信號(hào)傳導(dǎo)，且其在功能分析中的抑制作用與其它DLL4中和劑(包括可溶性DLL4-FC和抗DLL4抗體)的抑制作用極其類似?；谠紭?gòu)筑體，DLL4誘導(dǎo)的和JAGGED-1誘導(dǎo)的Notch活化兩者均需要EGF樣重復(fù)序列1-24。且，EGF樣重復(fù)序列1-13僅阻斷DLL4，而不阻斷JAGGED-1。因此，假設(shè)EGF樣重復(fù)序列14-24和14-36可呈現(xiàn)JAGGED-1特異性。然而，若干條證據(jù)表明EGF樣重復(fù)序列
11-13對(duì)于NOTCH與JAGGED-1的相互作用是必需的。因此，產(chǎn)生Notchl引誘物變體10-24和10-36作為可能的JAGGED-1特異性藥劑。對(duì)Notchl引誘物1_24或1_36質(zhì)粒進(jìn)行PCR突變誘發(fā)，以缺失前9個(gè)或13個(gè)EGF樣重復(fù)序列。通過在293T細(xì)胞中的表達(dá)和分泌來證實(shí)新的構(gòu)筑體，如圖2中所示。其表達(dá)水平與先前引誘物變體的表達(dá)水平類似，因?yàn)榕c較小變體相比，較大變體以較低水平表達(dá)并分泌。
[0237]缺乏EGF樣重復(fù)序列1-9或1-13的Notchl引誘物奪體不能陽斷DLL4,佰Notchl引誘物10-24顯著抑制TAGGED-1誘導(dǎo)的Notch信號(hào)傳導(dǎo)
[0238] Notchl引誘物1-13作為DLL4特異性抑制劑起作用。實(shí)現(xiàn)新Notchl引誘物的構(gòu)筑后，利用共培養(yǎng)信號(hào)傳導(dǎo)分析測(cè)試Notch引誘物的抑制作用和配體特異性。所有第2代Notchl引誘物均不抑制DLL4誘導(dǎo)的Notch信號(hào)傳導(dǎo)(圖3a_c)。此表明受體與DLL4的相互作用需要EGF樣重復(fù)序列1-9。然而，Notchl引誘物10-24顯著阻斷JAGGED-1誘導(dǎo)的Notch信號(hào)傳導(dǎo)，而其它引誘物并不具有任何作用(圖4a-b)。Notchl引誘物10_36還呈現(xiàn)較小JAGGED-1抑制，但其抑制作用并不一致或顯著。此發(fā)現(xiàn)備受關(guān)注，因?yàn)橐扬@示EGF樣重復(fù)序列11-13與δ樣和JAGGED配體兩者相互作用，但本文中所述基于細(xì)胞的信號(hào)傳導(dǎo)分析證明EGF樣重復(fù)序列1-9的不存在似乎將轉(zhuǎn)變Notch受體對(duì)JAGGED-1的親和力。
[0239]Notchl引誘物與Notch配體特異件結(jié)合
[0240]已證明Notchl引誘物為Notch抑制劑，且假設(shè)基于受體引誘物本身的性質(zhì)，其通過與Notch配體競(jìng)爭(zhēng)性相互作用且從而防止Notch受體活化來阻斷Notch信號(hào)傳導(dǎo)。為了進(jìn)一步探究抑制機(jī)制，對(duì)Notchl引誘物和全長(zhǎng)Notch配體、DLL4以及JAGGED-1進(jìn)行共免疫沉淀。正如所料，顯示Notchl引誘物1-13僅與DLL4而非JAGGED-1相互作用，而Notchl引誘物10-24僅與JAGGED-1相互作用(圖5a和5b)。Notchl引誘物1_24與DLL4和JAGGED-1兩者相互作用，此支持先前的功能分析。
[0241 ] 盡管目前Notch胞外結(jié)構(gòu)域的寡聚為未知的，但研究Notch I引誘物是否可與Notch受體相互作用并阻斷Notch活性。在293T細(xì)胞中對(duì)Notch引誘物和全長(zhǎng)大鼠Notchl進(jìn)行共免疫沉淀，且結(jié)果顯示在圖6中。從Fe沉淀物中未檢測(cè)到Notchl，表明Notchl引誘物可能通過與配體競(jìng)爭(zhēng)且不與受體相互作用來抑制Notch信號(hào)傳導(dǎo)。
[0242]Notchl引誘物在視網(wǎng)臘血管牛成中杭血管牛成
[0243]出生后早期的小鼠視網(wǎng)膜已為經(jīng)廣泛研究的血管生成模型。其在一系列明確界定的事件中發(fā)展血管模式，所述事件包括在外周的血管發(fā)芽和在中心的修剪和重塑。因此，利用視網(wǎng)膜血管生成作為模型來進(jìn)一步探究Notchl引誘物的作用。已證明，DLL4阻斷或DLL4缺失增加血管生成發(fā)芽(洛博夫(Lobov)等人)，而內(nèi)皮細(xì)胞特異性JAGGED-1缺陷引起血管生成發(fā)芽減 少(貝內(nèi)迪托(Benedito)等人)。視網(wǎng)膜血管生成的一個(gè)標(biāo)志是在血管前面出現(xiàn)延伸線狀偽足的內(nèi)皮尖端細(xì)胞。Notch引誘物1-13表型模擬DLL4缺陷，因?yàn)橐暰W(wǎng)膜脈管系統(tǒng)顯示尖端細(xì)胞數(shù)目和血管生成發(fā)芽顯著增加。然而，Notch引誘物10-24引起血管生成減少，與內(nèi)皮細(xì)胞中JAGGED-1損失類似。兩種引誘物之間的視網(wǎng)膜脈管系統(tǒng)差異驚人顯著，且明顯指示Notch配體的不同抑制。Notchl引誘物1-24和1-36以及GS1、DAPT引起增加但嚴(yán)重破壞發(fā)芽血管生成(圖7a)。
[0244]表汰Notchl引誘物奪體的HUVEC的某閔剖析證明其陽.斷Notch信號(hào)傳導(dǎo)
[0245]接著，探究Notchl引誘物對(duì)Notch信號(hào)傳導(dǎo)和其下游標(biāo)靶的作用(參見圖8_11)。NOTCHl的轉(zhuǎn)錄物水平隨著引誘物的表達(dá)而顯著減少(分別99%、97%以及97% )，指示NOTCHl是由Notch活性水平自動(dòng)調(diào)節(jié)的。令人感興趣的是，其它NOTCH轉(zhuǎn)錄物水平不受這些引誘物的影響。N0TCH2和N0TCH3通常不在內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)，不過其有時(shí)可在培養(yǎng)的HUVEC中檢測(cè)到。Notch配體(JAGGED-1和DLL4)的表達(dá)不隨Notchl引誘物表達(dá)而改變。另外，還探究Notch信號(hào)傳導(dǎo)的直接下游標(biāo)靶來驗(yàn)證來自體外分析的結(jié)果。大部分標(biāo)靶(包括HEY1、HEYL以及HES1)隨所有引誘物的表達(dá)而顯著降低，指示Notchl引誘物有效阻斷Notch活性。然而，不同于其它引誘物，Notchl引誘物10-24不降低HEY2的表達(dá)水平。此結(jié)果可表明Notch配體有差別的調(diào)節(jié)Notch對(duì)不同HEY和HES的活性。尚未完全了解對(duì)Notch信號(hào)傳導(dǎo)的JAGGED-1和DLL4 (或通常JAG和DLL配體)調(diào)節(jié)的機(jī)制，且這些表達(dá)剖析數(shù)據(jù)可暗示什么下游標(biāo)靶在配體特異性Notch信號(hào)傳導(dǎo)中是重要的。已充分確定Notch路徑調(diào)節(jié)VEGF信號(hào)傳導(dǎo)。因此，進(jìn)一步探究Notchl引誘物對(duì)VEGF受體表達(dá)是否具有任何作用。所有Notchl引誘物變體增加HUVEC中的VEGFR-2表達(dá)，與NIIC相反。此發(fā)現(xiàn)支持以下觀察結(jié)果:用Notchl引誘物抑制Notch活性會(huì)增強(qiáng)HUVEC增殖和遷移，此可能由VEGFR-2表達(dá)和活性的增加引起。此外，Notch的抑制似乎顯著降低VEGFR-3表達(dá)。Notchl引誘物1-13和1-24降低VEGFR-1表達(dá)；然而，Notchl弓丨誘物10-24增加其表達(dá)，與在表達(dá)NlIC的HUVEC中類似。此結(jié)果是出乎意外的，因?yàn)镹otchl引誘物10-24顯示顯著的Notch抑制活性。通過流式細(xì)胞術(shù)驗(yàn)證對(duì)VEGF受體的基因表達(dá)剖析。VEGFR-2的細(xì)胞表面表達(dá)在表達(dá)引誘物的HUVEC中增加，且VEGFR-3減少，如圖12中的直方圖中所示。然而，VEGFR-1表面表達(dá)并不顯著改變，如qRT-PCR數(shù)據(jù)所表明。已知VEGFR-1以多個(gè)亞型存在:跨膜受體和可溶性蛋白。這些亞型源自于不同mRNA剪接變體。來自qRT-PCR和流式細(xì)胞術(shù)的數(shù)據(jù)表明VEGFR-1表達(dá)增加可歸因于可溶性亞型轉(zhuǎn)錄物，而非表面受體。接著，重復(fù)表達(dá)分析，利用對(duì)可溶性亞型的剪接變體具有特異性的PCR引物。如圖13中所示，可溶性VEGFR-1轉(zhuǎn)錄物因Notchl引誘物10-24而增加到14倍，但未受Notchl引誘物1-13和1_24顯著影響。此發(fā)現(xiàn)暗示JAGGED-1抑制引起可溶性VEGFR-1而非全長(zhǎng)受體上調(diào)，且DLL4抑制減少全長(zhǎng)VEGFR-1且對(duì)可溶性VEGFR-1無作用。
[0246]界定所表達(dá)的Notch/Notch配體的癌癥細(xì)胞株的基因表達(dá)剖析
[0247]為了探究Notchl引誘物對(duì)腫瘤血管生成的作用，利用4種不同細(xì)胞株:小鼠乳房腫瘤細(xì)胞(Mm5MT)、人類胰臟癌細(xì)胞(KPl)、小鼠路易斯肺癌細(xì)胞(LLC)以及小鼠黑色素瘤細(xì)胞(B16-F10)。Mm5MT和KPl細(xì)胞株不隨皮下移植而轉(zhuǎn)移，但LLC和B16-F10轉(zhuǎn)移到肺和肝。因此，這些腫瘤模型能夠不僅研究引誘物對(duì)腫瘤生長(zhǎng)和腫瘤血管生成的作用，而且能夠研究腫瘤細(xì)胞侵入和轉(zhuǎn)移。結(jié)果顯示于圖14中。Mm5MT和LLC類似地表達(dá)高水平的Notchl、Notch2 以及 Dll I 和低水平的 Notch3、Notch4 以及 JAGGED-1。KPl 細(xì)胞表達(dá)NOTCHl、N0TCH2、N0TCH3、JAGGED-1 以及 DLL4。且，B16-F10 細(xì)胞表達(dá) Notch2、Notch3、Notch4 以及僅一種配體JAGGED-1。
[0248]Notchl引誘物對(duì)腫瘤細(xì)朐增葙和細(xì)朐凋亡無仵何作用
[0249]在于小鼠中利用這些腫瘤細(xì)胞用于腫瘤實(shí)驗(yàn)之前，測(cè)試Notchl引誘物對(duì)培養(yǎng)物中的腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)是否將具有任何作用。首先，使用不同Notchl引誘物變體(1-13、10-24以及1-24)慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)所有Mm5MT和KPl腫瘤細(xì)胞，并進(jìn)行增殖和細(xì)胞凋亡分析。在4天時(shí)期內(nèi)觀測(cè)細(xì)胞增殖，且在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)細(xì)胞數(shù)目無顯著差異(圖15)。對(duì)于細(xì)胞凋亡，將培養(yǎng)的細(xì)胞再懸浮，與FITC偶聯(lián)的膜聯(lián)蛋白V抗體一起孵育，并通過流式細(xì)胞術(shù)分析。膜聯(lián)蛋白V陽性細(xì)胞的數(shù)目未觀測(cè)到顯著差異。
[0250]Notch引誘物分泌到血液循環(huán)中并當(dāng)經(jīng)由腺病毒載體表達(dá)時(shí)于腫瘤中檢測(cè)到
[0251]為了模擬引誘物的全身遞送，利用腺病毒遞送方法。將表達(dá)Notchl引誘物或作為對(duì)照的Fe的腺病毒靜脈內(nèi)注射到成年小鼠中。所注射的腺病毒感染肝細(xì)胞并產(chǎn)生高血清水平的經(jīng)編碼Notchl引誘物，其可通過蛋白印跡法來檢測(cè)(參見圖16a和b)。收集腫瘤之后，還通過免疫熒光評(píng)估腫瘤切片中的引誘物含量，所述免疫熒光顯示所有引誘物變體均到達(dá)腫瘤。
[0252]所有Notchl引誘物1_13、10_24以及1_24顯著減小腫瘤牛長(zhǎng)并對(duì)腫瘤血管牛成顯示不同作用
[0253]由于Notchl引誘物1-24和1_36以類似方式抑制腫瘤生長(zhǎng)和腫瘤血管生成，故僅使用1-24變體隨同配體特異性引誘物進(jìn)行后續(xù)腫瘤實(shí)驗(yàn)。已廣泛顯示DLL4阻斷通過增加非功能性腫瘤脈管系統(tǒng)來減少腫瘤生長(zhǎng)(諾格拉-特羅伊塞(Noguera-Troise)等人；李奇微(Ridgway)等人；霍伊(Hoey)等人)。因此，預(yù)期D114特異性引誘物1_13以相同方式表現(xiàn)。首先慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)Mm5MT-FGF4和KPl-VEGF腫瘤細(xì)胞以表達(dá)熒光素酶，以使得可針對(duì)熒光素酶活性或發(fā)光信號(hào)監(jiān)測(cè)腫瘤生長(zhǎng)。以2種方式進(jìn)行腫瘤實(shí)驗(yàn):第一，通過慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)將不同Notchl引誘物或Fe直接引入腫瘤細(xì)胞中；第二通過使用腺病毒。另外，在腫瘤收集之前將Hypoxyprobe? (組織中的缺氧標(biāo)記)和FITC偶聯(lián)的凝集素注射到小鼠中，以便分析腫瘤缺氧和血管灌注。不同引誘物的存在引起腫瘤生長(zhǎng)顯著降低。分別地，1-13、10-24以及l(fā)-36Mm5MT腫瘤的重量比對(duì)照小69%、52%以及39% (圖17a_17c)，且KPl腫瘤小40%,49%以及57% (圖18a-18c)。通常在移植后約一周腫瘤開始快速生長(zhǎng)后，可見引誘物的作用。來自引誘物組的腫瘤生長(zhǎng)看起來經(jīng)延遲或甚至逆轉(zhuǎn)，如KPl腫瘤中所示。由于腫瘤數(shù)據(jù)是收集自代表活細(xì)胞中熒光素酶活性的發(fā)光信號(hào)，故預(yù)測(cè)在實(shí)驗(yàn)?zāi)┢谀[瘤大小的減小可能是由死亡和壞死引起。
[0254]Notchl引誘物1-13引起非功能性腫瘤脈管系統(tǒng)增加
[0255]通過內(nèi)皮粘蛋白免疫熒光和凝集素灌注分析腫瘤脈管系統(tǒng)。如圖19a和19b和20a和20b中所示，具有Notchl引誘物1_13的腫瘤顯示Mm5MT和KPl模型兩者中的血管密度顯著增加。與對(duì)照腫瘤相比，1-13腫瘤中的脈管系統(tǒng)顯著地更高度分支且具有更廣泛的內(nèi)皮網(wǎng)絡(luò)。D114免疫熒光還顯示D114陽性內(nèi)皮細(xì)胞增加，此支持內(nèi)皮粘蛋白陽性細(xì)胞的高度發(fā)芽網(wǎng)絡(luò)。相比之下，來自10-24和1-24治療小鼠的腫瘤通過內(nèi)皮粘蛋白免疫染色明確顯示血管含量降低。這些形態(tài)變化也由對(duì)來自內(nèi)皮粘蛋白免疫熒光的血管區(qū)域的定量反映。另外，組織學(xué)評(píng)估顯示在所有實(shí)驗(yàn)組中更廣泛的腫瘤缺氧，此表明引誘物1-13組中的增加的腫瘤脈管系統(tǒng)可能并不具適當(dāng)功能。通過血管內(nèi)凝集素來比較血管灌注的分布，針對(duì)凝集素陽性區(qū)域和內(nèi)皮的內(nèi)皮粘蛋白免疫熒光定量所述血管內(nèi)凝集素。如圖21a和21b中所示，來自所有引誘物治療組的脈管系統(tǒng)均顯示較差的血管灌注，分別降低72%、90%以及84%。通常一些較大腫瘤血管經(jīng)灌注，但大部分較小分支血管不含有熒光凝集素。因此，腫瘤缺氧和凝集素灌注數(shù)據(jù)表明Notchl引誘物1-13抑制Notch/D114信號(hào)傳導(dǎo)路徑并引起非功能性血管網(wǎng)絡(luò)增加。
[0256]腫瘤血管擴(kuò)張和破壞的形態(tài)指示Notchl引誘物10-24的不同活性
[0257]與1-13腫瘤中增加的血管網(wǎng)絡(luò)不同，10-24腫瘤中的腫瘤脈管系統(tǒng)顯示內(nèi)皮細(xì)胞含量和破壞的血管結(jié)構(gòu)顯著降低。大部分腫瘤血管看起來較大且經(jīng)擴(kuò)張。已在體外顯示Notchl引誘物10-24充當(dāng)JAGGED-1特異性抑制劑，因此預(yù)測(cè)腫瘤脈管系統(tǒng)中的這些形態(tài)變化可能由JAGGED-1抑制引起。Notch3是動(dòng)脈一致性和血管平滑肌細(xì)胞成熟的主要Notch受體，且其表達(dá)和活性需要內(nèi)皮表達(dá)的JAGGED-1(多芒熱(Domenga)等人；劉(Liu)、肯納德(Kennard)以及莉莉(Lilly))。因此，對(duì)JAGGED-1介導(dǎo)的Notch信號(hào)傳導(dǎo)的抑制可引起破壞的壁細(xì)胞覆蓋和異常腫瘤血管成熟。
[0258]通討Notch引誘物10-24和1_24的TAGGED-1陽斷引起內(nèi)皮-周細(xì)朐相互作用失
M
[0259]由于在引誘物治療組中腫瘤中的內(nèi)皮細(xì)胞含量顯著受影響，故進(jìn)一步探究是否也改變血管周組分，尤其周細(xì)胞和巨噬細(xì)胞。圖22顯示在Mm5MT和KPl腫瘤切片上的NG2和內(nèi)皮粘蛋白免疫熒光。在來自1-13組的切片中NG2陽性周細(xì)胞含量顯著增加。在腫瘤血管周圍發(fā)現(xiàn)周細(xì)胞，且其與腫瘤內(nèi)皮的相互作用看起來正常并與對(duì)照腫瘤切片類似。所看到的NG2陽性周細(xì)胞極少呈無內(nèi)皮粘蛋白陽性血管的自由組分形式。然而，在10-24和1-24腫瘤切片上的NG2免疫熒光顯示與腫瘤血管無關(guān)的周細(xì)胞數(shù)目顯著增加。NG2和內(nèi)皮粘蛋白信號(hào)看起來有所減弱并以物理方式遭破壞。個(gè)別周細(xì)胞從腫瘤血管不規(guī)律地脫離，暗示正常血管結(jié)構(gòu)損失。這些結(jié)果表明，需要JAGGED-1介導(dǎo)的Notch活化來調(diào)節(jié)和維持內(nèi)皮-周細(xì)胞相互作用和功能，且這些相互作用的失調(diào)引起血管不穩(wěn)定和缺陷性血管灌注。
[0260]Notchl引誘物不影響LLC腫瘤轉(zhuǎn)移，伯延遲在肺和肝中形成B16-F10微轉(zhuǎn)移
[0261]皮下LLC和B16-F10腫瘤轉(zhuǎn)移到小鼠的肺和肝中。因此，使用表達(dá)熒光素酶的腫瘤株，利用這兩種其它腫瘤模型來評(píng)估腫瘤侵入和轉(zhuǎn)移中的引誘物活性。圖23和24顯示所有Notchl引誘物顯著抑制LLC和B16-F10腫瘤兩者的生長(zhǎng)，在重量上抑制40%、37%、32%和 58%,78%,71% (分別 LLC 和 B16-F10 ;1-13、10_24 以及 1-24) ? 收集并分析腫瘤負(fù)載小鼠的肺和肝(表1和2)。對(duì)來自肺和肝的發(fā)光信號(hào)的分析可靠地檢測(cè)轉(zhuǎn)移病灶(圖25和26)。從整個(gè)器官的總光子輻射率定量總轉(zhuǎn)移負(fù)荷，而也從個(gè)別信號(hào)評(píng)估轉(zhuǎn)移病灶的數(shù)目和大小。對(duì)于LLC總轉(zhuǎn)移負(fù)荷在引誘物組之間并無統(tǒng)計(jì)學(xué)上的差異，且微轉(zhuǎn)移數(shù)目也如此。在此時(shí)間點(diǎn)無肝轉(zhuǎn)移。令人感興趣的是，B16-F10腫瘤數(shù)據(jù)顯示一些來自對(duì)照組的小鼠具有肺和肝轉(zhuǎn)移，而引誘物組沒有轉(zhuǎn)移。盡管腫瘤轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)可能需要不同實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)以延長(zhǎng)腫瘤生長(zhǎng)的長(zhǎng)度，但這些數(shù)據(jù)表明Notchl引誘物可延遲腫瘤轉(zhuǎn)移。
[0262]表1.LLC腫瘤負(fù)載小鼠中的肺轉(zhuǎn)移的數(shù)目
【權(quán)利要求】
1.一種融合蛋白，其包含連續(xù)氨基酸，所述氨基酸的序列開始于所述融合蛋白的N端并與以下中的氨基酸序列相同: (a)人類Notchl受體蛋白的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域，之后為 (b)抗體的Fe部分， 其中所述人類Notchl受體蛋白的所述細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域 (i)以存在于EGF樣重復(fù)序列10的N端的氨基酸開始，且 (?)至少延伸到EGF樣重復(fù)序列23的C端氨基酸。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的融合蛋白，其中所述人類Notchl受體蛋白的所述細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的所述氨基酸序列延伸到EGF樣重復(fù)序列24的C端氨基酸。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的融合蛋白，其中所述人類Notchl受體蛋白的所述細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的所述氨基酸序列延伸到EGF樣重復(fù)序列36的C端氨基酸。
4.根據(jù)權(quán)利要求1到3中任一權(quán)利要求所述的融合蛋白，其中所述抗體的所述Fe部分是人類抗體的Fe部分。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的融合蛋白，其中所述連續(xù)氨基酸的所述序列包含SEQIDNO:3中所述的序列，其以位置24的胱氨酸開始且以位置833的賴氨酸結(jié)束。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的融合蛋白，其中所述連續(xù)氨基酸的所述序列包含SEQIDNO:5中所述的序列，其以位置24的胱氨酸開始且以位置1318的賴氨酸結(jié)束。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的融合蛋白，其中(a)所述人類Notchl受體蛋白的所述細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域位于信號(hào)肽之后。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的融合蛋白，其中所述信號(hào)肽是人類Notchl蛋白的信號(hào)肽或IgG重鏈的信號(hào)肽。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的融合蛋白，其中所述連續(xù)氨基酸序列闡述于SEQID N0:3中。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的融合蛋白，其中所述連續(xù)氨基酸序列闡述于SEQID N0:5中。
11.一種組合物，其包含根據(jù)權(quán)利要求1到10中任一權(quán)利要求所述的融合蛋白和載劑。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的組合物，其中所述融合蛋白以有效抑制JAGGED-1的活性的量存在于醫(yī)藥學(xué)上可接受的載劑中。
13.一種治療罹患年齡相關(guān)性黃斑變性(AMD)的個(gè)體的方法，所述方法包含以有效治療所述個(gè)體的AMD的量向所述個(gè)體投與根據(jù)權(quán)利要求1到10中任一權(quán)利要求所述的融合蛋白。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中所述AMD是濕性AMD。
15.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中所述AMD是干性AMD。
16.一種治療罹患糖尿病性視網(wǎng)膜病變的個(gè)體的方法，所述方法包含以有效治療所述個(gè)體的糖尿病性視網(wǎng)膜病變的量向所述個(gè)體投與根據(jù)權(quán)利要求1到10中任一權(quán)利要求所述的融合蛋白。
17.根據(jù)權(quán)利要求13到16中任一權(quán)利要求所述的方法，所述方法進(jìn)一步包含投與血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)的抑制劑。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中所述VEGF的抑制劑是VEGF-A、PGIF、VEGF-B,VEGF-C或VEGF-D的抑制劑。
19.根據(jù)權(quán)利要求13到16中任一權(quán)利要求所述的方法，所述方法進(jìn)一步包含投與VEGF受體抑制劑。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中所述VEGF受體抑制劑是VEGFR-1或VEGFR-2抑制劑。
21.一種治療罹患癌癥的個(gè)體的方法，所述方法包含以有效治療所述個(gè)體的癌癥的量向所述個(gè)體投與根據(jù)權(quán)利要求1到10中任一權(quán)利要求所述的融合蛋白。
22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其中所述癌癥是胰臟癌。
23.根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其中所述癌癥是乳癌。
24.一種治療罹患年齡相關(guān)性黃斑變性(AMD)的個(gè)體的方法，所述方法包含以有效治療所述個(gè)體的AMD的量向所述個(gè)體投與融合蛋白，其中所述融合蛋白包含連續(xù)氨基酸，所述氨基酸的序列開始于所述融合蛋白的N端并與以下中存在的氨基酸序列相同: (a)人類Notchl受體蛋白的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域，之后為 (b)抗體的Fe部分， 其中所述人類Notchl受體蛋白的所述細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域 (i)包含存在于EGF樣重復(fù)序列9的N端的氨基酸，且 (?)至少延伸到EGF樣重復(fù)序列13的C端氨基酸， 其限制條件為如果所述N端氨基酸是EGF樣重復(fù)序列I的N端氨基酸，那么所述C端氨基酸并非EGF樣重復(fù)序列36的C端氨基酸。
25.根據(jù)權(quán)利要求24所述的方法，其中所述AMD是濕性AMD。
26.根據(jù)權(quán)利要求24所述的方法，其中所述AMD是干性AMD。
27.一種治療罹患糖尿病性視網(wǎng)膜病變的個(gè)體的方法，所述方法包含以有效治療所述個(gè)體的糖尿病性視網(wǎng)膜病變的量向所述個(gè)體投與融合蛋白，其中所述融合蛋白包含連續(xù)氨基酸，所述氨基酸的序列開始于所述融合蛋白的N端并與以下中存在的氨基酸序列相同: (a)人類Notchl受體蛋白的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域，之后為 (b)抗體的Fe部分， 其中所述人類Notchl受體蛋白的所述細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域 (i)包含存在于EGF樣重復(fù)序列9的N端的氨基酸，且 (?)至少延伸到EGF樣重復(fù)序列13的C端氨基酸， 其限制條件為如果所述N端氨基酸是EGF樣重復(fù)序列I的N端氨基酸，那么所述C端氨基酸并非EGF樣重復(fù)序列36的C端氨基酸。
28.根據(jù)權(quán)利要求24到27中任一權(quán)利要求所述的方法，所述方法進(jìn)一步包含投與血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)的抑制劑。
29.根據(jù)權(quán)利要求28所述的方法，其中所述VEGF的抑制劑是VEGF-A、PGIF、VEGF-B,VEGF-C或VEGF-D的抑制劑。
30.根據(jù)權(quán)利要求24到27中任一權(quán)利要求所述的方法，所述方法進(jìn)一步包含投與VEGF受體抑制劑。
31.根據(jù)權(quán)利要求30所述的方法，其中所述VEGF受體抑制劑是VEGFR-1或VEGFR-2抑制劑。
32.—種治療罹患癌癥的個(gè)體的方法，所述方法包含以有效治療所述個(gè)體的癌癥的量向所述個(gè)體投與融合蛋白，其中所述融合蛋白包含連續(xù)氨基酸，所述氨基酸的序列開始于所述融合蛋白的N端并與以下中存在的氨基酸序列相同: (a)人類Notchl受體蛋白的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域，之后為 (b)抗體的Fe部分， 其中所述人類Notchl受體蛋白的所述細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域 (i)包含存在于EGF樣重復(fù)序列9的N端的氨基酸，且 (?)至少延伸到EGF樣重復(fù)序列13的C端氨基酸， 其限制條件為如果所述N端氨基酸是EGF樣重復(fù)序列I的N端氨基酸，那么所述C端氨基酸并非EGF樣重復(fù)序列36的C端氨基酸。
33.根據(jù)權(quán)利要求32所述的方法，其中所述癌癥是胰臟癌。
34.根據(jù)權(quán)利要求32所述的方法，其中所述癌癥是乳癌。
35.根據(jù)權(quán)利要求24到34中任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述人類Notchl受體蛋白的所述細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的所述氨基酸序列以存在于EGF樣重復(fù)序列9的所述N端的所述氨基酸開始并延伸到EGF樣重復(fù)序列23的C端氨基酸。
36.根據(jù)權(quán)利要求24到34中任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述人類Notchl受體蛋白的所述細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的所述氨基酸序列以存在于EGF樣重復(fù)序列9的所述N端的所述氨基酸開始并延伸到EGF樣重復(fù)序列36的所述C端氨基酸。
37.根據(jù)權(quán)利要求24到34中任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述人類Notchl受體蛋白的所述細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的所述氨基酸序列以存在于EGF樣重復(fù)序列I的N端的氨基酸開始并延伸到EGF樣重復(fù)序列13的所述C端氨基酸。
38.根據(jù)權(quán)利要求24到34中任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述人類Notchl受體蛋白的所述細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的所述氨基酸序列以存在于EGF樣重復(fù)序列I的所述N端的所述氨基酸開始并延伸到EGF樣重復(fù)序列24的C端氨基酸。
【文檔編號(hào)】A61K39/395GK103917247SQ201280054960
【公開日】2014年7月9日 申請(qǐng)日期:2012年10月4日 優(yōu)先權(quán)日:2011年10月4日
【發(fā)明者】簡(jiǎn)·基塔吉斯科, 卡麗·肖波爾, 森德·康格薩瑪克森 申請(qǐng)人:紐約哥倫比亞大學(xué)理事會(huì)