本發(fā)明屬藥物制劑領(lǐng)域，具體涉及一種能促進(jìn)蛋白質(zhì)或多肽口服吸收的酵母細(xì)胞壁微粒制劑及其制備方法。

背景技術(shù)：

近年來(lái)，越來(lái)越多的蛋白質(zhì)多肽藥物進(jìn)入臨床實(shí)驗(yàn)或臨床治療階段，其主要給藥方式為注射途徑，但實(shí)踐顯示，由于大多數(shù)蛋白質(zhì)和多肽藥物體內(nèi)生物半衰期短，需要頻繁給藥，病人順應(yīng)性極差；所以開(kāi)發(fā)非注射途徑的蛋白質(zhì)多肽制劑成為目前藥劑學(xué)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)，也是有關(guān)領(lǐng)域需要重點(diǎn)突破的課題。臨床實(shí)踐表明，口服給藥是最方便也最為安全的臨床用藥途徑，但是蛋白質(zhì)和多肽藥物存在以下幾個(gè)問(wèn)題，導(dǎo)致口服生物利用度很低，無(wú)法起到較好的治療效果：1.胃液中不穩(wěn)定，易被胃蛋白酶快速降解；2.可受腸道內(nèi)的蛋白酶的降解；3.蛋白質(zhì)和多肽藥物親水性強(qiáng)，細(xì)胞膜通透性差；4.蛋白質(zhì)分子量大，是導(dǎo)致膜通透性差的一個(gè)原因。目前提高蛋白質(zhì)多肽藥物口服吸收的研究已非常廣泛，主要包括以下幾種方法：1.采用滲透促進(jìn)和蛋白酶抑制劑可在一定程度上提高其生物利用度，但是由于其存在較為嚴(yán)重的毒性，其發(fā)展前景尚不可預(yù)知；2.采用轉(zhuǎn)鐵蛋白(tf)、細(xì)胞穿膜肽tat等修飾提高細(xì)胞的通透性；3.采用微粒給藥系統(tǒng)提高胰島素的口服生物利用度是目前研究最為熱門的方面，微粒給藥系統(tǒng)可以在一定程度上保護(hù)藥物免受酶的降解，同時(shí)可以提高藥物跨膜的能力，目前主要的有納米粒、脂質(zhì)體、微乳以及復(fù)乳等；但是目前的微粒給藥系統(tǒng)仍然不能顯著的提高其生物利用度，主要原因在于粒子無(wú)法大量跨過(guò)腸細(xì)胞膜而轉(zhuǎn)運(yùn)藥物。

研究顯示，腸道內(nèi)存在一種特殊的結(jié)構(gòu)-派爾氏結(jié)(peyer’spatch)，派爾氏結(jié)可以吞噬較大的顆粒，并將其運(yùn)送至淋巴循環(huán)，從而進(jìn)入體循環(huán)而發(fā)揮藥物療效；而酵母細(xì)胞壁顆粒中富含β-葡聚糖，可特異性的靶向于m細(xì)胞，從而增加其轉(zhuǎn)運(yùn)效果。本申請(qǐng)的發(fā)明人基于上述現(xiàn)有技術(shù)的依據(jù)，以及酵母細(xì)胞壁價(jià)廉易 得，可直接使用面包酵母制得，且具有較好的安全性，適合作為藥物給藥系統(tǒng)的材料的優(yōu)勢(shì)，擬提供一種促進(jìn)蛋白多肽藥物口服吸收的酵母細(xì)胞壁微粒制劑，借助酵母細(xì)胞壁具有較大的空腔，和具有很高的載藥量的特點(diǎn)，通過(guò)增加m細(xì)胞的靶向作用增加體內(nèi)的生物利用度。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供一種促進(jìn)蛋白多肽藥物口服吸收的酵母細(xì)胞壁微粒制劑，通過(guò)酵母細(xì)胞壁顆粒載蛋白質(zhì)或多肽提高其口服生物利用度。本發(fā)明制劑生物利用度且效果可維持較長(zhǎng)的時(shí)間，使用方便，重現(xiàn)性好。

基于現(xiàn)有技術(shù)中，由于蛋白質(zhì)多肽藥物在胃腸道中不穩(wěn)定，易受到胃腸道中各種蛋白酶的降解作用，且跨膜能力很差，導(dǎo)致生物利用度極低，酵母細(xì)胞壁顆?？芍苯影邢蛴谂蔂柺辖Y(jié)的m細(xì)胞，而m細(xì)胞具有很強(qiáng)的轉(zhuǎn)運(yùn)微粒的能力，且藥物包裹在酵母細(xì)胞壁顆粒中也可避開(kāi)胃腸道中蛋白酶的破壞，從而可以增加其在胃腸道中的穩(wěn)定性；但是如果將蛋白質(zhì)或多肽藥物直接包載在酵母細(xì)胞壁微粒中，在胃腸道中極易從細(xì)胞壁孔道中泄露的缺陷，本發(fā)明通過(guò)對(duì)其在酵母細(xì)胞壁微粒內(nèi)部進(jìn)行凝膠化作用而使蛋白質(zhì)或多肽藥物能保留在內(nèi)部，從而通過(guò)m細(xì)胞大量轉(zhuǎn)運(yùn)酵母細(xì)胞壁顆粒，而增加蛋白質(zhì)多肽進(jìn)入體循環(huán)內(nèi)的濃度，進(jìn)而增加蛋白多肽藥物的口服生物利用度。

本發(fā)明提供如下技術(shù)方案解決現(xiàn)有技術(shù)存在的問(wèn)題：

本發(fā)明的一種促進(jìn)蛋白質(zhì)和多肽藥物口服吸收的酵母細(xì)胞壁微粒制劑，其特征在于，由蛋白質(zhì)或多肽藥物、藥物輔料和酵母細(xì)胞壁顆粒組成，所述的蛋白質(zhì)或多肽藥物或與輔料共同被包裹于酵母細(xì)胞壁中，在一定溫度下實(shí)現(xiàn)內(nèi)部凝膠化。

本發(fā)明中，所述的酵母細(xì)胞壁顆粒通過(guò)面包酵母制得。

本發(fā)明中，所述的輔料選自泊洛沙姆、海藻酸鈉或殼聚糖。

本發(fā)明中，所述的泊洛沙姆是泊洛沙姆407或188，或二者的混合物。

本發(fā)明中，所述的泊洛沙姆407的濃度為10-50％，泊洛沙姆188的濃度為 10-50％，泊洛沙姆407與188的比例為5:1-4。

本發(fā)明中，所述的海藻酸鈉與鈣離子或殼聚糖配合使用，其中海藻酸鈉與鈣離子的比例為1:0.1-5，海藻酸鈉與殼聚糖的比例為1:0.1-5。

本發(fā)明中，所述的蛋白質(zhì)或多肽藥物為其水溶液，ph為1.0-8.0，濃度為0.1-10mg/ml。

本發(fā)明中，所述的含蛋白質(zhì)或多肽藥物的酵母細(xì)胞壁微粒制劑通過(guò)兩步法制備，其包括，首先制備蛋白質(zhì)或多肽的水溶液，然后將酵母細(xì)胞壁粉末分散在該溶液中，所述蛋白質(zhì)或多肽擴(kuò)散進(jìn)入酵母細(xì)胞壁內(nèi)部，最后通過(guò)調(diào)節(jié)ph至蛋白質(zhì)多肽的等電點(diǎn)附近，將其沉淀，離心，洗滌，加入輔料溶液，進(jìn)行內(nèi)部凝膠化。

所述的制備方法中，當(dāng)輔料使用海藻酸鈉時(shí)，需在除掉外相蛋白質(zhì)或多肽以及輔料后，再加入鈣離子或殼聚糖對(duì)內(nèi)部海藻酸鈉進(jìn)行交聯(lián)；當(dāng)輔料使用泊洛沙姆時(shí)，需在低溫下操作使其為溶液態(tài)，在除掉外相蛋白質(zhì)或多肽以及輔料后，升高溫度使其內(nèi)部凝膠化。

本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，首先以胰島素為模型藥物，制備載胰島素的內(nèi)部凝膠化酵母細(xì)胞壁微粒，并進(jìn)一步對(duì)其進(jìn)行體內(nèi)外評(píng)價(jià)。

其中，提供了一種促進(jìn)胰島素口服生物利用度的酵母細(xì)胞壁微粒，其由胰島素、輔料和酵母細(xì)胞壁顆粒組成，其中活性成分胰島素被包載于酵母細(xì)胞壁內(nèi)部，所述輔料為可凝膠化的材料；

所述的胰島素的濃度優(yōu)選為0.1-100mg/ml；

所述的酵母細(xì)胞壁微粒由面包酵母制得，面包酵母通過(guò)酸堿處理，干燥得酵母細(xì)胞壁微粒。

所述的凝膠化材料包括泊洛沙姆188、407以及海藻酸鈉中的一種或幾種。

本發(fā)明中，通過(guò)下述方法制備所述的載胰島素酵母細(xì)胞壁微粒：

稱取一定量的酵母細(xì)胞壁粉末分散在胰島素溶液中，渦旋混合均勻，用1m的鹽酸調(diào)節(jié)ph至2，然后在4℃條件下200rpm磁力攪拌2h，用1m的氫氧化鈉調(diào)節(jié)ph至5.6(胰島素的等電點(diǎn)附近)，使胰島素大量析出沉淀，使孵育在 酵母細(xì)胞壁內(nèi)腔和孔道中的胰島素沉積在這些腔道內(nèi)部；重復(fù)上述操作3次，通過(guò)反復(fù)調(diào)節(jié)ph增加在酵母細(xì)胞壁內(nèi)部沉積的胰島素的量，提高載藥量；然后2000g離心10min，棄上清的胰島素，加入特定濃度的ph7.0的凝膠化材料溶液，在室溫條件下孵育4h；最后2000g離心10min收集沉淀，改變條件實(shí)現(xiàn)內(nèi)部凝膠化，在濾紙上用熱水洗去殘留的輔料溶液和胰島素。

所述的凝膠化材料選自泊洛沙姆407、188以及海藻酸鈉中的一種或幾種，其中優(yōu)選泊洛沙姆407.

本發(fā)明制得的載胰島素的內(nèi)部凝膠化的酵母細(xì)胞壁微粒(以下簡(jiǎn)稱為p-ins-gms)，用馬爾文測(cè)定粒徑和電位，用掃描電子顯微鏡觀察其形態(tài)如圖1所示。

本發(fā)明通過(guò)體外穩(wěn)定性和體內(nèi)降糖實(shí)驗(yàn)的比較，結(jié)果表明，本發(fā)明通過(guò)酵母細(xì)胞壁微粒包載胰島素，并對(duì)其進(jìn)行內(nèi)部凝膠化，提高了胰島素在胃腸道內(nèi)的穩(wěn)定性，并且通過(guò)靶向m細(xì)胞增加了胰島素的口服生物利用度。

附圖說(shuō)明

圖1顯示了：空白酵母細(xì)胞壁微粒(gms)(a)和它的橫切面(b)，胰島素凝膠化酵母細(xì)胞壁微粒(p-ins-gms)(c)以及橫切面(d)的掃描電鏡圖；空白gms和p-ins-gms粒徑圖(e)。

圖2.為凝膠化(ins-gms)和凝膠化(p-ins-gms)酵母細(xì)胞壁微粒在不含酶的sgf(a)和sif(b)中的釋放，

其中顯示了胰島素在含酶的sgf(c)和sif(d)中的降解曲線。

圖3.為口服給予不同胰島素制劑在正常大鼠(a)和糖尿病大鼠(b)體內(nèi)的降血糖曲線(n＝4)，其中顯示，正常大鼠和糖尿病大鼠降糖曲線上面積與劑量的相關(guān)性(c)。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1

制備酵母細(xì)胞壁顆粒粉末：取面包酵母100g，加入1lnaoh(1m)溶液，于80℃恒溫水浴鍋內(nèi)孵育1h，50rpm慢速攪拌。然后2000g離心10min，收集沉淀，將沉淀重新分散于1l純水中，用2m的鹽酸調(diào)節(jié)ph至4.5左右，50rpm慢速攪拌下于55℃恒溫水浴鍋中孵育1h，再次2000g離心10min收集沉淀，依次分別用1l純水洗一次，200ml異丙醇洗四次，200ml丙酮洗兩次，最后收集沉淀，真空干燥，稱量計(jì)算產(chǎn)率；

包載胰島素：稱取1g制備的酵母細(xì)胞顆粒發(fā)(gms)粉末分散在5ml胰島素(ins)溶液中(10mg/ml)，渦旋混合均勻，用1m的鹽酸調(diào)節(jié)ph至2，然后在4℃條件下200rpm磁力攪拌2h，用1m的氫氧化鈉調(diào)節(jié)ph至5.6(ins的等電點(diǎn)附近)，ins大量析出沉淀，使孵育在gms內(nèi)腔和孔道中的ins沉積在這些腔道內(nèi)部；重復(fù)上述操作3次，通過(guò)反復(fù)調(diào)節(jié)ph增加在gms內(nèi)部沉積的ins的量，從而提高載藥量；然后2000g離心10min，棄上清的ins，加入特定濃度的ph7.0的poloxamer溶液，在室溫條件下孵育4h，最后2000g離心10min收集沉淀，升溫到tgel以上使gms內(nèi)部的poloxamer形成凝膠態(tài)，在濾紙上用熱水洗去殘留的poloxamer和ins；

取制備的載胰島素的內(nèi)部凝膠化的酵母細(xì)胞壁微粒(以下簡(jiǎn)稱為p-ins-gms)，用馬爾文測(cè)定粒徑和電位，用掃描電子顯微鏡觀察其形態(tài)如圖1所示。

實(shí)施例2載胰島素的內(nèi)部凝膠化的酵母細(xì)胞壁微粒的體外釋放和抗酶降解實(shí)驗(yàn)

體外釋放實(shí)驗(yàn)：準(zhǔn)備10ml不含酶的人工胃液或者人工腸液，在恒溫水浴振蕩器中預(yù)熱到37℃，取適量?jī)龈傻囊葝u素酵母細(xì)胞壁微粒(p-ins-gms)，加入到不含酶的人工胃液或者人工腸液中，在第0.25、0.5、0.75、1、1.5和2h取樣200μl并補(bǔ)充等量的預(yù)熱的不含酶的人工胃液或者人工腸液，樣品8000g離心后過(guò)0.25μm濾膜后進(jìn)樣，計(jì)算釋放的ins含量，其釋放曲線如見(jiàn)圖2所示；

抗酶降解實(shí)驗(yàn)：準(zhǔn)備10ml的人工胃液或者人工腸液，在恒溫水浴振蕩器中預(yù)熱到37℃，取適量?jī)龈傻膒-ins-gms，加入到人工胃液(sgf)或者人工腸液(sif)中，取樣時(shí)間點(diǎn)為0.5、1、2h(sgf)以及0.5、1、4h(sif)，其余操作同前，取出的樣品8000g離心后棄上清液，用純水洗一次并離心，取沉淀用β-葡聚糖酶消化30min，渦旋后8000g離心取上清液，稀釋至合適的濃度并過(guò)0.25μm濾膜后進(jìn)樣，計(jì)算剩余的ins含量，其穩(wěn)定性結(jié)果如圖2所示。

實(shí)施例3載胰島素的內(nèi)部凝膠化的酵母細(xì)胞壁微粒的口服降血糖實(shí)驗(yàn)

正常大鼠以及糖尿病大鼠，分別隨機(jī)分為6組，每組4只，實(shí)驗(yàn)前禁食12h，可自由飲水，6組制劑分別為p-ins-gms(以胰島素計(jì)量分別為10、30和50iu/kg)，未固化的酵母細(xì)胞壁微粒ins-gms(30iu/kg)，空白的內(nèi)部泊洛沙姆凝膠化的酵母細(xì)胞壁微粒p-gms以及ins溶液組(2iu/kg)，其中，除ins溶液組為皮下注射給藥外，其余制劑組均為灌胃給藥；

各組制劑在給藥之后特點(diǎn)時(shí)間點(diǎn)，于大鼠尾靜脈取血，滴加一滴在血糖儀試紙的感應(yīng)區(qū)測(cè)定即時(shí)血糖值，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)測(cè)3次取平均值，測(cè)定的血糖值繪制成血糖-時(shí)間曲線；結(jié)果顯示，正常大鼠及糖尿病大鼠體內(nèi)血糖-時(shí)間曲線如圖3所示。