一種人工熊膽粉及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種人工熊膽粉及其制備方法，所述制備方法包括如下步驟：a)將禽畜膽粉用pH＝7～9的緩沖液溶解后進(jìn)行過濾，得到濾渣和濾液；b)將所述濾液加入裝有7α-羥基類固醇脫氫酶、7β-羥基類固醇脫氫酶和輔酶I或輔酶II的反應(yīng)器中進(jìn)行反應(yīng)；c)將反應(yīng)完畢后的反應(yīng)液冷凍干燥后與所述濾渣混合，得到人工熊膽粉。本發(fā)明完全使用天然來源的禽畜膽汁作為人工熊膽制備的原料，不需要再添加其他化學(xué)物質(zhì)，且采用常見動物膽汁，其膽源易采、易得、易加工；通過體外模擬肝腸循環(huán)過程，把禽畜膽汁生物轉(zhuǎn)化為與天然熊膽粉化學(xué)等值的人工熊膽粉，作為天然熊膽替代品，保護(hù)瀕危動物亞洲黑熊，促進(jìn)熊膽產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展。
【專利說明】一種人工熊膽粉及其制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于藥物領(lǐng)域，特別涉及一種人工熊膽粉及其制備方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 熊膽，由熊科動物黑熊或棕熊干燥膽囊膽汁得到，具有清熱、平肝、明目的功效，其 主要成分是?；切苋パ跄懰幔═UDCA)。熊膽是四大名貴動物藥之一，有2000余年的入藥歷 史，有大量的處方都含有熊膽成分。我國每年熊膽粉產(chǎn)量約30噸，仍然滿足不了人類健康 的需求。目前高端熊膽粉供需矛盾的日益突出和低端原料用熊膽粉市場需求的持續(xù)增加， 使得熊膽粉的價格節(jié)節(jié)攀升，市場價格已經(jīng)超過了 5000元/kg。更為嚴(yán)峻的是，國內(nèi)外動物 保護(hù)組織對活熊取膽的長期抵制，特別是最近的"歸真堂"事件再次引起了國際國內(nèi)社會的 廣泛關(guān)注，給國內(nèi)熊膽粉的生產(chǎn)和相關(guān)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展帶來了前所未有的阻力。
[0003] 因此，加快人工熊膽的研發(fā)，促進(jìn)熊膽產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展已經(jīng)提上了議事日程。但與 同屬珍稀動物用藥的麝香和牛黃不同，迄今為止，我國的"人工熊膽"尚未獲得國家藥監(jiān)局 的新藥批準(zhǔn)。
[0004] 根據(jù)目前檢索的專利文獻(xiàn)，涉及人工熊膽的制備方法主要包括以下幾方面：
[0005] (1)中國專利CN201010039550.6(人工熊膽粉的合成新技術(shù)）中，公開了以來源廣 泛，價格低廉的禽膽為基礎(chǔ)原料，經(jīng)物理方法分離去除蛋白質(zhì)、多糖、脂類雜質(zhì)成分，保留與 天然熊膽粉相似的活性成分，再添加一定量熊膽特有的牛磺熊去氧膽酸、氨基酸、微量元素 等。
[0006] ⑵中國專利CN03133771.6(人工熊膽）中，公開了以牛黃熊去氧膽酸鈉、雞膽膏、 膽紅素為原料制備的人工熊膽。
[0007](3)中國專利CN01112258. 7 (人造熊膽粉的制備方法），用禽膽汁在強(qiáng)氧化劑和還 原劑的作用下，將膽汁中的?；蛆Z去氧膽酸轉(zhuǎn)化成牛磺熊去氧膽酸，然后添加膽汁色素、膽 汁酸成分，加工配制成人造熊膽粉。
[0008](4)中國專利CN02134299. 7(人工熊膽及其制造方法），將?；切苋パ跄懰徕c、混 合膽素、多種氨基酸、礦質(zhì)元素、米糠油、膽固醇、卵磷脂等混合通過一定工藝，制成人工熊 膽。
[0009] (5)中國專利CN200910172589. 2 (人工熊膽），利用兔膽、雞膽、鴨膽、鵝膽混合而 成制成人工熊膽。但?；切苋パ跄懰岷窟_(dá)不到藥典標(biāo)準(zhǔn)。
[0010] (6)中國專利CN201210162695. 4(人工熊膽），將禽膽汁中的一種或幾種的混合 物、和牛膽汁、羊膽汁、兔膽汁、狗膽汁中的一種或幾種的混合物與化學(xué)合成的?；切苋パ?膽酸混合而制成人工熊膽。
[0011] (7)中國專利CN201310027917.6( -種人工熊膽粉及其制備方法），以禽膽為原 料，加入牛黃熊去氧膽酸鈉制備而成。
[0012] 目前技術(shù)制備出的人工熊膽仍然存在問題，有的技術(shù)僅僅將不同禽畜膽汁混合在 一起而制成的產(chǎn)品的?；切苋パ跄懰岬暮扛緹o法達(dá)到藥典的標(biāo)準(zhǔn)。很多技術(shù)是在禽畜 膽汁混合物的基礎(chǔ)上添加了一些化學(xué)物質(zhì)比如牛磺熊去氧膽酸、膽色素、氨基酸等以使制 成品的化學(xué)成分與天然熊膽粉的成分相似，但無法真正成為熊膽替代品。
[0013] 所以為了克服現(xiàn)有人工熊膽制備技術(shù)缺陷，有必要提出一種新的人工熊膽制備方 法，在不添加其他化學(xué)成分的前提下，將禽畜膽汁體外模擬生物催化轉(zhuǎn)化，并通過一定工藝 制成人工熊膽，使其成分與天然熊膽化學(xué)等值。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0014] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種人工熊膽粉及其制備方法，將禽畜膽粉通 過體外模擬生物催化轉(zhuǎn)化制取人工熊膽粉，使其成分與天然熊膽化學(xué)等值。
[0015] 本發(fā)明為解決上述技術(shù)問題而采用的技術(shù)方案是提供一種人工熊膽粉的制備方 法，包括如下步驟：a)將禽畜膽粉用pH = 7?9的緩沖液溶解后進(jìn)行過濾，得到濾渣和濾 液；b)將所述濾液加入裝有7 a -羥基類固醇脫氫酶、7 3 -羥基類固醇脫氫酶和輔酶I或輔 酶II的反應(yīng)器中進(jìn)行反應(yīng)；c)將反應(yīng)完畢后的反應(yīng)液冷凍干燥后與所述濾渣混合，得到人 工熊膽粉。
[0016] 上述的人工熊膽粉的制備方法，其中，所述步驟a)中的緩沖液為磷酸鹽緩沖液、 Tris-HCl緩沖液或甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液。
[0017] 上述的人工熊膽粉的制備方法，其中，所述步驟a)包括如下過程：所述禽畜膽粉 用pH = 7?9的緩沖液溶解后，在llOOOg條件下離心lOmin后，一次或多次過濾，得到濾 渣和濾液，所述濾渣冷凍干燥保存。
[0018] 上述的人工熊膽粉的制備方法，其中，所述步驟b)包括如下過程：所述濾液加入 裝有7 a -羥基類固醇脫氫酶、7 0 -羥基類固醇脫氫酶和輔酶I或輔酶II的反應(yīng)器里室溫 反應(yīng)2?8h。
[0019] 上述的人工熊膽粉的制備方法，其中，所述步驟c)包括如下過程：將反應(yīng)完畢后 的反應(yīng)液冷凍干燥48h后與所述濾渣混合均勻，得到人工熊膽粉。
[0020] 上述的人工熊膽粉的制備方法，其中，所述禽畜膽粉為雞膽粉、鴨膽粉、鵝膽粉、牛 膽粉、兔膽粉、狗膽粉、羊膽粉中的一種或多種混合物。
[0021] 上述的人工熊膽粉的制備方法，其中，所述禽畜膽粉的主要成分和質(zhì)量百分比如 下：
[0022] 總膽酸：40?65%
[0023] 氨基酸：4?9%
[0024] 微量元素：0? 5?1% ;
[0025] 其中，所述總膽酸中含有T⑶CA，所述T⑶CA占禽畜膽粉的質(zhì)量百分比為40? 50%。
[0026] 上述的人工熊膽粉的制備方法，其中，所述7a_羥基類固醇脫氫酶、7 0 _羥基類 固醇脫氫酶在反應(yīng)器中以固定化的方式存在。
[0027] 上述的人工熊膽粉的制備方法，其中，所述步驟b)包括如下酶固定化步驟：在1% 的殼聚糖溶液中加入適量醋酸，制得殼聚糖醋酸溶液，將所述殼聚糖醋酸溶液注入到三聚 磷酸鈉溶液中固化，得到殼聚糖球；將所述殼聚糖球放入盛有〇. 125%戊二醛水溶液的容 器中活化，得到活化殼聚糖微球；稱取預(yù)定量的所述活化殼聚糖微球，裝入層析柱，加入適 量的7 a -羥基類固醇脫氫酶和7 0 -羥基類固醇脫氫酶液，采用垂直混合方式使之結(jié)合在 微球上，得到固定化酶。
[0028] 上述的人工熊膽粉的制備方法，其中，在所述固定化酶反應(yīng)器中加入所述步驟a) 中的濾液作為反應(yīng)底物溶液，加入預(yù)定量輔酶I或輔酶II，使輔酶I或輔酶II :TCDCA = 1:2?1:4(摩爾比），在20?30°C下，反應(yīng)2?6h。
[0029] 上述的人工熊膽粉的制備方法，其中，所述的7 a _羥基類固醇脫氫酶和7 0 _羥基 類固醇脫氫酶來源于撒丁島梭菌、脆弱擬桿菌或產(chǎn)氣柯林斯菌。
[0030] 本發(fā)明為解決上述技術(shù)問題而采用的另一技術(shù)方案是提供一種人工熊膽粉，由上 述制備方法制取。
[0031] 上述的人工熊膽粉，其中，所述人工熊膽粉的主要成分和質(zhì)量百分含量如下：
[0032] 總膽酸：40?65%
[0033] 氨基酸：4?9%
[0034] 微量兀素：0? 5?1%;
[0035] 其中，所述總膽酸含有TUDCA和T⑶CA，所述TUDCA占人工熊膽粉的質(zhì)量百分比為 23?33% ;所述T⑶CA占人工熊膽粉的質(zhì)量百分比為12?30%。
[0036] 上述的人工熊膽粉，其中，所述TUDCA和T⑶CA的質(zhì)量比為1?1. 5。
[0037] 本發(fā)明對比現(xiàn)有技術(shù)有如下的有益效果：本發(fā)明提供的人工熊膽粉及其制備方 法，是在研究動物膽汁肝腸循環(huán)過程的基礎(chǔ)上，提出的一種仿生模擬膽汁酸肝腸循環(huán)過程， 以禽畜膽粉為基質(zhì)，集成了多次過濾技術(shù)，酶固定化技術(shù)，酶轉(zhuǎn)化技術(shù)來培育人工熊膽粉， 本發(fā)明方法制取的人工熊膽粉的化學(xué)成分的種類和含量都與天然熊膽粉相似，具有化學(xué)等 值的特點(diǎn)，而且其物理性狀、鑒別特征、顏色氣味、理化性質(zhì)、主要成分含量及比例等方面均 符合《中國藥典》（2015年）中的熊膽粉質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。因此，本發(fā)明技術(shù)具有以下優(yōu)點(diǎn)：
[0038] (1)完全使用天然可食用的禽畜膽汁作為人工熊膽制備的原料，不需要再添加其 他化學(xué)物質(zhì)如牛磺熊去氧膽酸、膽色素、氨基酸、微量元素等。
[0039] (2)本發(fā)明采用了幾種常見動物膽汁，其膽源易采、易得、易加工。
[0040] (3)本發(fā)明采用的多次過濾技術(shù)可以將禽畜膽汁中不溶或難溶成分預(yù)先分離，降 低了對酶的毒害作用，提高了酶的使用壽命。
[0041] (4)本發(fā)明所采用的酶固定化技術(shù)和酶轉(zhuǎn)化技術(shù)，不但使酶可以重復(fù)多次利用，而 且與微生物轉(zhuǎn)化技術(shù)相比，酶固定轉(zhuǎn)化還便于與反應(yīng)系統(tǒng)分離，易于控制。
[0042] (5)通過體外模擬肝腸循環(huán)過程，把禽畜膽汁生物轉(zhuǎn)化為與天然熊膽粉化學(xué)等值 的人工熊膽粉，作為天然熊膽替代品，不僅具有保護(hù)瀕危動物亞洲黑熊的社會意義，還具有 促進(jìn)熊膽產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展經(jīng)濟(jì)價值。

【具體實(shí)施方式】
[0043] 下面將結(jié)合實(shí)施例來詳細(xì)說明本發(fā)明。
[0044] 1、雞、鴨、鵝膽粉的制備
[0045] 雞膽、鴨膽、鵝膽從屠宰場購買得到。首先確定膽的數(shù)量和重量。用75%酒精分別 對雞膽、鴨膽、鵝膽局部進(jìn)行消毒，然后分別剖取膽汁。將取出的膽汁冷凍干燥48h，分別得 到雞膽粉、鴨膽粉、鵝膽粉，放置干燥器中保存?zhèn)溆谩?br> [0046] 2、人工熊膽粉的制備
[0047] (1)禽畜膽粉的處理
[0048] 使用pH 7. 0?9. 0的緩沖液溶解禽畜膽粉（雞膽粉、鴨膽粉、鵝膽粉）配制1L 溶液，超聲充分溶解，所述緩沖液優(yōu)選磷酸鹽緩沖液（PBS)、Tris-HCl緩沖液（三羥甲基氨 基甲烷）或甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液（Gly-NaOH);將禽畜膽粉溶液在llOOOg條件下離心 lOmin后，多次過濾，上清液（濾液）作為禽畜膽粉處理液在4°C保存，備用；濾渣冷凍干燥， 保存?zhèn)溆谩?br> [0049] 所述禽畜膽粉不局限于雞膽粉、鴨膽粉和鵝膽粉，可以為雞膽粉、鴨膽粉、鵝膽粉、 牛膽粉、兔膽粉、狗膽粉、羊膽粉等禽畜膽粉中的一種或多種混合物。較佳地，禽畜膽粉的主 要成分和質(zhì)量百分比如下：
[0050] 總膽酸：40?65%
[0051] 氨基酸：4?9%
[0052] 微量兀素：0? 5?1% ;
[0053] 其中，所述總膽酸中含有T⑶CA，所述T⑶CA占禽畜膽粉的質(zhì)量百分比為40? 50%。
[0054] 除上述主要成分外，禽畜膽粉還含有其他成分，包括：水分、膽色素、維生素、膽固 醇、脂肪酸等。
[0055] (2)固定化酶的制備
[0056] 在1%的殼聚糖（水溶性）溶液中加入適量醋酸，磁力攪拌30min制得殼聚糖 醋酸溶液。將上述溶液用高壓注射泵注入到l〇〇mL3% (w/v)的三聚磷酸鈉溶液中固化 1?2h，得到粒度均勻、形狀規(guī)則的白色的殼聚糖球，然后過濾，用去離子水洗滌多次。將 制備好的殼聚糖球放入盛有〇. 125%戊二醛水溶液的燒杯中，并置于37°C，170g下的搖床 中，活化2?4h，即得活化殼聚糖微球。稱取10g活化好的殼聚糖微球，裝入小型層析柱， 加入適量的7 a-羥基類固醇脫氫酶和7 0-羥基類固醇脫氫酶液，所述7 a-羥基類固醇 脫氫酶（7 a-HSDH)和7 0-羥基類固醇脫氫酶（7 0-HSDH)來自于微生物，如撒丁島梭菌 (Clostridium sardiniense，DSM599/ATCC27555)、脆弱擬桿菌（Bacteroides fragilis ATCC25825)或產(chǎn)氣柯林斯菌（Collinsella aerofaciens ATCC25986)。采用垂直混合方式 結(jié)合4?6h，固定完畢，放出酶液，并用PBS緩沖液沖洗固定后酶柱3?5次。結(jié)果檢測表 明7 a-羥基類固醇脫氫酶和7 0-羥基類固醇脫氫酶的固定率大于90%。
[0057] 禽畜膽汁是混合物，成分復(fù)雜。如果用含有7 a _羥基類固醇脫氫酶、7 0 _羥基類 固醇脫氫酶的微生物來轉(zhuǎn)化禽畜膽汁，存在微生物代謝產(chǎn)物復(fù)雜不易分離的問題；如果單 純用7 a-羥基類固醇脫氫酶、7 0-羥基類固醇脫氫酶來轉(zhuǎn)化禽畜膽汁，禽畜膽汁中的復(fù)雜 成分很容易使酶中毒失活。本實(shí)施例采用的酶固定化技術(shù)和酶轉(zhuǎn)化技術(shù)，不但使酶可以重 復(fù)多次利用，而且與微生物轉(zhuǎn)化技術(shù)相比，酶固定轉(zhuǎn)化還便于與反應(yīng)系統(tǒng)分離，易于控制。
[0058] (3)生物催化轉(zhuǎn)化
[0059] 在固定化酶柱中加入第（1)步制備好的禽畜膽粉溶液處理后的濾液作為反應(yīng)底 物溶液，加入輔酶I或輔酶II，使輔酶1(或輔酶II) :T⑶CA= 1:2?1:4(摩爾比），在20? 30°C下，反應(yīng)2?6h。
[0060] (4)反應(yīng)液的處理
[0061] 將反應(yīng)完畢后的反應(yīng)液冷凍干燥48h，得固體反應(yīng)產(chǎn)物。最后將在第（1)步得到的 濾渣與反應(yīng)產(chǎn)物混合均勻，即得人工熊膽粉。
[0062] 3、樣品中主要膽汁酸的含量測定
[0063] 取適量禽畜膽粉（雞膽粉、鴨膽粉、鵝膽粉、熊膽粉）和本發(fā)明方法制取的人工熊 膽粉分別置于不同的量瓶（50mL)中，加入甲醇適量，超聲（功率300W，頻率25kHz)10min使 之溶解，放冷，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取濾液，即得。取上述溶液各10 U L，注入高效 液相色譜儀，檢測器采用蒸發(fā)光散射檢測器，每個樣品重復(fù)測定3次。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，測得 TUDCA和TCDCA的量，除以初始禽畜膽粉或人工熊膽粉的質(zhì)量即為禽畜膽粉或人工熊膽粉 中TUDCA和T⑶CA所占百分比。對照品T⑶CA和TUDCA來自于中國藥品生物制品檢定所。 檢測結(jié)果如表1所示。
[0064] 表1禽畜膽粉、天然熊膽粉和本發(fā)明制取的人工熊膽粉主要膽汁酸含量（％ )

【權(quán)利要求】
1. 一種人工熊膽粉的制備方法，其特征在于，包括如下步驟： a) 將禽畜膽粉用pH = 7?9的緩沖液溶解后進(jìn)行過濾，得到濾渣和濾液； b) 將所述濾液加入裝有7 a -羥基類固醇脫氫酶、7 3 -羥基類固醇脫氫酶和輔酶I或 輔酶II的反應(yīng)器中進(jìn)行反應(yīng)； c) 將反應(yīng)完畢后的反應(yīng)液冷凍干燥后與所述濾渣混合，得到人工熊膽粉。
2. 如權(quán)利要求1所述的人工熊膽粉的制備方法，其特征在于，所述步驟a)中的緩沖液 為磷酸鹽緩沖液、Tris-HCl緩沖液或甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液。
3. 如權(quán)利要求1所述的人工熊膽粉的制備方法，其特征在于，所述步驟a)包括如下過 程：所述禽畜膽粉用pH = 7?9的緩沖液溶解后，llOOOg條件下離心lOmin后，多次過濾， 得到濾渣和濾液，所述濾渣冷凍干燥保存。
4. 如權(quán)利要求1所述的人工熊膽粉的制備方法，其特征在于，所述步驟b)包括如下過 程：所述濾液加入裝有7 a -羥基類固醇脫氫酶、7 3 -羥基類固醇脫氫酶和輔酶I或輔酶II 的反應(yīng)器里室溫反應(yīng)2?6h。
5. 如權(quán)利要求1所述的人工熊膽粉的制備方法，其特征在于，所述步驟c)包括如下過 程：將反應(yīng)完畢后的反應(yīng)液冷凍干燥48h后與所述濾渣混合均勻，得到人工熊膽粉。
6. 如權(quán)利要求1所述的人工熊膽粉的制備方法，其特征在于，所述禽畜膽粉為雞膽粉、 鴨膽粉、鵝膽粉、牛膽粉、兔膽粉、狗膽粉、羊膽粉中的一種或多種混合物。
7. 如權(quán)利要求1或6所述的人工熊膽粉的制備方法，其特征在于，所述禽畜膽粉的主要 成分和質(zhì)量百分比如下： 總膽酸：40?65% 氨基酸：4?9% 微量兀素：〇? 5?1% 其中，所述總膽酸中含有T⑶CA，所述T⑶CA占禽畜膽粉的質(zhì)量百分比為40?50%。
8. 如權(quán)利要求1所述的人工熊膽粉的制備方法，其特征在于，所述7 a -羥基類固醇脫 氫酶、7 0 -羥基類固醇脫氫酶為和輔酶I或輔酶II在反應(yīng)器中以固定化的方式存在。
9. 如權(quán)利要求8所述的人工熊膽粉的制備方法，其特征在于，所述步驟b)包括如下酶 固定化步驟：在1 %的殼聚糖溶液中加入適量醋酸，制得殼聚糖醋酸溶液，將所述殼聚糖醋 酸溶液注入到三聚磷酸鈉溶液中固化，得到殼聚糖球；將所述殼聚糖球放入盛有0. 125% 戊二醛水溶液的容器中活化，得到活化殼聚糖微球；稱取預(yù)定量的所述活化殼聚糖微球，裝 入層析柱，加入適量的7 a -羥基類固醇脫氫酶和7 3 -羥基類固醇脫氫酶液，采用垂直混合 方式使之與微球結(jié)合，得到固定化酶。
10. 如權(quán)利要求9所述的人工熊膽粉的制備方法，其特征在于，在所述含有固定化酶的 反應(yīng)器中加入所述步驟a)中的濾液作為反應(yīng)底物溶液，加入預(yù)定量輔酶I或輔酶II，使輔 酶I或輔酶II:TCDCA = 1:2?1:4(摩爾比），在20?30°C下，反應(yīng)2?6h。
11. 如權(quán)利要求1所述的人工熊膽粉的制備方法，其特征在于，所述7 a-羥基類固醇脫 氫酶和7 3 -羥基類固醇脫氫酶來源于撒丁島梭菌、脆弱擬桿菌或產(chǎn)氣柯林斯菌。
12. -種人工熊膽粉，其特征在于，由權(quán)利要求1-11任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的制備方法 制取。
13. 如權(quán)利要求12所述的人工熊膽粉，其特征在于，所述人工熊膽粉的主要成分和質(zhì) 量百分含量如下： 總膽酸：40?65% 氨基酸：4?9% 微量兀素：〇? 5?1% ; 其中，所述總膽酸含有TUDCA和T⑶CA，所述TUDCA占人工熊膽粉的質(zhì)量百分比為23? 33% ;所述ra)CA占人工熊膽粉的質(zhì)量百分比為12?30%。
14.如權(quán)利要求13所述的人工熊膽粉，其特征在于，所述TUDCA和TCDCA的質(zhì)量比為 1 ?1. 5。
【文檔編號】A61P27/02GK104382941SQ201410588581
【公開日】2015年3月4日 申請日期:2014年10月28日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月28日
【發(fā)明者】王伯初, 譚君, 祝連彩, 季慶治, 婁德帥, 徐英, 張小利 申請人:上海凱寶藥業(yè)股份有限公司