一種獸用卵泡刺激素類(lèi)似物的制備方法
【專(zhuān)利摘要】一種獸用卵泡刺激素類(lèi)似物及其制備方法，根據(jù)α和β肽鏈間連接序列的長(zhǎng)度、可折疊性、疏水性、電荷效應(yīng)來(lái)設(shè)計(jì)連接序列，其連接序列對(duì)應(yīng)的核苷酸序列為：SEQ?ID?NO：2、SEQ?ID?NO：3、SEQ?ID?NO：4、SEQ?ID?NO：5、SEQ?ID?NO：6、SEQ?ID?NO：7、SEQ?ID?NO：8、SEQ?ID?NO：9、SEQ?ID?NO：10、SEQ?ID?NO：11、SEQ?ID?NO：12、SEQ?ID?NO：13、SEQ?ID?NO：14、SEQ?ID?NO：15、SEQ?ID?NO：16、SEQ?ID?NO：17、SEQ?ID?NO：18、SEQ?ID?NO：19、SEQ?ID?NO：20中的任一種，通過(guò)研究比較其各自的表達(dá)量和生物活性。本發(fā)明所制得的獸用卵巢刺激素類(lèi)似物的融合蛋白與已知的融合蛋白具有相似的生物功能，且其中多個(gè)融合蛋白的表達(dá)量明顯提高，對(duì)于天然卵巢刺激素具有替代作用，有重大的商業(yè)價(jià)值，值得大范圍推廣。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種獸用卵泡刺激素類(lèi)似物的制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，特別涉及一種獸用卵泡刺激素類(lèi)似物的制備方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 卵泡刺激素（Follicle-stimulating hormone, FSH)是由動(dòng)物腦垂體前葉嗜堿性 細(xì)胞合成和分泌的一種糖蛋白激素，由α和β兩條多肽鏈（或稱(chēng)亞基）以非共價(jià)鍵聯(lián)結(jié) 而成?？梢源龠M(jìn)雌激素的分泌、誘導(dǎo)動(dòng)物發(fā)情、促進(jìn)卵泡卵子成熟、超數(shù)排卵和刺激精子生 成。
[0003] 目前獸用FSH均為動(dòng)物腦組織提取物，不但參雜不同含量的促黃體素致使超排效 果不穩(wěn)定，還有攜帶生物源性傳染物的潛在危險(xiǎn)。通過(guò)基因工程研發(fā)獸用FSH，是當(dāng)前的研 究熱點(diǎn)。迄今已見(jiàn)諸于報(bào)道的有關(guān)基因重組FSH的基因工程策略主要有兩種。一種是α 和β兩條多肽鏈分別表達(dá)后，再通過(guò)非共價(jià)鍵聯(lián)結(jié)形成異源二聚體。這種方法受該兩條多 肽鏈彼此聯(lián)結(jié)的效率所限，因而許多研究者轉(zhuǎn)而研究如何把α和β兩條多肽鏈在基因水 平連接在一起，從而編碼為單一肽鏈的融合蛋白。其中在α和β兩條多肽鏈之間起連接 作用的氨基酸序列稱(chēng)為連接序列（Linker)。Weenen等（J Clin Endocrinol Metab，2004， 89:5204-5212.)以及美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)公告US 2008/0234186 A1通過(guò)人FSH的α和β兩條 多肽鏈與不同的連接序列重組，比較所形成的融合蛋白的活性。在連接序列內(nèi)分別引進(jìn)含 1、2和4個(gè)Ν-連接糖基化位點(diǎn)序列，或采用人絨毛膜促性腺激素 β亞基的羧端肽（CTP) 作為連接序列。所得到的融合蛋白FSH-NUFSH-N2和FSH-Μ、和FSH-CTP的糖基化程度和 體內(nèi)半衰期均較野生型FSH明顯增加，但體內(nèi)半衰期與糖基化程度的增加并不呈簡(jiǎn)單的線 性關(guān)系。該發(fā)明強(qiáng)調(diào)了糖基化對(duì)長(zhǎng)效的作用，但未充分考慮到連接序列本身對(duì)于融合蛋白 表達(dá)的影響。結(jié)果表明其表達(dá)量都僅在1.3-14pmol/ml的范圍之內(nèi)（J Clin Endocrinol Metab，2004,89 :5204-5212 和美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)公告 US2008/0234186 A1)。
[0004] 連接序列的長(zhǎng)度、可折疊性、疏水性、電荷效應(yīng)等特性與融合蛋白中的α和β肽 鏈在彼此聯(lián)結(jié)之前能否各自折疊成為正確的空間結(jié)構(gòu)密切相關(guān)。兩條肽鏈以及其間的連接 序列，這三者空間三維結(jié)構(gòu)的相互關(guān)系直接影響融合蛋白的生物活性，也影響融合蛋白的 產(chǎn)量。所以適應(yīng)于α和β肽鏈的連接序列堿基的選擇及其排列順序至關(guān)重要。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種獸用卵泡刺激素類(lèi)似物及其制備方法。針對(duì)上述現(xiàn)有 技術(shù)存在的問(wèn)題，根據(jù)α和β肽鏈間連接序列的長(zhǎng)度、可折疊性、疏水性、電荷效應(yīng)來(lái)設(shè)計(jì) 連接序列從而得到不同的獸用卵泡刺激素類(lèi)似物。對(duì)由不同連接序列融合而成的不同的卵 泡刺激素類(lèi)似物的產(chǎn)量和生物活性進(jìn)行比較與篩選，從中選出高表達(dá)量的最佳序列。
[0006] 為達(dá)到上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案為：
[0007] -種獸用卵泡刺激素類(lèi)似物，所述獸用卵泡刺激素類(lèi)似物中，根據(jù)α和β肽鏈 間連接序列的長(zhǎng)度、可折疊性、疏水性、電荷效應(yīng)來(lái)設(shè)計(jì)連接序列，其連接序列對(duì)應(yīng)的核苷 酸序列為：SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:6、SEQ ID N0:7、SEQ ID N0:8、SEQ ID N0:9、SEQ ID N0:10、SEQ ID N0:11、SEQ ID N0:12、SEQ ID N0:13、SEQ ID N0:14、SEQ ID N0:15、SEQ ID N0:16、SEQ ID N0:17、SEQ ID N0:18、SEQ ID NO :19、SEQ ID NO :20 中的任一種。
[0008] 進(jìn)一步的，所述連接序列對(duì)應(yīng)的核苷酸序列為：SEQ ID N013、SEQ ID NO : 14、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO :18 中的任一種。
[0009] 進(jìn)一步的，所述獸用卵泡刺激素類(lèi)似物制備方法包括如下步驟：
[0010] 步驟一、將Genbank上記載的天然羊卵泡刺激素兩個(gè)亞基β和α基因并在其間 插入已知連接序列（兩端含酶切點(diǎn)），進(jìn)行全序列合成（SEQ ID NO :1)，再用pcDNA3. 1 (+) 質(zhì)粒進(jìn)行分子克隆。分別
[0011] 步驟一、將Genbank上記載的天然羊卵泡刺激素β和α亞基的基因通過(guò)兩端分 別含BamHI、SpeI酶切點(diǎn)的已知連接序列連接起來(lái)，進(jìn)行全序列合成，其序列為SEQ ID Ν0: 1，兩端分別函Nhe I和EcoR I酶切點(diǎn)，再用pcDNA3. 1 (+)質(zhì)粒進(jìn)行分子克??；經(jīng)過(guò)雙酶切， 依次用下列19個(gè)序列取代上述的已知連接序列，SEQ ID N0 :2、SEQ ID N0 :3、SEQ ID N0 : 4、SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:6、SEQ ID N0:7、SEQ ID N0:8、SEQ ID N0:9、SEQ ID N0:10、 SEQ ID NO :11、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16、SEQ ID N0:17、SEQ ID N0:18、SEQ ID N0:19、SEQ ID N0:20,以制備 19 種不同的新的 表達(dá)質(zhì)粒；將所得表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染DH5大腸桿菌，經(jīng)氨芐青霉素抗性篩選，提取單克隆菌落質(zhì) 粒DNA，酶切鑒定后進(jìn)行測(cè)序；
[0012] 步驟二、重組質(zhì)粒DNA序列經(jīng)確認(rèn)之后，進(jìn)行單酶切，使之線性化，線性化后轉(zhuǎn)染 CH0細(xì)胞，經(jīng)G418抗性篩選，單克隆化，通過(guò)western blotting挑選高表達(dá)克??；
[0013] 步驟三、進(jìn)行逐級(jí)放大傳代培養(yǎng)擴(kuò)增，western blotting檢測(cè)培養(yǎng)液，證實(shí)重組 FSH高表達(dá)，細(xì)胞加防凍劑，分裝液態(tài)氮凍存；
[0014] 步驟四、復(fù)蘇，經(jīng)含血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，無(wú)血清培養(yǎng)馴化，逐級(jí)放大傳代培養(yǎng)擴(kuò)增，證 實(shí)重組FSH高表達(dá)，作為種子細(xì)胞加防凍劑，分裝液態(tài)氮凍存。
[0015] 進(jìn)一步的，所述獸用卵泡刺激素類(lèi)似物制備方法步驟一中，雙酶切的內(nèi)切酶為：限 制性?xún)?nèi)切酶Nhe I和EcoR I。
[0016] 進(jìn)一步的，所述獸用卵泡刺激素類(lèi)似物制備方法步驟二中，單酶切的限制性?xún)?nèi)切 酶為 Pspl406I。
[0017] 進(jìn)一步的，所述獸用卵泡刺激素類(lèi)似物制備方法步驟二中，所述G418抗性篩選的 濃度為800 μ g/ml。
[0018] 進(jìn)一步的，所述獸用卵泡刺激素類(lèi)似物制備方法步驟三中，分別選取25cm2、75cm 2、 175cm2、225cm2的細(xì)胞培養(yǎng)瓶進(jìn)行逐級(jí)放大傳代培養(yǎng)擴(kuò)增。
[0019] 進(jìn)一步的，包含上述任一連接序列的獸用卵巢刺激素類(lèi)似物及含有該獸用卵巢刺 激素類(lèi)似物的藥物在促進(jìn)卵泡發(fā)育方面的應(yīng)用。
[0020] 相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的有益效果為：本發(fā)明根據(jù)α和β肽鏈間連接序列的長(zhǎng) 度、可折疊性、疏水性、電荷效應(yīng)設(shè)計(jì)了一組不同的連接序列，從而得到一組不同的獸用卵 巢刺激素類(lèi)似物，通過(guò)研究比較其各自的表達(dá)量和生物活性。本發(fā)明所制得的獸用卵巢刺 激素類(lèi)似物的融合蛋白與已知的融合蛋白具有相似的生物功能，且其中多個(gè)融合蛋白的表 達(dá)量明顯提高，對(duì)于天然卵巢刺激素具有很好的替代作用，具有重大的商業(yè)價(jià)值，值得大范 圍推廣。

【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0021] 圖1 :為采用western blotting半定量監(jiān)測(cè)重組FSH的表達(dá)圖，將重組FSH進(jìn)行 工程細(xì)胞的單克隆挑選。1 :蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；2 :未轉(zhuǎn)染的CH0細(xì)胞培養(yǎng)液（陰性對(duì)照），加 樣量為20 μ 1 ;3-8 ;六個(gè)克隆已轉(zhuǎn)染的CH0細(xì)胞培養(yǎng)液，加樣量分別為15 μ 1。根據(jù)條帶顯 影的強(qiáng)度判斷表達(dá)量。主帶上方的條帶是重組蛋白的二聚體，主帶下方的條帶為降解產(chǎn)物。
[0022] 圖2 :為比較卵泡刺激素類(lèi)似物的卵巢增重功能圖。標(biāo)準(zhǔn)品和7份受試品均 體現(xiàn)量效關(guān)系，基本呈直線關(guān)系。其中由已知的連接序列（Linkerl)和本發(fā)明設(shè)計(jì) 的連接序列（Linkerl6)與標(biāo)準(zhǔn)品三者的斜率基本一致（k分別為21.782(Linkerl)， 21. 785 (Linkerl6)，和 21. 783 (標(biāo)準(zhǔn)品）。

【具體實(shí)施方式】
[0023] 下面結(jié)合附圖及具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明方案做進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明：
[0024] 實(shí)施例1 :表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建和工程細(xì)胞的建立
[0025] 1.根據(jù)Genbank上記載的天然羊FSH的氨基酸序列和核苷酸序列(http:// www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez ? cmd = Retrieve&db = nucleotide&dopt = GenBank&list uids = 57619323,和 http: //www. ncbi. nlm. nih. gov/sites/entrez ? cmd =Retrieve&db = nucleotide&dopt = GenBank&list uids = 1365)，設(shè)計(jì)并進(jìn)行全基 因SEQIDNO:l合成，含已知連接序列（Linkerl):ggatccggctccaacgccaccggctccggc tccaacgcca cctccggctc cactag 序列（J Clin Endocrinol Metab，2004,89:5204-5212)。
[0026] 2.構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒：將雙鏈SEQ ID NO 1和pcDNA3. 1(+)質(zhì)粒經(jīng)過(guò)分別經(jīng)過(guò)雙 酶切（Nhel和EcoRI)，l%瓊脂電泳分離，萃取。將經(jīng)過(guò)雙酶切處理過(guò)的SEQ ID NO 1和 pcDNA3. 1(+)質(zhì)粒通過(guò)連接酶ligase連接。按標(biāo)準(zhǔn)CaCl2法轉(zhuǎn)染DH5a大腸桿菌，經(jīng)氨 節(jié)青霉素抗性篩選，37°C培養(yǎng)。按質(zhì)粒提取試劑盒（Quiagen)的說(shuō)明書(shū)提取單克隆菌落 質(zhì)粒DNA，命名為pcDNA3. 1-FSH1。酶切鑒定后進(jìn)行測(cè)序確認(rèn)、備用。將pcDNA3. 1-FSH1 經(jīng)過(guò)BamHI+Spel雙酶切，經(jīng)過(guò)1 %瓊脂電泳分離，棄除Linker 1，萃取獲得線性化的 pcDNA3.1-FSH，備用。雙鏈的 SEQ ID N0:2(Linker2)、SEQ ID N0:3(Linker3)、SEQ ID N0: 4(Linker4)、SEQ ID N0:5(Linker5)、SEQ ID N0:6(Linker6)、SEQ ID N0:7(Linker7)、SEQ ID NO :8(Linker8)、
[0027] SEQ ID NO :9 (Linker9)、SEQ ID NO :10 (Linker 10)、SEQ ID NO :11 (Linker 11)、 SEQ ID NO ：12(Linkerl2), SEQ ID NO ： 13 (Linkerl3), SEQ ID NO ： 14 (Linker 14), SEQ ID NO ：15(Linkerl5), SEQ ID NO ： 16(Linkerl6), SEQ ID NO ： 17(Linkerl7), SEQ ID NO： 18(Linkerl8)、SEQ ID N0:19(Linkerl9)、SEQ ID N0:20(Linker20)(以下簡(jiǎn)稱(chēng) Linker2 ? 20)，分別經(jīng)過(guò)BamHI+Spel雙酶切，分別經(jīng)過(guò)1%瓊脂電泳分離、萃取。將經(jīng)過(guò)雙酶切 的Linker2?20分別與pcDNA3. 1-FSH連接，獲得19份重組質(zhì)粒（pcDNA3. 1-FSH2? pcDNA3. 1-FSH20)，用于轉(zhuǎn)染DH5 α大腸桿菌。經(jīng)氨芐青霉素抗性篩選，分別提取單克隆菌 落質(zhì)粒DNA，獲得相應(yīng)的19份重組質(zhì)粒pcDNA3. 1-FSH2?pcDNA3. 1-FSH20。酶切鑒定后進(jìn) 行測(cè)序確認(rèn)。
[0028] 3.建立工程細(xì)胞：
[0029] 3. 1. CH0細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)：轉(zhuǎn)染的前一天，以3?4xl05/ml的細(xì)胞密度接種6孔培養(yǎng) 板，培養(yǎng)基含10%牛血清全培養(yǎng)劑DMEM。共設(shè)21孔。
[0030] 3. 2.質(zhì)粒的線性化和脂質(zhì)體包裹：重組質(zhì)粒序列經(jīng)測(cè)序確認(rèn)之后，采用限制性?xún)?nèi) 切酶Pspl4061分別進(jìn)行酶切線性化。將2 μ 1 (1 μ g/ μ 1)經(jīng)線性化了的重組質(zhì)粒DNA溶入 200 μ 1無(wú)血清培養(yǎng)基中，混勻；另外將20 μ 1脂質(zhì)體Lipofectin (Invitrogen)溶入200 μ 1 無(wú)血清培養(yǎng)基中，輕輕混勻，再將制備好的DNA與脂質(zhì)體輕輕混合均勻，室溫放置25? 30min，待用。依照同樣方法制備21份混合溶液，其中1份省略了質(zhì)粒，作為陰性對(duì)照。
[0031] 3. 3.細(xì)胞的轉(zhuǎn)染：CH0細(xì)胞在6孔培養(yǎng)板里含小牛血清的培養(yǎng)基貼壁培養(yǎng)至 85-95%，用無(wú)血清培養(yǎng)基沖洗兩遍后，加入2ml無(wú)血清培養(yǎng)基。將上述21份混合溶液分別 加入21個(gè)孔中，輕輕搖勻。在37°C，5%的C0 2，飽和濕度中孵育12h，更換含10%牛血清的 全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48?72h。
[0032] 3. 4.抗性細(xì)胞的篩選：將轉(zhuǎn)染細(xì)胞進(jìn)行傳代生長(zhǎng)24h后，更換為選擇性培養(yǎng)基 (5%小牛血清并含有600 μ 1 G418)繼續(xù)培養(yǎng)。間隔2?3d換液一次，待陰性對(duì)照細(xì)胞全 部死亡時(shí)，收集G418抗性的CH0細(xì)胞系。0. 25%的胰酶作用于單層貼壁的細(xì)胞，在37°C條 件下，消化1-2分鐘。并用培養(yǎng)液吹散，準(zhǔn)確計(jì)數(shù)。分別以2xl(T6/ml密度接種細(xì)胞貼壁培 養(yǎng)，三天后采用已知的放射免疫法（J Clin Endocrinol Metab，2004,89 :5204-5212.)檢測(cè) 各培養(yǎng)液上清液中卵泡刺激素類(lèi)似物的濃度結(jié)果如表1 (pRIA，表1)。
[0033] 表1.各培養(yǎng)液上清液中卵泡刺激素類(lèi)似物的濃度
[0034]
[0035]

【權(quán)利要求】
1. 一種獸用卵泡刺激素類(lèi)似物，其特征在于，所述獸用卵泡刺激素類(lèi)似物中，根據(jù)α 和β肽鏈間連接序列的長(zhǎng)度、可折疊性、疏水性、電荷效應(yīng)來(lái)設(shè)計(jì)連接序列，其連接序列對(duì) 應(yīng)的核苷酸序列為：SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :5、SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO ：7, SEQ ID NO ：8, SEQ ID NO ：9, SEQ ID NO ：10, SEQ ID NO ：1U SEQ ID NO ： 12、SEQ ID NO : 13、SEQ ID NO : 14、SEQ ID NO : 15、SEQ ID NO : 16、SEQ ID NO : 17、SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO :20 中的任一種。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的獸用卵泡刺激素類(lèi)似物，其特征在于，所述連接序列對(duì)應(yīng)的 核苷酸序列為：SEQ ID N013、SEQ ID N0:14、SEQ ID N0:15、SEQ ID N0:16、SEQ ID N0:17、 SEQ ID NO :18中的任一種。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2任一權(quán)利要求所述的獸用卵泡刺激素類(lèi)似物，其特征在于，所述 獸用卵泡刺激素類(lèi)似物制備方法包括如下步驟： 步驟一、將Genbank上記載的天然羊卵泡刺激素 β和α亞基的基因通過(guò)兩端分別含 BamHI、SpeI酶切點(diǎn)的已知連接序列連接起來(lái)，進(jìn)行全序列合成，其序列為SEQ ID Ν0:1，兩 端分別函Nhe I和EcoR I酶切點(diǎn)，再用pcDNA3. 1 (+)質(zhì)粒進(jìn)行分子克?。唤?jīng)過(guò)雙酶切，依次 用下列19個(gè)序列取代上述的已知連接序列，SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4、SEQ ID NO :5、SEQ ID NO :6、SEQ ID NO :7、SEQ ID NO :8、SEQ ID NO :9、SEQ ID NO: 10、SEQ ID N0:11、SEQ ID N0:12、SEQ ID N0:13、SEQ ID N0:14、SEQ ID N0:15、SEQ ID N0:16、SEQ ID NO :17、SEQ ID NO :18、SEQ ID NO :19、SEQ ID NO :20,以制備 19 種不同的新的表達(dá)質(zhì) 粒；將所得表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染DH5大腸桿菌，經(jīng)氨芐青霉素抗性篩選，提取單克隆菌落質(zhì)粒DNA, 酶切鑒定后進(jìn)行測(cè)序； 步驟二、重組質(zhì)粒DNA序列經(jīng)確認(rèn)之后，進(jìn)行單酶切，使之線性化，線性化后轉(zhuǎn)染CH0細(xì) 胞，經(jīng)G418抗性篩選，單克隆化，通過(guò)western blotting挑選高表達(dá)克??； 步驟三、進(jìn)行逐級(jí)放大傳代培養(yǎng)擴(kuò)增，western blotting檢測(cè)培養(yǎng)液，證實(shí)重組FSH高 表達(dá)，細(xì)胞加防凍劑，分裝液態(tài)氮凍存； 步驟四、復(fù)蘇，經(jīng)含血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，無(wú)血清培養(yǎng)馴化，逐級(jí)放大傳代培養(yǎng)擴(kuò)增，證實(shí)重 組FSH高表達(dá)，作為種子細(xì)胞加防凍劑，分裝液態(tài)氮凍存。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述獸用卵泡刺激素類(lèi)似物，其特征在于，所述獸用卵泡刺激素類(lèi) 似物制備方法步驟一中，目的基因全序列插入pcDNA3. 1所需的雙酶切的內(nèi)切酶為：限制性 內(nèi)切酶Nhe I和EcoR I ;置換連接序列所需的內(nèi)切酶為：BamHI和Spel。
5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述獸用卵泡刺激素類(lèi)似物，其特征在于，所述獸用卵泡刺激素類(lèi) 似物制備方法步驟二中，單酶切的限制性?xún)?nèi)切酶為Pspl406I。
6. 根據(jù)權(quán)利要求3所述獸用卵泡刺激素類(lèi)似物，其特征在于，所述獸用卵泡刺激素類(lèi) 似物制備方法步驟二中，所述G418抗性篩選的濃度為800 μ g/ml。
7. 根據(jù)權(quán)利要求3所述獸用卵泡刺激素類(lèi)似物，其特征在于，所述獸用卵泡刺激素類(lèi) 似物制備方法步驟三中，分別選取25cm2、75cm 2、175cm2、225cm2的細(xì)胞培養(yǎng)瓶進(jìn)行逐級(jí)放大 傳代培養(yǎng)擴(kuò)增。
8. 包含權(quán)利要求1或2任一連接序列的獸用卵巢刺激素類(lèi)似物及含有該獸用卵巢刺激 素類(lèi)似物的藥物在促進(jìn)卵泡發(fā)育方面的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】A61P15/08GK104152457SQ201410331313
【公開(kāi)日】2014年11月19日 申請(qǐng)日期:2014年7月14日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月14日
【發(fā)明者】林俊生, 刁勇 申請(qǐng)人:林靜靜, 刁勇