循環(huán)miR-210在高血壓早期診斷及靶器官損害預(yù)警中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及循環(huán)miR-210的表達(dá)水平在高血壓早期診斷及靶器官損害預(yù)警中的應(yīng)用。本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)在于：本發(fā)明結(jié)果表明：循環(huán)miR-210的表達(dá)隨著血壓的升高而升高，為高血壓的早期診斷提供全新的診斷依據(jù)；循環(huán)miR-210的表達(dá)水平不僅與血壓水平呈正相關(guān)性，并且與靶器官損害程度呈正相關(guān)性；檢測(cè)循環(huán)miR-210的表達(dá)水平不僅有助于高血壓的早期診斷、早期發(fā)現(xiàn)，更重要是對(duì)高血壓靶器官損害的預(yù)警作用，為高血壓的早期診斷及早期預(yù)測(cè)靶器官的損害提供全新的手段，可有效的指導(dǎo)臨床用藥，延緩靶器官的損害，改善患者的生活質(zhì)量。
【專利說明】循環(huán)miR-210在高血壓早期診斷及靶器官損害預(yù)警中的應(yīng) 用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及微小核苷酸的新用途，具體地說，是循環(huán)miR-210的表達(dá)水平在高血 壓早期診斷及靶器官損害預(yù)警中的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 高血壓（hypertens ion )是最常見的慢性復(fù)雜性疾病，指在未服用降壓藥物的情況 下，非同日3次測(cè)量，收縮壓> HOmmHg和/或舒張壓>90mmHg。收縮壓在12(Tl39mmHg之 間和/或舒張壓在8(T89mmHg之間為高血壓前期或正常高值。
[0003] 高血壓是心臟病、腦卒中、終末期腎病及外周血管病等最常見的危險(xiǎn)因素之一。 我國(guó)高血壓防治指南（2010年修訂版）指出：每300萬心血管死亡中至少一半與高血壓有 關(guān)，高血壓患者腦卒中的發(fā)生率為正常血壓者的7倍以上，重度高血壓患者發(fā)生終末期腎 病的危險(xiǎn)性為血壓正常者的11倍以上。且流行病學(xué)調(diào)查顯示：每年我國(guó)將新增高血壓患 者1000萬，每5個(gè)成年人中就有1個(gè)患有高血壓，最新流行病學(xué)調(diào)查顯示美國(guó)約每3個(gè)成 人中就有1個(gè)高血壓患者。高血壓前期是高血壓最重要的"隱患人群"。我國(guó)約59. 31%的 城市人口處于高血壓前期階段，約44. 15%的農(nóng)村人口為高血壓前期，且研究表明：血壓在 12(Tl29/8(T84mmHg和13(Tl39/85?90mmHg的中年人群，10年后轉(zhuǎn)變?yōu)楦哐獕旱膸茁史謩e 有45%和64%。流行病學(xué)研究顯示，與血壓正常人相比，高血壓前期發(fā)生中風(fēng)的幾率增加了 1. 66倍，發(fā)生終末期腎病的幾率增加了 1. 59倍，心血管疾病的發(fā)生率增加了 2. 0倍。因此， 早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷可有效防治高血壓的發(fā)生發(fā)展，更重要的是對(duì)高血壓靶器官損害的預(yù) 警，可有效的指導(dǎo)臨床用藥，延緩靶器官的損害，改善患者的生活質(zhì)量。
[0004] 微小核苷酸(microRNA，miRs)是具有高度保守性的非編碼單鏈RNA，長(zhǎng)度約為 18~25個(gè)核苷酸。據(jù)預(yù)測(cè)，miRs通過與靶基因的結(jié)合調(diào)控著人類基因組中3(Γ50%的基因，參 與生命過程中一系列重要的進(jìn)程，包括早期胚胎發(fā)育、細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化、細(xì)胞凋亡、組織 發(fā)育、調(diào)亡等生理、病理過程，并且通過調(diào)控一組基因參與調(diào)節(jié)機(jī)體多種疾病的發(fā)生發(fā)展， 如腫瘤、心血管疾病、衰老等。研究表明，在疾病發(fā)生的早期，miRs即產(chǎn)生了可逆性的變化， 通過對(duì)miRs的檢測(cè)，可早期預(yù)測(cè)疾病的發(fā)生發(fā)展，從而指導(dǎo)臨床診療。
[0005]


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種miR-210在制備早期診斷高血 壓試劑中的應(yīng)用。
[0007] 本發(fā)明的第二個(gè)目的是，提供一種miR-210在制備早期診斷高血壓的醫(yī)療器械中 的應(yīng)用。
[0008] 本發(fā)明的第三個(gè)目的是，提供一種miR-210在制備預(yù)測(cè)靶器官早期損傷試劑中的 應(yīng)用。
[0009] 本發(fā)明的第四個(gè)目的是，提供一種miR-210在制備預(yù)測(cè)靶器官早期損傷的醫(yī)療器 械中的應(yīng)用。
[0010] 本發(fā)明的第五個(gè)目的是，提供一種miR-210作為藥物靶點(diǎn)在篩選降血壓和靶器官 保護(hù)的藥物中的應(yīng)用。
[0011] 本發(fā)明的第六個(gè)目的是，提供一種miR-210拮抗劑或抑制劑在制備降血壓和靶器 官保護(hù)的藥物中的應(yīng)用。
[0012] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是：miR-210在制備早期診斷高血壓試 劑中的應(yīng)用，所述的早期診斷高血壓試劑通過檢測(cè)循環(huán)中miR-210的表達(dá)水平對(duì)高血壓進(jìn) 行早期診斷。
[0013] 為實(shí)現(xiàn)上述第二個(gè)目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是:miR-210在制備早期診斷高 血壓的醫(yī)療器械中的應(yīng)用，所述的早期診斷高血壓的醫(yī)療器械通過檢測(cè)循環(huán)中miR-210的 表達(dá)水平對(duì)高血壓進(jìn)行早期診斷。
[0014] 為實(shí)現(xiàn)上述第三個(gè)目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是:miR-210在制備預(yù)測(cè)靶器官 早期損傷試劑中的應(yīng)用，所述的預(yù)測(cè)靶器官早期損傷試劑通過檢測(cè)循環(huán)中miR-210的表達(dá) 水平對(duì)靶器官的損害進(jìn)行早期預(yù)測(cè)。
[0015] 為實(shí)現(xiàn)上述第四個(gè)目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是:miR-210在制備預(yù)測(cè)靶器官 早期損傷的醫(yī)療器械中的應(yīng)用，所述的預(yù)測(cè)靶器官早期損傷的醫(yī)療器械通過檢測(cè)循環(huán)中 miR-210的表達(dá)水平對(duì)靶器官的損害進(jìn)行早期預(yù)測(cè)。
[0016] 所述的靶器官為心、腦、腎及外周血管。
[0017] 為實(shí)現(xiàn)上述第五個(gè)目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是:miR-210作為藥物靶點(diǎn)在篩 選降血壓和靶器官保護(hù)的藥物中的應(yīng)用。
[0018] 為實(shí)現(xiàn)上述第六個(gè)目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是:miR-210拮抗劑或抑制劑在 制備降血壓和靶器官保護(hù)的藥物中的應(yīng)用。
[0019] 本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)在于： 1、 本發(fā)明收集血壓正常者、高血壓前期患者、高血壓患者血漿，對(duì)循環(huán)中miR-210的表 達(dá)水平進(jìn)行研究，研究結(jié)果表明：循環(huán)miR-210的表達(dá)隨著血壓的升高而升高，為高血壓的 早期診斷提供全新的診斷依據(jù)； 2、 本發(fā)明采用自發(fā)性高血壓大鼠（SHR)作為高血壓模型，研究探討5周齡、12周齡、20 周齡SHR大鼠血壓變化趨勢(shì)及循環(huán)中miR-210的表達(dá)，并對(duì)12周齡、20周齡SHR大鼠心、 腦、腎靶器官的損害進(jìn)行研究，研究結(jié)果表明：循環(huán)miR-210的表達(dá)水平不僅與血壓水平呈 正相關(guān)性，并且與靶器官損害程度呈正相關(guān)性； 3、 檢測(cè)循環(huán)miR-210的表達(dá)水平不僅有助于高血壓的早期診斷、早期發(fā)現(xiàn)，更重要是 對(duì)高血壓靶器官損害的預(yù)警作用，為高血壓的早期診斷及早期預(yù)測(cè)靶器官的損害提供全新 的手段，可有效的指導(dǎo)臨床用藥，延緩靶器官的損害，改善患者的生活質(zhì)量。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0020] 圖1.血壓正常者、高血壓前期患者、高血壓患者循環(huán)miR-210的表達(dá)情況，與血 壓正常者相比，*/?〈〇· 05。
[0021] 圖2.循環(huán)miR-210的表達(dá)水平，與正常人相比，*P〈0. 05。高血壓前期循環(huán) miR-210表達(dá)vs血壓正常者表達(dá)上調(diào)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(/7〈0. 05)。
[0022] 圖3. SHR大鼠動(dòng)態(tài)收縮壓、舒張壓變化趨勢(shì)，與正常對(duì)照組（WKY)相比，*/?〈0. 05 : 4周齡SHR大鼠作為高血壓動(dòng)物模型，同周齡WKY為正常對(duì)照組。常規(guī)飲食，每周采用尾壓 法測(cè)量大鼠收縮壓、舒張壓。圖3顯示與正常對(duì)照組相比，模型組SHR大鼠收縮壓、舒張壓 雖周齡變化血壓持續(xù)升高。
[0023] 圖4.不同周齡SHR大鼠循環(huán)miR-210的表達(dá)情況，與正常對(duì)照組（WKY)相比， 切〈0. 05 :所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分別于5周齡、12周齡、20周齡時(shí)眼眶取血，檢測(cè)循環(huán)miR-210的表 達(dá)水平。如圖4所示，與正常對(duì)照組相比，5周齡SHR大鼠循環(huán)miR-210的表達(dá)未見明顯差 異，12周齡時(shí)，SHR大鼠循環(huán)miR-210的表達(dá)顯示有上升趨勢(shì)，20周齡SHR大鼠循環(huán)miR-210 的表達(dá)顯著上調(diào)0X0. 05)。
[0024] 圖5. 12周齡WKY、SHR大鼠心肌組織、腎臟組織、腦組織HE染色結(jié)果。12周齡 SHR大鼠心肌組織、腎臟組織已存在病理損傷：12周齡時(shí)，正常對(duì)照組與模型組隨機(jī)選取10 只處死動(dòng)物，解剖心臟、腎臟進(jìn)行病理學(xué)觀察。主要采用石蠟切片，蘇木素-伊紅染色，顯微 鏡下觀察病理形態(tài)的變化。圖5顯示，與正常對(duì)照組心肌組織（a)相比，12周齡模型組SHR 大鼠心肌組織可見炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)，伴有小灶性壞死（b);與正常對(duì)照組腎臟組織（c)相比， 模型組SHR大鼠腎臟組織可見炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)（d);腦組織均未見明顯病理性變化（e、f)。
[0025] 圖6. 20周齡模型組SHR大鼠心肌組織存在顯著的病理損傷：20周齡時(shí)處死動(dòng) 物，解剖心臟進(jìn)行病理學(xué)觀察。主要采用石蠟切片，蘇木素-伊紅染色進(jìn)行病理形態(tài)的觀察 及Masson三色染色觀察纖維化程度。如圖6所示：與正常對(duì)照組（a、c)相比，模型組SHR 大鼠心肌組織出現(xiàn)大量炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)，多發(fā)性灶性壞死，肌纖維間充血水腫（b)。Masson 三色染色結(jié)果顯示，模型組SHR大鼠心肌血管周圍纖維化程度較正常對(duì)照組顯著（d)。
[0026] 圖7. 20周齡模型組SHR大鼠腎臟組織存在顯著的病理損傷：20周齡時(shí)處死動(dòng) 物，解剖腎臟進(jìn)行病理學(xué)觀察。主要采用石蠟切片，蘇木素-伊紅染色進(jìn)行病理形態(tài)的觀察 及Masson三色染色觀察纖維化程度。如圖7所示：與正常對(duì)照組相比（a、d)，模型組SHR大 鼠腎臟組織可見腎間質(zhì)炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)（b)，腎盂粘膜上皮損傷脫落（c)。Masson三色染色 結(jié)果顯示，模型組SHR大鼠腎間質(zhì)纖維化程度較正常對(duì)照組顯著（e)。
[0027] 圖8. 20周齡模型組SHR大鼠腦組織存在顯著的病理損傷：20周齡時(shí)處死動(dòng)物， 解剖腦組織進(jìn)行病理學(xué)觀察。主要采用石蠟切片，蘇木素-伊紅染色進(jìn)行病理形態(tài)的觀察 及Masson三色染色觀察纖維化程度。如圖8所示：與正常對(duì)照組（a、d)相比，模型組SHR 大鼠腦組織可見顱內(nèi)出血（b)，腦膜血管擴(kuò)張充血（c)。Masson三色結(jié)果未見明顯病理性變 化。

【具體實(shí)施方式】
[0028] 下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明提供的【具體實(shí)施方式】作詳細(xì)說明。
[0029] 實(shí)施例1 在本實(shí)施方案中，我們主要采用SYBG染料法RT-PCR的研究手段，探討并明確循環(huán) miR-210的表達(dá)與血壓呈正相關(guān)性。并且，在本實(shí)施方案中，我們采用4周齡SHR大鼠作為 高血壓動(dòng)物模型，研究并明確SHR大鼠循環(huán)miR-210的表達(dá)與血壓水平呈正相關(guān)性，并且與 高血壓所致心、腦、腎靶器官損害程度呈正相關(guān)性。這一研究首次揭示循環(huán)miR-210的表達(dá) 水平不僅反應(yīng)血壓水平，并且可以預(yù)測(cè)高血壓患者是否存在靶器官的損害。
[0030] 一、方法 1.臨床研究樣本收集 用于本發(fā)明的臨床樣本全部來自本院，并且所有研究對(duì)象都認(rèn)真閱讀并簽署知情同 意書，符合倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。研究對(duì)象均為男性，年齡在30-60歲之間。在未使用降壓藥物 的情況下，非同日三次測(cè)量，收縮壓<120mmHg和舒張壓<90mmHg為正常血壓；收縮壓 > HOmmHg和/或舒張壓> 90mmHg為高血壓；收縮壓12CTl39mmHg和/或舒張壓在 8(T89mmHg為高血壓前期。所有研究對(duì)象既往無其他心血管疾病，嚴(yán)重的肝腎功能損害，糖 尿病，肝炎、結(jié)核等傳染性疾病。所有研究對(duì)象均于早8 :00-9:00,空腹，使用K2-EDTA抗凝 管靜脈采集2ml血液。3000轉(zhuǎn)/分，離心10分鐘，取上層血漿用于本研究。
[0031] 2.臨床樣本循環(huán)microRNA的提取 根據(jù)miRNeasyMini Kit (QIAGEN)并且根據(jù)生產(chǎn)廠商提供的標(biāo)準(zhǔn)操作流程進(jìn)行血楽 樣品microRNA抽提，備用。
[0032] 3. SYBG染料法RT-PCR檢測(cè)臨床樣本循環(huán)miR-210的表達(dá) 根據(jù) miScript Reverse Transcription Kit (cat218061, QIAGEN)及其操作規(guī)范進(jìn) 行反轉(zhuǎn)錄 20ul 反應(yīng)體系，采用 SYBR Green PCR Master Mix (cat218073, QIAGEN)，根 據(jù)廠家規(guī)范流程操作，使用Roche LightCycler 480 II進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)：95°C，15min; 94°〇，158,40個(gè)循環(huán)；551：，3〇8;7〇1：，3〇8。
[0033] 4. SHR大鼠收縮壓、舒張壓動(dòng)態(tài)變化情況：以4周齡清潔級(jí)SHR雄性大鼠為高血 壓模型組，平均體重109. 2±0. 8g，以同周齡清潔級(jí)WKY雄性大鼠為正常對(duì)照組，平均體重 109. 4±1.9g。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均購(gòu)自北京維通利華有限公司。常規(guī)攝食及飲水飼養(yǎng)。每周使用 尾壓法測(cè)量大鼠血壓（BP-98A Series, Softron)。
[0034] 5. 5周齡、12周齡、20周齡SHR大鼠循環(huán)miR-210的表達(dá)情況：所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分 別于第5周齡、12周齡、20周齡時(shí)眼眶取血，3000轉(zhuǎn)/分，離心30min，取上層血漿，使用 miRNeasy Mini Kit (QIAGEN)并且根據(jù)生產(chǎn)廠商提供的標(biāo)準(zhǔn)操作流程抽提血楽樣品中 microRNA，并根據(jù)miScript Reverse Transcription Kit (cat218061, QIAGEN)及其操作 規(guī)范進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄 20ul 反應(yīng)體系，采用 SYBR Green PCR Master Mix (cat218073, QIAGEN) ，根據(jù)廠家規(guī)范流程操作，使用Roche LightCycler 480 II進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)：95°C，15min; 94°〇，158,40個(gè)循環(huán)；551：，3〇8;7〇1：，3〇8。
[0035] 6. 12周齡、20周齡SHR大鼠心臟、腎臟、腦組織病理變化情況：12周齡時(shí)，正常對(duì) 照組、模型組隨機(jī)選取10只，處死動(dòng)物，取心、腦、腎，4%的多聚甲醛固定，包埋，石蠟切片， HE染色觀察其病理形態(tài)變化。20周齡時(shí)處死所有動(dòng)物，取心、腦、腎，4%的多聚甲醛固定，包 埋，石蠟切片，HE染色觀察其病理形態(tài)變化及Masson三色染色評(píng)價(jià)纖維化程度。
[0036] 7.統(tǒng)計(jì)分析 計(jì)量資料以均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差表示，符合正態(tài)分布和方差齊性采用單因素方差分析的單 向分類的方差分析（one-way-classification AN0VA)，兩兩比較使用t檢驗(yàn)，如不符合正態(tài) 性和方差齊性則用M、min、max表示，組間比較用Kruslal-Wallis H檢驗(yàn)。
[0037] 二、結(jié)果 1.血壓正常者、高血壓前期患者、高血壓患者臨床基本信息 如表1所示，血壓正常者、高血壓前期患者、高血壓患者平均年齡、BMI、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、 肌酐、尿素、尿酸、空腹血糖、甘油三脂、膽固醇、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白均未見明顯差 異，高血壓前期患者、高血壓患者收縮壓、舒張壓均顯著高于血壓正常者0X0.05)。
[0038] 表1.血壓正常者、高血壓前期患者、高血壓患者臨床基本信息

【權(quán)利要求】
1. miR-210在制備早期診斷高血壓試劑中的應(yīng)用，所述的早期診斷高血壓試劑通過檢 測(cè)循環(huán)中miR-210的表達(dá)水平對(duì)高血壓進(jìn)行早期診斷。 2. miR-210在制備早期診斷高血壓的醫(yī)療器械中的應(yīng)用，所述的早期診斷高血壓的醫(yī) 療器械通過檢測(cè)循環(huán)中miR-210的表達(dá)水平對(duì)高血壓進(jìn)行早期診斷。 3. miR-210在制備預(yù)測(cè)靶器官早期損傷試劑中的應(yīng)用，所述的預(yù)測(cè)靶器官早期損傷試 劑通過檢測(cè)循環(huán)中miR-210的表達(dá)水平對(duì)靶器官的損害進(jìn)行早期預(yù)測(cè)。 4. miR-210在制備預(yù)測(cè)靶器官早期損傷的醫(yī)療器械中的應(yīng)用，所述的預(yù)測(cè)靶器官早期 損傷的醫(yī)療器械通過檢測(cè)循環(huán)中miR-210的表達(dá)水平對(duì)靶器官的損害進(jìn)行早期預(yù)測(cè)。
5. 根據(jù)權(quán)利要求3-4任一所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的靶器官為心、腦、腎和外周 血管。 6. miR-210作為藥物靶點(diǎn)在篩選降血壓和靶器官保護(hù)的藥物中的應(yīng)用。 7. miR-210拮抗劑或抑制劑在制備降血壓和靶器官保護(hù)的藥物中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】A61B5/021GK104306992SQ201410546163
【公開日】2015年1月28日 申請(qǐng)日期:2014年10月16日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月26日
【發(fā)明者】張騰, 陳瑜, 楊琴波, 賈成林, 王培偉, 熊敏琪, 崔金剛, 李黎, 杜宵燁 申請(qǐng)人:上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院