本發(fā)明涉及化合物的新應(yīng)用，特別涉及RVX-208(Apabetalone，RVX-000222)作為HIV-1潛伏感染逆轉(zhuǎn)劑的應(yīng)用。

技術(shù)背景

艾滋病是由人免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HIV)引起的人類最嚴(yán)重的單一病因性疾病，以全身免疫系統(tǒng)嚴(yán)重?fù)p害為特征。截至2014年，全球感染HIV人數(shù)已達(dá)到3690萬，嚴(yán)重威脅著人類的健康和生存。1996年，高效抗逆轉(zhuǎn)錄病毒療法(Highly active antiretroviral therapy，HAART)或稱抗逆轉(zhuǎn)錄病毒聯(lián)合療法(Combination antiretroviral therapy，cART)的成功應(yīng)用將艾滋病從一種致死性疾病轉(zhuǎn)變?yōu)橐环N慢性可控性疾病，極大地延長了艾滋病人的生存時(shí)間。截至2015年6月，全球已有1580萬人接受cART治療。然而，cART發(fā)展至今，也有其不可克服的局限性，如長期服藥的毒副作用、HIV易產(chǎn)生抗藥性及患者高額的治療費(fèi)用等。更為重要的是，該療法并不能徹底治愈病人，一旦停藥，患者體內(nèi)潛伏的HIV會(huì)迅速反彈，造成再次感染，因此cART需要終身服藥，無法實(shí)現(xiàn)“斬草除根”的夢想。

研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)接受cART治療的患者血漿中病毒滴度已經(jīng)降低到檢出限以下時(shí)，患者體內(nèi)仍然存在著低水平的病毒復(fù)制，HIV不能被徹底清除的主要原因是患者體內(nèi)HIV潛伏感染細(xì)胞所構(gòu)成的病毒潛伏儲(chǔ)存庫的存在。HIV潛伏儲(chǔ)存庫主要由一群HIV潛伏感染的靜止期記憶性CD4⁺T細(xì)胞構(gòu)成，其主要特征為：1)整合后潛伏，即整合在宿主免疫細(xì)胞基因組中的HIV前病毒發(fā)生基因沉默，從而躲過了宿主免疫系統(tǒng)的破壞和cART藥物的攻擊，一旦條件適合，病毒又將恢復(fù)其感染力；2)感染個(gè)體攜帶潛伏感染細(xì)胞數(shù)量雖少，但其衰減率極低，以至于僅靠cART療法將其徹底清除是不可能的。因此，HIV潛伏病毒儲(chǔ)存庫的存在是目前臨床治療不能徹底清除HIV的巨大障礙。

那么，HIV病毒是如何潛伏在患者體內(nèi)，其又是如何躲開抗病毒藥物的攻擊的呢？HIV由其包膜蛋白、宿主靶細(xì)胞上的CD4受體及趨化因子受體CCR5或CXCR4介導(dǎo)進(jìn)入宿主細(xì)胞后，就開始了病毒的復(fù)制周期。首先，經(jīng)過膜融合進(jìn)入到靶細(xì)胞內(nèi)的HIV前-整合復(fù)合物經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄酶作用生成線狀及環(huán)狀兩種雙鏈互補(bǔ)DNA；隨后，線狀雙鏈DNA和病毒整合酶進(jìn)入細(xì)胞核，進(jìn)而整合入宿主免疫細(xì)胞的基因組中；整合的HIV前病毒DNA，不僅在感染細(xì)胞中被作為病毒基因轉(zhuǎn)錄的模板，也是HIV潛伏整合的關(guān)鍵。

由于HIV的基因組與宿主記憶性CD4⁺T細(xì)胞的基因組整合到一起，因此如何靶向清除宿主體內(nèi)免疫細(xì)胞中潛伏感染的HIV前病毒，防止疾病反彈，成為研究者極為頭痛的難點(diǎn)之一。另外，HIV潛伏儲(chǔ)存庫可以逃脫免疫系統(tǒng)的監(jiān)控，且cART也無法對已整合的HIV前病毒起作用，這就成為從感染者體內(nèi)徹底根除HIV的最大障礙。

近年來，研究者普遍認(rèn)為采用“引蛇出洞”(Shock and Kill)的方法，即先使用HIV潛伏感染逆轉(zhuǎn)劑(latency reversing agents,LRAs)誘導(dǎo)靜息記憶性CD4⁺T細(xì)胞活化，釋放HIV，之后再聯(lián)合cART將HIV病毒一網(wǎng)打盡。同時(shí)，隨著靜止期CD4⁺T細(xì)胞的活化，由細(xì)胞病變效應(yīng)和/或其誘導(dǎo)的天然或獲得性HIV特異性免疫反應(yīng)，也能使得該群細(xì)胞的半衰期顯著縮短，進(jìn)而迅速死亡，從而實(shí)現(xiàn)HIV“功能性”治愈！HIV“功能性”治愈，即HIV病毒在檢測限以下，且停用抗病毒藥物，患者也不會(huì)出現(xiàn)疾病反彈。

目前，處于臨床研究階段的潛伏感染逆轉(zhuǎn)劑LRAs主要有以下六大類，包括：1)正性轉(zhuǎn)錄延伸因子b(Positive transcription elongation factor b,P-TEFb)激活劑：以溴結(jié)構(gòu)域及其外域(Bromodomain extraterminal,BET)抑制劑為主，如JQ1，1-BET151等，其可增強(qiáng)Tat和PTEF-b的結(jié)合進(jìn)而激活HIV潛伏感染病毒；2)組蛋白去乙?；?Histone deacetylase,HDAC)抑制劑：Vorinostat(SAHA)、Givinostat(ITF2357)和Panobinostat等，其是染色質(zhì)的解旋劑，促進(jìn)病毒轉(zhuǎn)錄因子與HDAC一起結(jié)合到HIV長末端重復(fù)序列(LTR)，并通過促進(jìn)組蛋白上的賴氨酸殘基去乙?；M(jìn)而抑制前病毒轉(zhuǎn)錄；3)蛋白激酶C(Protein kinase C,PKC)激活劑：Prostratin、大環(huán)內(nèi)脂類蘚苔抑制素(bryostatin-1)等，其對潛伏HIV基因的轉(zhuǎn)錄起始產(chǎn)生非常關(guān)鍵作用；4)DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶(DNA methyltransferase,DNMT)抑制劑：Decitabine，可抑制前病毒的DNA甲基化過程；5)組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶(Histone methyltransferase,HMT)抑制劑：EPZ5676等，抑制細(xì)胞HMT的活性，從而抑制前病毒DNA的甲基化；6)細(xì)胞因子免疫功能調(diào)節(jié)劑：如IL-2、IL-7、IL-15和GM-CSF等。

但遺憾的是，目前上述候選LRAs對于HIV潛伏感染的治療還僅處于臨床試驗(yàn)階段，尚未取得突破性的進(jìn)展，它們或多或少存在著一定的缺陷，限制了它們在臨床上的廣泛應(yīng)用。主要問題如下：1)某些表觀基因治療藥物在激活病毒的同時(shí)，也可引起諸多副作用，如HDAC抑制劑的機(jī)制存在較多爭議，其在臨床中也報(bào)道有惡心、嘔吐、血液系統(tǒng)異常及影響基因正常功能等；2)PKC激活劑可影響正常T細(xì)胞活化的轉(zhuǎn)錄因子信號(hào)通路，從而導(dǎo)致導(dǎo)致潛伏病毒庫的機(jī)體免疫及化學(xué)藥物清除復(fù)雜化；3)某些藥物作用特異性差，作用廣泛，毒副作用較大，不適于長期應(yīng)用等。4)上述很多LRAs仍處于臨床試驗(yàn)階段，甚至一些藥物僅是在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中證實(shí)有激活潛伏病毒的作用，尚有很長的一段路要走。因此，尋找新型HIV潛伏病毒逆轉(zhuǎn)劑，以期實(shí)現(xiàn)徹底清除患者體內(nèi)的HIV病毒的最終目標(biāo)，是HIV/AIDS防治領(lǐng)域的重中之重。目前，聯(lián)合應(yīng)用兩種或以上不同作用機(jī)制的LRAs，能較好地控制潛伏庫水平，這也為今后的潛伏感染研究提供了新的方向。

現(xiàn)有研究表明，BET抑制劑JQ1能激活HIV潛伏感染細(xì)胞模型和HIV感染者靜止期CD4⁺T細(xì)胞的HIV病毒產(chǎn)出，并且對T細(xì)胞活化基因有下調(diào)作用。最新研究還發(fā)現(xiàn)，BET家族的BRD4與Tat競爭性結(jié)合宿主正性轉(zhuǎn)錄延伸因子b(PTEF-b)，而BET抑制劑可增強(qiáng)Tat和PTEF-b的結(jié)合進(jìn)而激活HIV潛伏感染病毒。

目前處于臨床III期試驗(yàn)階段的用于治療動(dòng)脈粥樣硬化的小分子化合物RVX-208(Apabetalone，RVX-000222)亦屬于BET溴結(jié)構(gòu)域的抑制劑，其治療動(dòng)脈粥樣硬化的可能機(jī)理是促進(jìn)載脂蛋白(APO)的AI基因(ApoA-I)的形成，有效消除斑塊，促進(jìn)膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn)(RCT)途徑，從而穩(wěn)定或逆轉(zhuǎn)動(dòng)脈粥樣硬化。RVX-208的化學(xué)結(jié)構(gòu)式如圖1所示：

本研究發(fā)現(xiàn)，RVX-208在體外具有良好的激活HIV-1潛伏細(xì)胞庫的活性，尤其是可以高效激活HIV感染者體內(nèi)的潛伏病毒庫，且與其他作用機(jī)制的LRAs如PKC激活劑及HDAC抑制劑等有較好的協(xié)同效果。與已知的BET抑制劑JQ1相比，其體外細(xì)胞毒性大大降低，也側(cè)面說明該藥用藥安全且具有良好耐受。因此，RVX-208有望成為具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的HIV潛伏感染激活劑，從而達(dá)到徹底清除HIV潛伏感染庫，實(shí)現(xiàn)HIV“功能性”治愈的目標(biāo)！

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明旨在RVX-208(Apabetalone，RVX-000222)在作為HIV-1潛伏感染激活劑的應(yīng)用。

需要說明的是，所述的HIV-1潛伏感染激活劑是誘導(dǎo)激活HIV-1潛伏細(xì)胞的藥物。

需要說明的是，應(yīng)用的方法為：培養(yǎng)HIV-1潛伏感染細(xì)胞株，加入RVX-208，培養(yǎng)48小時(shí)，使得潛伏的HIV-1前病毒表達(dá)，從而激活潛伏的HIV-1病毒。

需要說明的是，所述的HIV-1潛伏感染激活劑的劑型為口服給藥或非口服給藥劑型。

需要說明的是，所述的口服給藥劑型是片劑、散劑、顆粒劑、膠囊劑、乳劑或糖漿劑。

需要說明的是，所述的非口服給藥劑型是注射劑。

本發(fā)明還旨在提供一種HIV-1潛伏感染激活的組合藥物，該組合藥物由RVX-208與蛋白激酶C激活劑(PKC激活劑)、組蛋白去乙酰化酶抑制劑(HDAC抑制劑)或細(xì)胞因子組成。

需要說明的是，所述的蛋白激酶C激活劑為Prostratin；所述的組蛋白去乙?；敢种苿閂orinostat(SAHA)或者Panobinostat；所述的細(xì)胞因子為TNF-α。

為了更好的理解本發(fā)明，下面對RVX-208激活HIV-1潛伏感染的能力進(jìn)行說明。

一、RVX-208具有體外激活HIV-1潛伏感染細(xì)胞模型的能力

本發(fā)明檢測了RVX-208對HIV-1潛伏感染細(xì)胞模型J-Lat 10.6、J-Lat A2、U1及ACH2細(xì)胞潛伏HIV-1的表達(dá)的影響。J-Lat 10.6細(xì)胞為攜帶綠色熒光蛋白GFP基因的人T細(xì)胞10.6克隆株；J-Lat A2細(xì)胞為轉(zhuǎn)染了LTR-Tat-Flag-IRES-EGFP質(zhì)粒人T細(xì)胞克隆株；U1細(xì)胞為HIV-1慢性感染的U937細(xì)胞系，存在Tat蛋白H13L突變；ACH2細(xì)胞為HIV-1慢性感染的A3.01細(xì)胞。RVX-208可以有效促進(jìn)J-Lat 10.6(圖2和圖3)和J-Lat A2(圖4)細(xì)胞的GFP的表達(dá)，并且可以促進(jìn)U1和ACH2細(xì)胞HIV-1核心蛋白p24的釋放(圖5和圖6)。

二、RVX-208具有體外激活HIV感染者血漿中潛伏病毒庫的能力

本發(fā)明檢測了RVX-208對HIV感染者血漿中HIV潛伏病毒庫的激活效果。圖7所示，通過10例HIV感染者的外周血單核淋巴細(xì)胞(PBMCs)的激活實(shí)驗(yàn)，RVX-208可以有效促進(jìn)HIV感染者潛伏病毒的活化釋放，其激活能力高于現(xiàn)有潛伏感染逆轉(zhuǎn)劑JQ1以及SAHA。

三、RVX-208對正常人外周血單核淋巴細(xì)胞的細(xì)胞毒性

本發(fā)明檢測了RVX-208對于人外周血單核淋巴細(xì)胞的細(xì)胞毒性。如圖8所示，RVX-208在500μM時(shí)未表現(xiàn)出明顯的細(xì)胞毒性，而其同類潛伏感染逆轉(zhuǎn)劑如JQ1以及OTX015均顯示出明顯的細(xì)胞毒性。

四、RVX-208可以與其他潛伏感染逆轉(zhuǎn)劑協(xié)同激活HIV-1潛伏病毒庫

本發(fā)明選用HIV-1潛伏感染激活劑Prostratin、TNF-α、SAHA以及Panobinostat，檢測以上藥物與RVX-208聯(lián)用對于HIV-1潛伏病毒庫的激活效果。圖9所示，RVX-208可以與Prostratin、TNF-α、SAHA以及Panobinostat協(xié)同促進(jìn)U1潛伏感染細(xì)胞模型的p24的釋放，表明RVX-208與幾種候選LRAs均具有較好的協(xié)同誘導(dǎo)激活作用。RVX-208與Prostratin及SAHA合用，還對HIV感染患者血漿中HIV潛伏病毒庫的激活效果具有較好的協(xié)同作用(圖10)。

上述研究結(jié)果表明，RVX-208不僅可以高效激活HIV-1潛伏感染細(xì)胞模型，并且可以促進(jìn)HIV感染者潛伏病毒庫的活化。與現(xiàn)有潛伏感染逆轉(zhuǎn)劑相比，其細(xì)胞毒性低，激活效率高，同時(shí)與現(xiàn)有的幾類LRAs具有協(xié)同促進(jìn)HIV-1潛伏病毒庫活化的作用。因而，RVX-208有望成為具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的HIV潛伏感染逆轉(zhuǎn)劑，為徹底清除HIV潛伏感染庫，實(shí)現(xiàn)HIV“功能性”治愈做出貢獻(xiàn)。本發(fā)明旨在為RVX-208作為HIV-1潛伏感染逆轉(zhuǎn)劑的后續(xù)研發(fā)提供強(qiáng)有力的理論基礎(chǔ)和數(shù)據(jù)支持，證明其具有重要的研發(fā)價(jià)值和開發(fā)意義。

附圖說明

圖1為RVX-208的化學(xué)結(jié)構(gòu)式。

圖2為熒光顯微鏡觀察本發(fā)明RVX-208對J-Lat A2潛伏感染細(xì)胞系的GFP表達(dá)的促進(jìn)作用，(A)為陰性空白對照組，(B)為RVX-208處理組。

圖3為流式細(xì)胞術(shù)分析本發(fā)明RVX-208對J-Lat A2潛伏感染細(xì)胞系的GFP表達(dá)的影響，JQ1以及SAHA為陽性對照組。

圖4為流式細(xì)胞術(shù)分析本發(fā)明RVX-208對J-Lat 10.6潛伏感染細(xì)胞系的GFP表達(dá)的影響，JQ1以及SAHA為陽性對照組。

圖5為ELISA p24定量法分析本發(fā)明RVX-208對U1潛伏感染細(xì)胞系的HIV-1 p24蛋白表達(dá)的影響，虛線為U1潛伏感染細(xì)胞系的本底p24值。

圖6為ELISAp24定量法分析本發(fā)明RVX-208對ACH2潛伏感染細(xì)胞系的HIV-1 p24蛋白的表達(dá)的影響，虛線為ACH2潛伏感染細(xì)胞系的本底p24值。

圖7為RT-PCR法分析本發(fā)明RVX-208對HIV感染者潛伏病毒庫的激活能力，JQ1以及SAHA為陽性對照組。

圖8為MTT法分析本發(fā)明RVX-208對人外周血單核淋巴細(xì)胞的細(xì)胞毒性。

圖9為ELISA p24定量法分析本發(fā)明RVX-208與其他潛伏感染激活劑聯(lián)用協(xié)同促進(jìn)U1潛伏感染細(xì)胞系的HIV-1 p24蛋白的表達(dá)。

圖10為RT-PCR法分析本發(fā)明RVX-208與其他潛伏感染激活劑聯(lián)用協(xié)同促進(jìn)HIV感染者病毒潛伏庫的活化。

具體實(shí)施方式

下面將結(jié)合附圖對本發(fā)明RVX-208作為HIV-1潛伏感染激活劑作進(jìn)一步技術(shù)方案描述。

實(shí)驗(yàn)1：RVX-208對HIV-1潛伏感染細(xì)胞模型J-Lat 10.6和J-Lat A2細(xì)胞GFP表達(dá)的影響。

1)收集J-Lat 10.6和J-Lat A2細(xì)胞液于離心管，800rpm離心5min，棄上清，留細(xì)胞沉淀。

2)加5ml培養(yǎng)基，吹勻細(xì)胞后吸取20μl細(xì)胞液于細(xì)胞計(jì)數(shù)板中，計(jì)數(shù)。

3)調(diào)整細(xì)胞濃度至5×10⁵個(gè)/ml，以500μl/孔鋪于48孔板中。

4)加入系列稀釋的RVX-208、陽性藥物SAHA以及JQ1。

5)37℃，5％CO₂培養(yǎng)箱中孵育48h后，熒光顯微鏡白光下觀察細(xì)胞生長情況，藍(lán)色熒光下觀察J-Lat 10.6和J-Lat A2細(xì)胞的GFP的表達(dá)，以確定RVX-208對潛伏感染細(xì)胞的激活效率。

6)將48孔板中的細(xì)胞收集于流式管中，800rpm離心5min。去除培養(yǎng)基，每支流式管中加入500μl PBS重懸細(xì)胞。

7)采用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞GFP表達(dá)，測定被激活細(xì)胞所占的比例。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：圖2所示，在J-Lat A2細(xì)胞中加入RVX-208 48h后，熒光顯微鏡下可觀察到藥物組綠色熒光表達(dá)量的增加，表明RVX-208可以激活J-Lat A2潛伏感染細(xì)胞HIV-1的表達(dá)，其熒光表達(dá)量增高表明HIV-1的活化。圖3及圖4表明，RVX-208可以呈濃度依賴性地激活J-Lat 10.6和J-Lat A2細(xì)胞的GFP的表達(dá)，其在50μM時(shí)可激活40％左右的細(xì)胞。

實(shí)驗(yàn)2：RVX-208對HIV-1潛伏感染細(xì)胞模型U1以及ACH2細(xì)胞的HIV-1p24蛋白表達(dá)的影響。

1)收集U1和ACH2細(xì)胞液于離心管，800rpm離心5min，棄上清，留細(xì)胞沉淀。

2)加5ml培養(yǎng)基，吹勻細(xì)胞后吸取20μl細(xì)胞液于細(xì)胞計(jì)數(shù)板中，計(jì)數(shù)。

3)調(diào)整細(xì)胞濃度至1×10⁶個(gè)/ml，以100μl/孔鋪于96孔板中。

4)加入系列稀釋的RVX-208。

5)37℃，5％CO₂培養(yǎng)箱中孵育48h后，收取細(xì)胞培養(yǎng)上清100μl于另一塊96孔板中，加入等體積的5％Triton X-100，4℃孵育過夜。

6)使用ELISA p24蛋白檢測試劑檢測樣品的p24蛋白含量。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：圖5及圖6所示，在U1細(xì)胞和ACH2細(xì)胞中加入RVX-208 48h后，其病毒的p24含量比空白對照組明顯增加，表明RVX-208可呈濃度依賴性地激活U1細(xì)胞和ACH2潛伏感染細(xì)胞HIV-1的表達(dá)。

實(shí)驗(yàn)3：RT-PCR法檢測RVX-208對HIV-1感染者潛伏病毒庫的激活能力。

1)分離HIV感染者外周血單核淋巴細(xì)胞，以1×10⁶個(gè)/ml，2ml/孔鋪于6孔板中。

2)加入RVX-208、陽性對照藥物JQ1以及SAHA。

3)37℃，5％CO₂培養(yǎng)箱中孵育48h后，收取細(xì)胞，加入1ml Trizol，小心吹吸裂解細(xì)胞，提取RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后，進(jìn)行RT-PCR，分析樣品的HIVLTR基因的表達(dá)水平。LTR基因的引物序列為：

F-GCCTCCTAGCATTTCGTCACAT；R-GCTGCTTATATGTAGCATCTGAGG。

通過RT-PCR分析，RVX-208可顯著促進(jìn)HIV感染者潛伏病毒庫的活化，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，且其激活效果優(yōu)于現(xiàn)有潛伏感染逆轉(zhuǎn)劑JQ1以及SAHA，平均激活倍數(shù)達(dá)15倍左右(圖7)。

實(shí)驗(yàn)4：RVX-208對人外周血單核淋巴細(xì)胞的細(xì)胞毒性

1)分離正常捐獻(xiàn)者外周血單核淋巴細(xì)胞，以1×10⁶個(gè)/ml，100μl/孔加入至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。

2)加入系列稀釋的RVX-208以及陽性藥物JQ1。

3)37℃，5％CO₂培養(yǎng)箱中孵育48h后，加入MTT溶液(5mg/ml，PBS配制，pH＝7.4)20μl/孔，繼續(xù)37℃，5％CO₂孵育4h。3,000rpm離心5min，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清，每孔加入100μlDMSO，振蕩15min，使結(jié)晶物充分溶解；

4)使用酶標(biāo)儀檢測每孔570nm處吸光度。

如圖8所示，MTT法檢測RVX-208對人外周血單核淋巴細(xì)胞的細(xì)胞毒性，結(jié)果表明RVX-208在500μM時(shí)對人外周血單核淋巴細(xì)胞無明顯細(xì)胞毒性。

實(shí)驗(yàn)5：RVX-208與其他潛伏感染激活劑聯(lián)用對HIV-1潛伏感染細(xì)胞模型U1的HIV-1p24蛋白表達(dá)的影響。

1)收集U1細(xì)胞液于離心管，800rpm離心5min，棄上清，留細(xì)胞沉淀。

2)加5ml培養(yǎng)基，吹勻細(xì)胞后吸取20μl細(xì)胞液于細(xì)胞計(jì)數(shù)板中，計(jì)數(shù)。

3)調(diào)整細(xì)胞濃度至1×10⁶個(gè)/ml，以100μl/孔鋪于96孔板中。

4)加入固定濃度為10、20以及30μM的RVX-208，并且加入其他潛伏感染激活劑，如Prostratin、SAHA、TNF-α以及Panobinostat。

5)37℃，5％CO₂培養(yǎng)箱中孵育48h后，收取細(xì)胞培養(yǎng)上清100μl于另一塊96孔板中，加入等體積的5％Triton X-100，4℃孵育過夜。

6)使用ELISAp24蛋白檢測試劑檢測樣品的p24蛋白含量。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，RVX-208可以與現(xiàn)有的潛伏感染激活劑，如Prostratin、SAHA、TNF-α以及Panobinostat協(xié)同促進(jìn)U1潛伏感染細(xì)胞中HIV-1p24蛋白的表達(dá)，協(xié)同效果較好(圖9)。

實(shí)驗(yàn)6：RVX-208與其他潛伏感染激活劑聯(lián)用對HIV-1感染者潛伏病毒庫的激活能力。

1)分離HIV感染者外周血單核淋巴細(xì)胞，以1×10⁶個(gè)/ml，2ml/孔鋪于6孔板中。

2)加入30μM的RVX-208，并且加入其他潛伏感染激活劑，如Prostratin和SAHA。

3)37℃，5％CO₂培養(yǎng)箱中孵育48h后，收取細(xì)胞，加入1ml Trizol，小心吹吸裂解細(xì)胞，提取RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后，進(jìn)行RT-PCR，分析樣品的HIV LTR基因的表達(dá)水平。LTR基因的引物序列為：

F-GCCTCCTAGCATTTCGTCACAT；R-GCTGCTTATATGTAGCATCTGAGG。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，RVX-208可以與現(xiàn)有的潛伏感染激活劑，如Prostratin以及SAHA協(xié)同促進(jìn)HIV感染者潛伏病毒庫的活化，其促進(jìn)作用具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(圖10)。