一種腫瘤血管阻斷劑多肽、基因、表達(dá)載體及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種腫瘤血管阻斷劑多肽，編碼其的基因，表達(dá)其的表達(dá)載體以及其在制備用于治療腫瘤的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明的腫瘤血管阻斷劑多肽從N端到C端依次包含：截?cái)嗟慕M織因子tTF的氨基酸序列、連接子和腫瘤靶向分子pHLIP的氨基酸序列。本發(fā)明的腫瘤血管阻斷劑多肽能夠通過(guò)pHLIP定位到腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞表面，從而特異的在腫瘤血管產(chǎn)生血栓，阻斷腫瘤部位血液供應(yīng)，達(dá)到治療腫瘤的目的；并且，由于其活性域(tTF)具有接近其天然的結(jié)構(gòu)，因此與現(xiàn)有技術(shù)的腫瘤靶向肽介導(dǎo)組織因子相比具有更好的凝血活性。
【專利說(shuō)明】一種腫瘤血管阻斷劑多肽、基因、表達(dá)載體及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及腫瘤治療的藥物【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及一種腫瘤血管阻斷劑多肽、基因、 表達(dá)載體及其應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 腫瘤血管是腫瘤細(xì)胞獲取營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)及排除代謝產(chǎn)物的通道，也是腫瘤細(xì)胞逃逸、 轉(zhuǎn)移的重要途徑之一，其形態(tài)學(xué)和功能都有別于機(jī)體的正常血管系統(tǒng)，因而是腫瘤靶向治 療的關(guān)鍵靶點(diǎn)之一。腫瘤血管靶向治療主要包括兩種模式：抑制新生血管生成和阻斷已有 腫瘤血管。其中阻斷腫瘤已有血管療法主要是通過(guò)選擇性的破壞腫瘤已有的血管，切斷腫 瘤血供，誘發(fā)腫瘤細(xì)胞發(fā)生缺血性壞死，從而達(dá)到治療腫瘤的目的。因此，如何實(shí)現(xiàn)特異的 阻斷腫瘤部位的血管，而對(duì)機(jī)體正常組織血管沒(méi)有影響，成為研究的熱點(diǎn)。
[0003] 組織因子（TF)是一個(gè)分子量約為47kDa的跨膜糖蛋白，在血栓形成過(guò)程中起重要 的作用。正常情況下，組織因子位于血管壁外膜細(xì)胞，不存在于循環(huán)中或不與循環(huán)血液接 觸。當(dāng)血管壁的完整性遭到破壞時(shí)，組織因子就會(huì)暴露于循環(huán)血液，通過(guò)激活凝固級(jí)聯(lián)反應(yīng) 發(fā)揮止血作用。組織因子由263個(gè)氨基酸殘基組成，其中氨基端的219個(gè)氨基酸殘基位于 細(xì)胞膜外，是組織因子的活性部位。研究表明，當(dāng)該區(qū)域處于游離狀態(tài)時(shí)，并沒(méi)有凝血活性； 但當(dāng)它被錨定在細(xì)胞膜上，并暴漏于血液中時(shí)，則會(huì)產(chǎn)生類似于全長(zhǎng)因子的凝血活性，因此 該段序列被稱之為截?cái)嗟慕M織因子（tTF)。
[0004] 腫瘤靶向分子pHLIP是一種由35個(gè)氨基酸構(gòu)成的多肽。當(dāng)其在體內(nèi)（pH = 7. 35-7. 45)循環(huán)時(shí)，處于自由伸展?fàn)顟B(tài)，并不能錨定于特定組織；但當(dāng)其到達(dá)腫瘤（pH < 7)部位時(shí)，則會(huì)產(chǎn)生酸響應(yīng)的構(gòu)象變化，形成α-螺旋結(jié)構(gòu)，并與細(xì)胞膜發(fā)生相互作用， 插入細(xì)胞膜中從而錨定于內(nèi)皮細(xì)胞表面。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提出一種腫瘤血管阻斷劑多肽，編碼其的基因，表達(dá)其的表達(dá) 載體以及其在制備用于治療腫瘤的藥物中的應(yīng)用；本發(fā)明的腫瘤血管阻斷劑多肽的活性 域--截?cái)嗟慕M織因子tTF具有更接近天然的結(jié)構(gòu)，因此具有更好的凝血活性，可以更有效 地發(fā)揮腫瘤血管阻斷作用。
[0006] 為達(dá)此目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：
[0007] 第一方面，本發(fā)明提供了一種腫瘤血管阻斷劑多肽，該腫瘤血管阻斷劑多肽從N 端到C端依次包含：截?cái)嗟慕M織因子tTF的氨基酸序列、連接子和腫瘤靶向分子pHLIP的氨 基酸序列。
[0008] 作為優(yōu)選，所述截?cái)嗟慕M織因子tTF的氨基酸序列如SEQ ID N0 :2所示；SEQ ID N0 : 2所示的氨基酸序列（從N端到C端）如下：
[0009] SGTTNTVAAYNLTWKSTNFKTILEWEPKPVNQVYTVQISTKSGDWKSKCFYTTDTECDLTDEIVKDVKQ TYLARVFSYPAGNVESTGSAGEPLYENSPEFTPYLETNLGQPTIQSFEQVGTKVNVTVEDERTLVRRNNTFLSLRDV FGKDLIYTLYYWKSSSSGKKTAKTNTNEFLIDVDKGENYCFSVQAVIPSRTVNRKSTDSPVECMGQEKGEFRE。
[0010] SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列即為組織因子位于細(xì)胞膜外的氨基酸殘基序列，當(dāng) 其處于游離狀態(tài)時(shí)，沒(méi)有凝血活性；當(dāng)其通過(guò)靶向肽定位于腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞膜上時(shí)，則會(huì) 發(fā)揮組織因子的功能，激活凝血途徑，誘發(fā)血栓形成。
[0011] 優(yōu)選地，所述腫瘤靶向分子pHLIP的氨基酸序列如SEQ ID N0:4所示；SEQ ID N0 : 4所示的氨基酸序列（從N端到C端）如下：
[0012] AEQNPIYWARYADWLFTTPLLLLDLALLVDADEGTo
[0013] 所述腫瘤靶向分子pHLIP在腫瘤部位的微酸性環(huán)境中能夠產(chǎn)生構(gòu)象變化，形成 α -螺旋結(jié)構(gòu)，并穿過(guò)細(xì)胞膜，從而定位于腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞膜。
[0014] 作為優(yōu)選，所述連接子由4-8個(gè)、優(yōu)選4-6個(gè)、更優(yōu)選5個(gè)氨基酸構(gòu)成；
[0015] 進(jìn)一步優(yōu)選地，所述連接子具有如SEQ ID Ν0:3所示的氨基酸序列。SEQ ID Ν0 :3 所示的氨基酸序列（從N端到C端）如下：GGGGS。
[0016] 所述連接子能夠使表達(dá)得到的融合蛋白活性域（即截?cái)嗟慕M織因子tTF)和靶向 域（即腫瘤靶向分子pHLIP)的功能保持完整。
[0017] 更進(jìn)一步優(yōu)選地，所述腫瘤血管阻斷劑多肽具有如SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序 列；SEQ ID N0 :1所示的氨基酸序列（從N端到C端）如下：
[0018] SGTTNTVAAYNLTWKSTNFKTILEWEPKPVNQVYTVQISTKSGDWKSKCFYTTDTECDLTDEIVKDVKQ TYLARVFSYPAGNVESTGSAGEPLYENSPEFTPYLETNLGQPTIQSFEQVGTKVNVTVEDERTLVRRNNTFLSLRDV FGKDLIYTLYYWKSSSSGKKTAKTNTNEFLIDVDKGENYCFSVQAVIPSRTVNRKSTDSPVECMGQEKGEFREGGGG SAEQNPIYWARYADWLFTTPLLLLDLALLVDADEGTo
[0019] 本發(fā)明所述腫瘤血管阻斷劑多肽，能夠響應(yīng)腫瘤微酸性的特點(diǎn)，產(chǎn)生構(gòu)象變化，形 成α -螺旋結(jié)構(gòu)，從而定位于腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞，并激活活性域一tTF的凝血活性，從而 能夠特異地在腫瘤血管形成血栓，達(dá)到抑制腫瘤生長(zhǎng)的治療目的；而在正常生理pH環(huán)境 中，其靶向域不能形成α -螺旋結(jié)構(gòu)，不具有穿膜功能，因此不能將活性域定位于細(xì)胞上， 使得活性域不能發(fā)揮凝血活性，從而保證該藥物分子在體內(nèi)循環(huán)時(shí)，不會(huì)在正常部位血管 形成血栓，避免副作用的產(chǎn)生。
[0020] 第二方面，本發(fā)明提供了一種腫瘤血管阻斷劑基因，其編碼如第一方面任一項(xiàng)所 述的腫瘤血管阻斷劑多肽。
[0021] 本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)理解，由于密碼子的簡(jiǎn)并性，本發(fā)明編碼所述腫瘤血管阻斷 劑多肽的核苷酸序列并不唯一，任何能夠編碼并表達(dá)所述腫瘤血管阻斷劑多肽的核苷酸序 列都應(yīng)當(dāng)理解為本發(fā)明的腫瘤血管阻斷劑基因。
[0022] 雖然如此，本發(fā)明仍然提供了一種腫瘤血管阻斷劑基因，所述腫瘤血管阻斷劑基 因具有如SEQ ID Ν0:5所示的核苷酸序列；SEQ ID Ν0 :5所示的核苷酸序列（從5'端到3' 端）如下：
[0023] TCAGGCACTACAAATACTGTGGCAGCATATAATTTAACTTGGAAATCAACTAATTTCAAGACAATTTTG GAGTGGGAACCCAAACCCGTCAATCAAGTCTACACTGTTCAAATAAGCACTAAGTCAGGAGATTGGAAAAGCAAATG CTTTTACACAACAGACACAGAGTGTGACCTCACCGACGAGATTGTGAAGGATGTGAAGCAGACGTACTTGGCACGGG TCTTCTCCTACCCGGCAGGGAATGTGGAGAGCACCGGTTCTGCTGGGGAGCCTCTGTATGAGAACTCCCCAGAGTTC ACACCTTACCTGGAGACAAACCTCGGACAGCCAACAATTCAGAGTTTTGAACAGGTGGGAACAAAAGTGAATGTGAC CGTAGAAGATGAACGGACTTTAGTCAGAAGGAACAACACTTTCCTAAGCCTCCGGGATGTTTTTGGCAAGGACTTAA TTTATACACTTTATTATTGGAAATCTTCAAGTTCAGGAAAGAAAACAGCCAAAACAAACACTAATGAGTTTTTGATT GATGTGGATAAAGGAGAAAACTACTGTTTCAGTGTTCAAGCAGTGATTCCCTCCCGAACAGTTAACCGGAAGAGTAC AGACAGCCCGGTAGAGTGTATGGGCCAGGAGAAAGGGGAATTCAGAGAAGGTGGTGGTGGTTCTGCTGAACAGAACC CGATCTACTGGGCTC GTTACGCTGACTGGCTGTTCACCACCCCGCTGCTGCTGCTGGACCTGGCTCTGCTGGTTGAC GCTGACGAAGGTACC。
[0024] 第三方面，本發(fā)明提供了一種腫瘤血管阻斷劑表達(dá)載體，其包含如第二方面所述 的腫瘤血管阻斷劑基因。
[0025] 本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)理解，本發(fā)明對(duì)表達(dá)載體所采用的載體質(zhì)粒并沒(méi)有特別限 制，因?yàn)楸绢I(lǐng)域的技術(shù)人員在得知本發(fā)明的基因序列的基礎(chǔ)上，結(jié)合本領(lǐng)域技術(shù)人員的公 知常識(shí)能夠選擇合適的載體質(zhì)粒用于本發(fā)明的基因表達(dá)。
[0026] 雖然如此，本發(fā)明特別提供一種載體質(zhì)粒，其為常用的pET30a載體質(zhì)粒。因此，本 發(fā)明的表達(dá)載體優(yōu)選為采用pET30a載體質(zhì)粒構(gòu)建的表達(dá)載體。
[0027] 第四方面，本發(fā)明提供了一種腫瘤血管阻斷劑組合物，其包含如第一方面任一項(xiàng) 所述的腫瘤血管阻斷劑多肽、如第二方面任一項(xiàng)所述的腫瘤血管阻斷劑基因或如第三方面 任一項(xiàng)所述的腫瘤血管阻斷劑表達(dá)載體。
[0028] 第五方面，本發(fā)明提供了如第一方面任一項(xiàng)所述的腫瘤血管阻斷劑多肽、如第二 方面任一項(xiàng)所述的腫瘤血管阻斷劑基因或如第三方面任一項(xiàng)所述的腫瘤血管阻斷劑表達(dá) 載體在制備用于治療腫瘤的藥物中的應(yīng)用。
[0029] 本發(fā)明所述腫瘤血管阻斷劑多肽具體可以通過(guò)設(shè)計(jì)相應(yīng)的基因序列，構(gòu)建融合蛋 白表達(dá)質(zhì)粒，并將其轉(zhuǎn)入如BL21大腸桿菌中，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)并純化，得到具有腫瘤靶向性 及凝血活性的腫瘤血管阻斷劑。
[0030] 本發(fā)明所述腫瘤血管阻斷劑多肽，能夠響應(yīng)腫瘤微酸性的特點(diǎn),產(chǎn)生構(gòu)象變化，形 成α -螺旋結(jié)構(gòu)，從而定位于腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞，并激活活性域一tTF的凝血活性，從而 能夠特異地在腫瘤血管形成血栓，達(dá)到抑制腫瘤生長(zhǎng)的治療目的；而在正常生理pH環(huán)境 中，其靶向域不能形成α -螺旋結(jié)構(gòu)，不具有穿膜功能，因此不能將活性域定位于細(xì)胞上， 使得活性域不能發(fā)揮凝血活性，從而保證該藥物分子在體內(nèi)循環(huán)時(shí)，不會(huì)在正常部位血管 形成血栓，避免副作用的產(chǎn)生。
[0031] 本發(fā)明所述腫瘤血管阻斷劑多肽無(wú)需滲透到腫瘤組織中，在腫瘤血管處即可直接 發(fā)揮作用，因此所用藥量減少，且不易產(chǎn)生耐藥性；多肽的主體部分來(lái)源于自身的組織因子 胞外區(qū)，因此免疫原性小，能夠很好的躲避免疫系統(tǒng)，減少藥物在體內(nèi)循環(huán)時(shí)被免疫清除。
[0032] 此外，本發(fā)明所述腫瘤血管阻斷劑多肽與已經(jīng)報(bào)道的其他腫瘤靶向肽介導(dǎo)組織因 子相比，更接近組織因子天然的構(gòu)象，其凝血活性更好。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0033] 圖1是本發(fā)明腫瘤血管阻斷劑多肽（融合蛋白）的結(jié)構(gòu)示意圖（Α)和融合蛋白 SDS-PAGE電泳鑒定結(jié)果（Β);圖（Α)顯示，所述腫瘤血管阻斷劑多肽包括活性域、連接域和 靶向域三部分；圖（Β)中，Μ表示蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)分子量，1表示融合蛋白的泳道，箭頭指示處即 為融合蛋白。
[0034] 圖2是本發(fā)明腫瘤血管阻斷劑通過(guò)尾靜脈注入裸鼠乳腺癌腫瘤模型12小時(shí)后的 治療效果；其中，（A)為注射生理鹽水（對(duì)照）后荷瘤小鼠體外形貌，（B)為對(duì)照腫瘤，（C) 為對(duì)照腫瘤病理切片（箭頭代表腫瘤血管，沒(méi)有血栓形成），（D)為注射腫瘤血管阻斷劑后 荷瘤小鼠體外形貌，（E)為注射腫瘤血管阻斷劑后腫瘤、（F)為注射腫瘤血管阻斷劑后腫瘤 病理切片（箭頭代表腫瘤血管，有明顯血栓形成）。

【具體實(shí)施方式】
[0035] 下面將結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方案進(jìn)行詳細(xì)描述。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理 解，以下實(shí)施例僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例，以便于更好地理解本發(fā)明，因而不應(yīng)視為限定 本發(fā)明的范圍。
[0036] 下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法；所用的實(shí)驗(yàn)材料，如無(wú) 特殊說(shuō)明，均為自常規(guī)生化試劑廠商購(gòu)買得到的。
[0037] 實(shí)施例1 :融合蛋白質(zhì)粒的構(gòu)建
[0038] 用全基因合成的方式，合成該融合蛋白的基因序列SEQ ID N0 :5,并在該融合蛋白 基因序列的兩端分別設(shè)計(jì)Nde I和Xho I酶切位點(diǎn)。然后，將融合蛋白基因通過(guò)上述酶切位 點(diǎn)，連接入pET30a載體中，從而得到融合蛋白表達(dá)載體。
[0039] 實(shí)施例2 :融合蛋白的表達(dá)和純化
[0040] (1)融合蛋白的表達(dá)
[0041] 將上述融合蛋白表達(dá)載體轉(zhuǎn)化入BL21大腸桿菌中，先接5 μ L菌液到5mLLB液體 培養(yǎng)基中，37°C，200Xrpm，搖床培養(yǎng)16h。將培養(yǎng)的菌液轉(zhuǎn)接到500mLLB液體培養(yǎng)基中， 37°C，200Xrpm，培養(yǎng)至 0D = 0· 6 ?0· 8,用 IPTG(0. 5mM)誘導(dǎo)表達(dá) 4h。
[0042] (2)融合蛋白的純化
[0043] 將上述IPTG誘導(dǎo)表達(dá)的菌液離心（6000Xrpm，5min)，棄上清，收菌。沉淀用 25mL10mM Tris-HCl (pH = 8. 0)溶液吹散，超聲破菌，12000Xrpm，離心lOmin，上清去除干 凈，用25mL10mM Tris-HCl (pH = 8. 0)溶液重懸超聲離心得到的沉淀，靜置lOmin。重復(fù)上 述操作一次，得到沉淀。加入少量的10mM Tris-HCl (pH = 8. 0)溶液重懸沉淀，再加8mL含 8M尿素的10mM Tris-HCl (pH = 8. 0)溶液溶解蛋白，12000 Xrpm，離心10min，收集上清。
[0044] 通過(guò)SDS-PAGE電泳鑒定融合蛋白，結(jié)果如圖1 (B)所示，可見(jiàn)形成清晰、純凈的條 帶，大小在30KDa以上，與預(yù)期相符。
[0045] 實(shí)施例3 :腫瘤血管阻斷劑效果實(shí)驗(yàn)
[0046] 將實(shí)施例2提供的腫瘤血管阻斷劑多肽尾靜脈注入裸鼠乳腺癌腫瘤模型（模型 的構(gòu)建參考文獻(xiàn)：Tian Y, Li S, Song J, Zhu M, Ji T, Nie G, Wei J and Zhao Y. A doxorubition delivery platform using engineered natural membrane vesicles exosomes for targeted tumor therapy. Biomaterials (2013).)，12小時(shí)后觀察治療效果，以注射生理鹽水作為對(duì) 照組。結(jié)果如圖2所示。
[0047] 由圖2可見(jiàn)，與注射生理鹽水荷瘤小鼠（A)相比，本發(fā)明的腫瘤血管阻斷劑能夠引 起腫瘤部位出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的深紅色（D);解剖后，可見(jiàn)對(duì)照組腫瘤（B)為正常的肉紅色，而 注射腫瘤血管阻斷劑（E)的腫瘤則出現(xiàn)明顯的血栓引起的暗紅色；腫瘤病理切片則可以看 出與對(duì)照組（C)相比，注射腫瘤血管阻斷劑組（F)在腫瘤血管中形成了明顯的血栓（箭頭 所示）。
[0048] 上述結(jié)果表明，本發(fā)明的腫瘤血管阻斷劑能夠在腫瘤血管中形成血栓，切斷腫瘤 血供，誘發(fā)腫瘤細(xì)胞發(fā)生缺血性壞死，從而達(dá)到治療腫瘤的目的。
[0049] 申請(qǐng)人:聲明，本發(fā)明通過(guò)上述實(shí)施例來(lái)說(shuō)明本發(fā)明的詳細(xì)特征以及詳細(xì)方法，但 本發(fā)明并不局限于上述詳細(xì)特征以及詳細(xì)方法，即不意味著本發(fā)明必須依賴上述詳細(xì)特征 以及詳細(xì)方法才能實(shí)施。所屬【技術(shù)領(lǐng)域】的技術(shù)人員應(yīng)該明了，對(duì)本發(fā)明的任何改進(jìn)，對(duì)本發(fā) 明選用組分的等效替換及輔助成分的添加、具體方式的選擇等，均落在本發(fā)明的保護(hù)范圍 和公開(kāi)范圍之內(nèi)。
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【權(quán)利要求】
1. 一種腫瘤血管阻斷劑多肽，其特征在于，從N端到C端依次包含：截?cái)嗟慕M織因子 tTF的氨基酸序列、連接子和腫瘤靶向分子pHLIP的氨基酸序列。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的腫瘤血管阻斷劑多肽，其特征在于，所述截?cái)嗟慕M織因子tTF 的氨基酸序列如SEQ ID NO : 2所示； 優(yōu)選地，所述腫瘤靶向分子pHLIP的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的腫瘤血管阻斷劑多肽，其特征在于，所述連接子由4-8 個(gè)、優(yōu)選4-6個(gè)、更優(yōu)選5個(gè)氨基酸構(gòu)成； 優(yōu)選地，所述連接子具有如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的腫瘤血管阻斷劑多肽，其特征在于，所述腫瘤血管 阻斷劑多肽具有如SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列。
5. -種腫瘤血管阻斷劑基因，其編碼如權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的腫瘤血管阻斷劑多 肽。
6. 如權(quán)利要求5所述的腫瘤血管阻斷劑基因，其特征在于，具有如SEQID NO:5所示的 核苷酸序列。
7. -種腫瘤血管阻斷劑表達(dá)載體，其包含如權(quán)利要求5或6所述的腫瘤血管阻斷劑基 因。
8. 如權(quán)利要求7所述的腫瘤血管阻斷劑表達(dá)載體，其特征在于，所述表達(dá)載體的基礎(chǔ) 載體為pET30a質(zhì)粒載體。
9. 一種腫瘤血管阻斷劑組合物，其包含如權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的腫瘤血管阻斷劑 多肽、如權(quán)利要求5-6任一項(xiàng)所述的腫瘤血管阻斷劑基因或如權(quán)利要求7-8任一項(xiàng)所述的 腫瘤血管阻斷劑表達(dá)載體。
10. 如權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的腫瘤血管阻斷劑多肽、如權(quán)利要求5-6任一項(xiàng)所述的 腫瘤血管阻斷劑基因或如權(quán)利要求7-8任一項(xiàng)所述的腫瘤血管阻斷劑表達(dá)載體在制備用 于治療腫瘤的藥物中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】A61P35/00GK104045717SQ201410323457
【公開(kāi)日】2014年9月17日 申請(qǐng)日期:2014年7月8日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月8日
【發(fā)明者】聶廣軍, 李素萍, 田艷華, 趙穎 申請(qǐng)人:國(guó)家納米科學(xué)中心