本發(fā)明關(guān)于一種藥物組合物及其制法，尤其關(guān)于一種以兩親性殼聚糖包覆疏水性藥物及親水性藥物的藥物組合物及其制法。
背景技術(shù)：
：甲殼素(chitin)在自然界中分布很廣，除了存在于甲殼類動(dòng)物(如蝦、蟹、昆蟲的外殼)之外，還包括了微生物界(細(xì)菌的細(xì)胞壁或菇類)及植物界的藻類等。殼聚糖(chitosan)[聚(β-1,4-葡萄糖胺)][poly(β-1,4-glucosamine)]又稱脫乙酰殼多糖，是由甲殼素經(jīng)由不同程度的脫乙?；磻?yīng)而得的非均一性聚合體。殼聚糖為N-乙酰葡萄糖胺與N-葡萄糖胺為結(jié)構(gòu)單元的共聚合體，而N-葡萄糖胺結(jié)構(gòu)單元在聚合體中的含量通常高于60％以上。由于殼聚糖良好的生物相容性(biocompatibility)、無毒性、可生物體內(nèi)分解(溶菌酶)、價(jià)格便宜以及生產(chǎn)原料不虞匱乏等優(yōu)點(diǎn)，使得殼聚糖成為近年來高分子生醫(yī)材料中頗受重視的材料。在已知藥物載體包覆技術(shù)中，皆以多殼層的方式包覆兩種以上的抗癌藥物(例如，親水性藥物及疏水性藥物)以形成納米粒子，或在此納米粒子上連結(jié)具專一性辨識(shí)的抗體/蛋白質(zhì)/勝肽/多糖類，或加入可以顯影的物質(zhì)，使該納米粒子在癌癥治療上具有多功能。然而，以多殼層的方式包覆兩種藥物容易產(chǎn)生藥物滲漏、包覆率不佳、制程繁復(fù)等問題。另外，如欲以高分子自組裝方式包覆藥物，則難以同時(shí)包覆親水性與疏水性的藥物。因此，如何解決已知的納米粒子包覆多種藥物需要多個(gè)步驟及多種環(huán)境的制程問題，提供一個(gè)于單一步驟同時(shí)包覆親水性與疏水性藥物，以制備載藥粒子，實(shí)為一重要課題。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明提供一種藥物組合物的制法，包括：將兩親性殼聚糖衍生物、至少一種疏水性藥物、至少一種親水性藥物分散于溶劑中，以形成混合溶液，其中，該兩親性殼聚糖衍生物經(jīng)復(fù)數(shù)親水基和復(fù)數(shù)疏水基改性，且將該混合溶液的pH調(diào)配為該親水性藥物及該疏水性藥物不沉淀的范圍；以及攪拌該混合溶液至少12小時(shí)后，待該混合溶液的pH介于6至7時(shí)，收取該藥物組合物。本發(fā)明進(jìn)一步提供一種藥物組合物，包括：兩親性殼聚糖衍生物，經(jīng)復(fù)數(shù)親水基和復(fù)數(shù)疏水基改性；至少一種親水性藥物，包埋于該兩親性殼聚糖衍生物中，且該至少一種親水性藥物通過靜電力吸引該復(fù)數(shù)親水基；以及至少一種疏水性藥物，包埋于該兩親性殼聚糖衍生物中，且集中于該復(fù)數(shù)疏水基之間。由上可知，本發(fā)明使用具有高度生物相容性的兩親性殼聚糖高分子作為基底，通過調(diào)整該兩親性殼聚糖高分子自組裝的溶液環(huán)境，達(dá)到同時(shí)包覆一種或多種相同/不同親疏水性的藥物的目的，并且透過交聯(lián)劑將抗體等具有專一性辨識(shí)的標(biāo)靶物質(zhì)修飾在該藥物粒子的表面，或可以在包覆藥物的同時(shí)，包覆具有顯影效果的化合物，使該納米粒子成為有辨識(shí)，顯影及治療等多功能的醫(yī)療平臺(tái)，有效毒殺癌癥細(xì)胞。附圖說明圖1顯示在不同pH(pH7.5、pH8.5、pH9.5、pH10.5及pH11)溶液下的包覆雙藥的納米粒子的順鉑(CDDP)及去氧甲基姜黃素(DMC)包覆率；圖2顯示在不同pH(pH8、pH8.5及pH9)溶液下的包覆雙藥的納米粒子的順鉑及去氧甲基姜黃素包覆率；圖3顯示包覆雙藥的納米粒子的透射電子顯微鏡圖；圖4顯示以自由態(tài)DMC-CDDP組合、CHC/DMC-CDDP納米粒子以及CHC/DMC-CDDP/抗-CD133納米粒子三種不同藥物/載體組合對(duì)細(xì)胞存活率的影響；以及圖5顯示以CHC/DMC-CDDP納米粒子以及CHC/DMC-CDDP/抗-CD133納米粒子對(duì)細(xì)胞存活率的影響，其中，X軸顯示納米粒子中的DMC及CDDP含量。具體實(shí)施方式以下通過特定的具體實(shí)施例說明本發(fā)明的實(shí)施方式，該領(lǐng)域技術(shù)人員可由本說明書所揭示的內(nèi)容輕易地了解本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)及功效。本發(fā)明亦可通過其它不同的實(shí)施方式加以施行或應(yīng)用，本說明書中的各項(xiàng)細(xì)節(jié)亦可基于不同觀點(diǎn)與應(yīng)用，在不悖離本發(fā)明所揭示的精神下賦予不同的修飾與變更。于本說明書中，術(shù)語“一鍋合成法(one-potsynthesis)”意指在一個(gè)自組裝反應(yīng)中，使反應(yīng)物(例如：兩親性殼聚糖)包覆親水性與疏水性藥物，以提高反應(yīng)效率，此法可以避免冗長的分離和純化后處理過程，從而節(jié)省時(shí)間與資源并且提高收率。本發(fā)明提供一種藥物組合物的制法，包括：將兩親性殼聚糖衍生物、至少一種疏水性藥物、至少一種親水性藥物分散于例如水的溶劑中，以形成混合溶液，其中，該兩親性殼聚糖衍生物經(jīng)復(fù)數(shù)親水基和復(fù)數(shù)疏水基改性，且將該混合溶液的pH調(diào)配為該親水性藥物及該疏水性藥物不沉淀的范圍；以及攪拌該混合溶液12小時(shí)后，且待該混合溶液的pH介于6至7時(shí)，收取該藥物組合物。根據(jù)本發(fā)明的一具體實(shí)施例，攪拌該混合溶液12至24小時(shí)。根據(jù)本發(fā)明的一具體實(shí)施例，本發(fā)明制法中，兩親性殼聚糖衍生物的重量百分比范圍為0.01wt％至2wt％，所使用的疏水性藥物的濃度范圍為大于0至3mM，所使用的親水性藥物的濃度范圍為大于0至3mM。殼聚糖的羥基(-OH)及胺基(-NH2)官能團(tuán)是一個(gè)相當(dāng)容易進(jìn)行修飾的區(qū)塊。通常，以殼聚糖為骨架(backbone)，將其羥基端修飾成具有親水性，將其胺基端修飾成具有疏水性。由于修飾改性的技術(shù)已知，故不再贅述其改性方法。于前述制法的一實(shí)施例中，將該混合溶液的pH調(diào)配為該親水性藥物及疏水性藥物不沉淀的范圍。通常，令該混合溶液微堿性，具體而言，通過添加堿性水溶液，亦即添加pH在8以上的堿性水溶液，例如，pH在8.5至12.5，其中，以pH在9至10的范圍為優(yōu)選，以將該混合溶液的pH調(diào)配為該親水性藥物及該疏水性藥物不沉淀的范圍。于前述制法的一實(shí)施例中，先將疏水性藥物加入兩親性殼聚糖衍生物的水溶液，再加入堿性水溶液，最后加入親水性藥物，以將該混合溶液的pH調(diào)配該親水性藥物及該疏水性藥物不沉淀的范圍，其中，該堿性水溶液pH在8.5至12.5的范圍，以pH在9.0至10.0的范圍為優(yōu)選。調(diào)配該混合溶液在堿性下，或添加堿可使該兩親性殼聚糖衍生物結(jié)構(gòu)上的親水基上的H+游離出，而該兩親性殼聚糖衍生物結(jié)構(gòu)上的親水基，例如，COO-會(huì)因靜電力吸引而連結(jié)帶正電荷的藥物，例如親水性藥物順鉑，同時(shí)，因該靜電力吸引親水性藥物，相對(duì)地，則由該兩親性殼聚糖衍生物結(jié)構(gòu)上的疏水基，例如，己酰基團(tuán)包覆如去甲氧基姜黃素的疏水性藥物；最后，根據(jù)此自組裝反應(yīng)形成復(fù)數(shù)粒子形式的藥物組合物。在包覆藥物完成后，整體溶液的pH值為6至7，優(yōu)選為pH6.7，所制備的藥物載體粒子為中性，不須額外進(jìn)行中和反應(yīng)或純化步驟即可使用。根據(jù)本發(fā)明的一具體實(shí)施例，該藥物組合物為復(fù)數(shù)粒子。此外，本發(fā)明的制法還可包括使用交聯(lián)劑將標(biāo)靶物質(zhì)連接于該復(fù)數(shù)粒子表面。在非限制性實(shí)例中，該標(biāo)靶物質(zhì)可選自抗體、勝肽及蛋白質(zhì)所組成組的至少一者。于一具體實(shí)施例中，該交聯(lián)劑可選自下列所組成群組的至少一種化合物：1-乙基-(3-二甲基胺基丙基)碳二酰亞胺(EDC)及羥基琥珀酰亞胺。根據(jù)本發(fā)明制法的一具體實(shí)施例，還包括使顯影化合物分散于該溶液中，而該顯影化合物是熒光化合物或有機(jī)金屬顯影劑。根據(jù)本發(fā)明的一具體實(shí)施例，該兩親性殼聚糖衍生物具有下式(I)結(jié)構(gòu)的復(fù)數(shù)重復(fù)單元：其中，R1各自獨(dú)立為氫、C1至C4烷基或C1至C6羧基，R2各自獨(dú)立為氫、C1至C12烷基、C1至C6羧基或C2至C12?；襪為介于 100至2000間的整數(shù)。其中，具有R1選自C1至C4烷基及C1至C6羧基的重復(fù)單元數(shù)量為20至2000；具有R2選自C1至C12烷基、C1至C6羧基或C2至C12?；闹貜?fù)單元數(shù)量為20至2000。根據(jù)本發(fā)明的一具體實(shí)施例，本發(fā)明所使用的殼聚糖衍生物如下式(II)所示：其中，R3各自獨(dú)立為C5～C11烷基，且x、y、z、n、及p各自獨(dú)立為介于20至2000的整數(shù)。根據(jù)本發(fā)明的一具體實(shí)施例，本發(fā)明所使用的疏水性藥物選自，但不限于，下列所組成組的至少一者：紫杉醇(Taxol)、喜樹堿(Camptothecin)、去甲氧基姜黃素(Demethoxycurcumin，DMC)、托泊替康(Topotecan)、環(huán)胞素A(CyclosporineA)、表柔比星(Epirubicin)及雷帕霉素(Rapamycin)。根據(jù)本發(fā)明的一具體實(shí)施例，本發(fā)明所使用的親水性藥物選自，但不限于，下列所組成組的至少一者：順鉑(Cisplatin，CDDP)、阿霉素(Doxorubicin)、奧沙利鉑(Oxaliplatin)、卡鉑(Carboplatin)、奈達(dá)鉑(Nedaplatin)及賽特鉑(Satrapiatin)。本發(fā)明還提供一種藥物組合物，包括：兩親性殼聚糖衍生物，經(jīng)復(fù)數(shù)親水基和復(fù)數(shù)疏水基改性；至少一種親水性藥物，包埋于該兩親性殼聚糖衍生物中，且該至少一種親水性藥物通過靜電力吸引該復(fù)數(shù)親水基；以及至少一種疏水性藥物，包埋于該兩親性殼聚糖衍生物中，且集中于該復(fù)數(shù)疏水基之間。根據(jù)本發(fā)明的一具體實(shí)施例，該藥物組合物為復(fù)數(shù)粒子。根據(jù)本發(fā)明的另一具體實(shí)施例，該復(fù)數(shù)粒子的粒徑大小為50nm至300nm范 圍內(nèi)。根據(jù)本發(fā)明的一具體實(shí)施例，本發(fā)明的藥物組合物用于抑制癌細(xì)胞生長，其中，用于抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞、卵巢癌細(xì)胞、睪丸癌細(xì)胞、膀胱癌細(xì)胞、子宮頸癌細(xì)胞及肺癌細(xì)胞所組成組的至少一種癌細(xì)胞生長。根據(jù)本發(fā)明的一具體實(shí)施例，本發(fā)明的藥物組合物可使用冷凍干燥、減壓濃縮、真空干燥的方式去除溶劑及水分。本發(fā)明將以下述實(shí)施例來作進(jìn)一步說明，但應(yīng)了解到該等實(shí)施例僅用于例示說明，而不應(yīng)被解釋為限制本發(fā)明的實(shí)施。實(shí)施例實(shí)施例1：制備疏水性己?；揎椉坝H水性羧甲酸修飾的兩親性殼聚糖衍生物首先，于室溫下將5克(g)殼聚糖(Mw＝215,000g/mol，去乙酰度為80至90％，購自Adrich-Sigma)懸浮于異丙醇(50毫升(mL))中，并攪拌30分鐘。將所得的懸浮液緩慢地與氫氧化鈉水溶液(12.5mL)混合得一混合溶液，且通過調(diào)整混合溶液中氫氧化鈉濃度可控制親水性官能團(tuán)的嫁接量。在此，混合溶液中含有13.3M的氫氧化鈉。接著，將此混合溶液與氯乙酸(chloroaceticacid)反應(yīng)，以制得水溶性的親水性羧甲酸修飾的殼聚糖(carboxymethyl-modifiedchitosan)，并干燥。取2g干燥的親水性羧甲酸修飾的殼聚糖溶解于純水(50mL)中，并攪拌24小時(shí)。接著，將所得溶液與甲醇(50mL)混合，再添加0.2M的己酸酐得一反應(yīng)溶液。于室溫下反應(yīng)20小時(shí)后，收集反應(yīng)溶液并以乙醇水溶液(25％v/v)透析24小時(shí)，干燥后收集產(chǎn)物可得到疏水性己?；揎椉坝H水性羧甲酸修飾的兩親性殼聚糖衍生物，其結(jié)構(gòu)如下式(II)所示。同時(shí)，利用1HNMR光譜及N含量的元素分析，以確認(rèn)殼聚糖衍生物中取代基的位置及己酰基嫁接量。于本實(shí)施例中，己?；藿恿繛?3％。實(shí)施例2利用兩親性殼聚糖衍生物包覆藥物稱取0.5毫克(mg)的實(shí)施例1所制備的兩親性殼聚糖粉末，加入200微升(μL)0.1％的去氧甲基姜黃素(溶于甲醇)，利用震蕩器稍做混合后，加入540μL的二次蒸餾水，再加入60μL的pH10.5的二次蒸餾水，最后加入200μL的0.1％的順鉑(cisplatin)(溶于水)，攪拌12個(gè)小時(shí)以制備包覆雙藥(包含去氧甲基姜黃素以及順鉑)的納米粒子。實(shí)施例3包覆雙藥的納米粒子的包覆率測(cè)試將合成好的包覆雙藥的納米粒子放入濃縮離心管中，以轉(zhuǎn)速4000rpm離心30分鐘。(1).順鉑包覆率將濃縮離心管下層清液稀釋20倍，與0.14％鄰苯二胺的二甲基甲酰胺溶液以1：1的比例混合，以100℃加熱30分鐘后，放入-20℃冰箱內(nèi)10分鐘進(jìn)行冷卻，最后將溶液以UV-可見光檢測(cè)波長705nm處的峰值，換算后得知未包覆的順鉑含量，進(jìn)而得知順鉑包覆率。(2).去氧甲基姜黃素包覆率測(cè)試將濃縮離心管濾膜上的納米粒子以二次蒸餾水回溶，將此溶液和甲醇以1：1的比例混合，利用HPLC進(jìn)行分析。在流速1mL/min下利用C18做為固定相，乙腈和0.3％FA(50：50,v/v)做為流動(dòng)相，在波長為425nm的條件下進(jìn)行檢測(cè)，并且換算去氧甲基姜黃素的濃度來得知包藥率。如圖1所示，其結(jié)果顯示當(dāng)混合有兩親性殼聚糖衍生物、親水性 藥物及該疏水性藥物的水溶液的pH值越高，增加順鉑的包覆率，但去氧甲基姜黃素的包覆率則隨pH值越高，包覆率則降低。由于去氧甲基姜黃素在堿性環(huán)境下容易失去藥物活性而沉淀，因此，將水溶液的pH值調(diào)配在pH8.0至9.0之間為佳。如圖2所示，其結(jié)果顯示當(dāng)水溶液的pH值在9.0時(shí)有最佳的雙藥包覆率，并且測(cè)量在包覆完成后整個(gè)溶液的pH值為6.7。實(shí)施例4將抗體連結(jié)于包覆雙藥的納米粒子將適量抗體(抗-CD133)與0.01％50μL交聯(lián)劑(EDC)加入上述包覆雙藥的納米粒子溶液中，攪拌五小時(shí)，將抗體連結(jié)至上述包覆雙藥的納米粒子表面上，所制備完成的包覆雙藥的納米粒子的直徑為190nm。如下表1所示為兩親性殼聚糖納米粒子(以下簡(jiǎn)稱CHC)、包覆雙藥的納米粒子(以下簡(jiǎn)稱CHC/DMC-CDDP)以及連接抗體的包覆雙藥的納米粒子(以下簡(jiǎn)稱CHC/DMC-CDDP-抗體)的直徑大小以及表面電位(zetapotential)。如圖3所示，進(jìn)一步以透射電子顯微鏡觀察連接抗體的包覆雙藥的納米粒子。表1本發(fā)明的各種納米粒子的直徑及表面電位樣品名稱直徑(nm)表面電位(mV)CHC55±2.3-22.5±0.91CHC/DMC-CDDP140±7.3-13.0±3.5CHC/DMC-CDDP-抗體190±6.1-5.1±0.6實(shí)施例5以本發(fā)明的CHC/DMC-CDDP以及CHC/DMC-CDDP-抗體的納米粒子毒殺癌細(xì)胞的細(xì)胞存活率試驗(yàn)于24孔盤上培養(yǎng)肺癌干細(xì)胞(A549-ON)，每孔有1×105個(gè)細(xì)胞，并將配置好不同劑量的自由態(tài)DMC-CDDP組合(freedrug)(圖4中由左至右的劑量為：3.25-75g/mL、7.5-150g/mL、7.5-300g/mL、15-300g/mL及20-600g/mL)、CHC/DMC-CDDP納米粒子(圖4中由左至右的劑量為：1.25-95g/mL、3-125g/mL、5-200g/mL、6-250g/mL及9-265g/mL)及CHC/DMC-CDDP/抗-CD133納米粒子(圖4中由左至右的劑量為： 1.25-95g/mL、3-125g/mL、5-200g/mL、6-250g/mL及9-265g/mL)給予肺癌干細(xì)胞并培養(yǎng)24小時(shí)后，以3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基溴化四氮唑(3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromide)，以下簡(jiǎn)稱MTT)分析細(xì)胞存活率。圖4為三種不同藥物/載體組合對(duì)細(xì)胞存活率的影響，如圖4所示，Y軸為組合指數(shù)(combinationindex，以下簡(jiǎn)稱CI)，當(dāng)該CI值小于1時(shí)，代表有協(xié)同效應(yīng)；Fa代表細(xì)胞死亡率，當(dāng)數(shù)值越接近1時(shí)代表細(xì)胞死亡率越高，可以達(dá)到更好的毒殺癌細(xì)胞效果。由圖4可知，沒有經(jīng)過CHC包覆的藥物(即自由態(tài)DMC-CDDP組合)并沒有協(xié)同效應(yīng)，無法同時(shí)使用雙藥來提升毒殺癌細(xì)胞的效果；再經(jīng)由CHC包覆的雙藥，明顯在部分劑量(CHC/DMC-CDDP:6-250g/mL及9-265g/mL；CHC/DMC-CDDP/抗-CD133:5-200g/mL、6-250g/mL及9-265g/mL)上有雙藥協(xié)同效應(yīng)出現(xiàn)，并且提供好的毒殺癌細(xì)胞效果。圖5為以CHC/DMC-CDDP納米粒子以及CHC/DMC-CDDP/抗-CD133納米粒子對(duì)細(xì)胞存活率的影響，即，以CHC包覆雙藥有接上/未接上抗體納米粒子毒殺肺癌干細(xì)胞的效果；由圖5可知，CHC/DMC-CDDP/抗-CD133納米粒子(嫁接上抗體)可以有效地降低肺癌干細(xì)胞存活率。上述實(shí)施例僅例示性說明本發(fā)明的原理及其功效，而非用于限制本發(fā)明。任何該領(lǐng)域技術(shù)人員均可在不違背本發(fā)明的精神及范疇下，對(duì)上述實(shí)施例進(jìn)行修飾與改變。因此，舉凡該領(lǐng)域技術(shù)人員在未脫離本發(fā)明所揭示的精神與技術(shù)原理下所完成的一切等效修飾或改變，仍應(yīng)由權(quán)利要求書所涵蓋。當(dāng)前第1頁1 2 3