本發(fā)明涉及生物醫(yī)療技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種復(fù)合表皮生長(zhǎng)因子的絲素蛋白生物材料及其制備方法。

背景技術(shù)：

皮膚作為人體器官，具有保持水分、透氣和防止細(xì)菌侵襲等功能。真皮組織一旦損傷則無法完全再生，臨床上大面積的深度皮膚損傷通常采用自體、異體或異種皮片移植修復(fù)治療，但這些治療手段一方面會(huì)對(duì)供體造成新的創(chuàng)傷。目前組織修復(fù)中使用的高分子類生物材料包括合成高分子材料和天然高分子材料，合成高分子材料主要是聚乳酸等脂肪族聚酯材料，盡管其在力學(xué)性能和降解性等方面都基本上能滿足支架材料的應(yīng)用，但在生物相容性等方面存在諸多不足，其降解產(chǎn)物易對(duì)生物體產(chǎn)生不良影響。

在天然高分子材料中，蠶絲纖維具有來源廣，易于產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用的特點(diǎn)。而絲素是一種從蠶絲中提取的天然高分子蛋白質(zhì)，其內(nèi)含18種氨基酸，氨基酸種類與人體皮膚類似，對(duì)人體無毒副作用，生物相容性良好。經(jīng)過加工，絲素蛋白可被制作成膜，凝膠，支架，管，微球，凍干粉等材料應(yīng)用于各種組織工程學(xué)中?，F(xiàn)已有蘇州大學(xué)李明忠等人將絲素蛋白與聚氨酯材料結(jié)合制作成人工皮膚應(yīng)用于深度燒傷創(chuàng)面的治療?，F(xiàn)有專利中，較多的是利用絲素蛋白與海藻酸鈉、明膠等材料復(fù)合制作成水凝膠敷料或是海綿敷料，絲素蛋白在其中所起作用甚微。表皮生長(zhǎng)因子(EGF)對(duì)調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖和分化有著十分重要的作用。已有大量研究表明，EGF可以誘導(dǎo)多種細(xì)胞的增殖，特別是表皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞，能促進(jìn)RNA、DNA和蛋白質(zhì)的合成，能促進(jìn)透明質(zhì)酸、彈性纖維蛋白等大分子的合成，進(jìn)而使皮膚含水量增加、彈性增加。將EGF應(yīng)用于燒燙傷和傷口創(chuàng)傷的修復(fù)和愈合具有良好的療效：EGF能明顯加速創(chuàng)傷傷口的愈合，且能保持創(chuàng)面的整潔光滑，有利于減少疤痕組織以及色素沉著。本發(fā)明首次將表皮生長(zhǎng)因子與絲素蛋白復(fù)合生物支架結(jié)合，制作出一種可應(yīng)用于洞穴型創(chuàng)傷傷口的新型敷料，拓寬了創(chuàng)傷治療的領(lǐng)域，為醫(yī)生及病患提供了便利。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本申請(qǐng)?zhí)峁┮环N具有良好生物相容性及促進(jìn)傷口愈合的復(fù)合表皮生長(zhǎng)因子的絲素蛋白生物材料及其制備方法。

根據(jù)第一方面，一種實(shí)施例中提供一種復(fù)合表皮生長(zhǎng)因子的絲素蛋白生物材料的制備方法，包括如下步驟：

脫膠：將蠶絲進(jìn)行脫膠處理得到脫膠蠶絲；

溶解透析：將脫膠蠶絲置于鹽溶液中溶解透析得到絲素蛋白溶液；

注模成型：將溶解透析后的絲素蛋白溶液注入模具內(nèi)，并將注有絲素蛋白溶液的模具置于冷凍干燥機(jī)中冷凍干燥得到干燥多孔的絲素蛋白支架；

浸泡誘導(dǎo)：將絲素蛋白支架浸泡到誘導(dǎo)劑中，誘導(dǎo)絲素蛋白結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變形成不溶于水的絲素蛋白支架；

浸泡復(fù)合：將浸泡后的絲素蛋白支架置于含有表皮生長(zhǎng)因子和絲素蛋白的EGF/SF混合液中，使得絲素蛋白支架表面均勻粘附表皮生長(zhǎng)因子和絲素蛋白的EGF/SF混合液；

冷凍干燥：將浸泡后的復(fù)合絲素蛋白支架置于冷凍干燥機(jī)中冷凍干燥得到復(fù)合表皮生長(zhǎng)因子的絲素蛋白生物材料。

進(jìn)一步地，脫膠步驟中，將蠶絲置于Na₂CO₃溶液中加熱脫膠，并烘干制得脫膠蠶絲。

進(jìn)一步地，溶解透析步驟中，鹽溶液為溴化鋰、硝酸鎂、氯化鈣溶液中的一種，并使用透析袋進(jìn)行透析處理，制得絲素蛋白稀溶液一。

進(jìn)一步地，溶解透析步驟中，需將絲素蛋白稀溶液一濃縮為絲素蛋白濃溶液二，并且濃縮時(shí)間大于等于48h。

進(jìn)一步地，冷凍干燥機(jī)冷凍干燥處理的時(shí)間為24～48h，冷凍溫度為-10℃～-80℃。

進(jìn)一步地，浸泡誘導(dǎo)步驟中，絲素蛋白支架與誘導(dǎo)劑的質(zhì)量比大于1:20，浸泡時(shí)間為0.5～24h。

進(jìn)一步地，EGF/SF混合液由濃度為50μg/mL的表皮生長(zhǎng)因子和絲素蛋白稀溶液一混合而成。

進(jìn)一步地，EGF/SF混合液中表皮生長(zhǎng)因子和絲素蛋白稀溶液一的質(zhì)量比為1:20～200，并且在37℃的條件下混合。

進(jìn)一步地，浸泡復(fù)合中，EGF/SF混合液與絲素蛋白支架的質(zhì)量比為1:1。

根據(jù)第二方面，一種實(shí)施例中提供一種復(fù)合表皮生長(zhǎng)因子的絲素蛋白生物材料，其特征在于，包含絲素蛋白和表皮生長(zhǎng)因子，并由權(quán)上述復(fù)合表皮生長(zhǎng)因子的絲素蛋白生物材料的制備方法制備而成。

依據(jù)上述實(shí)施例的復(fù)合表皮生長(zhǎng)因子的絲素蛋白生物材料及其制備方法，由于絲素蛋白是從蠶絲絲素中提取的一種天然高分子材料，具有良好的生物相容性，對(duì)機(jī)體無毒性，無致敏和刺激作用，又可部分生物降解，表皮生長(zhǎng)因子(EGF)是人體內(nèi)的一種活性物質(zhì)，由53個(gè)氨基酸殘基組成的肽類活性物質(zhì)，能刺激表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體之酪氨酸磷酸化，達(dá)到修補(bǔ)增生的效果，使得由絲素蛋白和表皮生長(zhǎng)因子制成的生物材料具有可降解及促進(jìn)傷口愈合的作用，并且其制備操作簡(jiǎn)單。

附圖說明

圖1為一種實(shí)施例中復(fù)合表皮生長(zhǎng)因子的絲素蛋白生物材料的制備方法的流程圖。

具體實(shí)施方式

下面通過具體實(shí)施方式結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明。

實(shí)施例一：

本實(shí)施例提供了一種復(fù)合表皮生長(zhǎng)因子的絲素蛋白生物材料的制備方法，如圖所示，包括如下步驟：

S101：脫膠；

將30g家蠶生絲放入12L含有Na₂CO₃(2.12g/L)的沸水溶液中攪煮30mins，煮制期間用玻璃棒不間斷的攪拌使脫膠率提高。待煮制好后用去離子水揉搓煮好的脫膠絲以去除殘留的絲膠。將蠶絲蛋白纖維置于通風(fēng)櫥中通風(fēng)干燥。

S102：溶解透析；

稱取上述制得的脫膠蠶絲15g放入100mL濃度為9.3mol/L的溴化鋰(LiBr)溶液中進(jìn)行溶解處理，溶解處理時(shí)在60℃的條件下溶解4小時(shí)。每小時(shí)用玻璃棒對(duì)溶液進(jìn)行攪拌以確保蠶絲纖維溶解完全。

再對(duì)溶有脫膠蠶絲的溴化鋰溶液進(jìn)行透析處理，透析時(shí)將截留分子量為3500的透析袋浸入到去離子水中透析3天，期間每?jī)尚r(shí)各換一次去離子水，以去除溶液中的溴化鋰(LiBr)，得到的純凈的絲素蛋白稀溶液一，該絲素蛋白溶液的濃度為6％，濃度較低，為了提高絲素蛋白的濃度，方便凍干，需進(jìn)行濃縮處理，例如使用聚乙二醇(PEG 400)進(jìn)行濃縮，經(jīng)過濃縮得到濃度為30％的絲素蛋白濃溶液二，其中濃縮時(shí)間大于等于48h，優(yōu)先為72h。

S103：注模成型；

將濃度為30％的絲素蛋白溶液注入到預(yù)先制作好的模具中，絲素蛋白在模具中形成預(yù)先設(shè)定的支架結(jié)構(gòu)，注入完后再將模具置于液氮冷凍烘干機(jī)中進(jìn)行冷凍干燥，冷凍處理的溫度為-10℃～-80℃，優(yōu)選為-30℃，冷凍干燥的時(shí)間為24～48h，優(yōu)選為48h，通過冷凍干燥后制得干燥的多孔的絲素蛋白支架。

S104：浸泡誘導(dǎo)；

將干燥的絲素蛋白支架浸泡到誘導(dǎo)劑中，誘導(dǎo)劑優(yōu)選為甲醇溶液，絲素蛋白支架與甲醇的質(zhì)量比大于1:20，浸泡時(shí)間為0.5～24h。甲醇能夠誘導(dǎo)絲素蛋白結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變，結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變后的絲素蛋白支架不溶于水。誘導(dǎo)改變后的絲素蛋白支架置于通風(fēng)櫥中通風(fēng)干燥，使絲素蛋白支架上殘留的甲醇揮發(fā)。在其他實(shí)施例中，誘導(dǎo)劑也可選用乙醇，或者其他具有誘導(dǎo)作用的誘導(dǎo)劑。

S105：浸泡復(fù)合；

將濃度為50μg/mL表皮生長(zhǎng)因子(EGF)和絲素蛋白(SF)稀溶液一在37℃條件下按照質(zhì)量比為1:20～200混合均勻，制成SF/EGF混合液。將S105中所述不溶于水的絲素蛋白凍干支架按質(zhì)量比為1:1放入SF/EGF混合液中，使絲素蛋白支架表面均勻的粘附上含有SF/EGF混合液。

S106：冷凍干燥。

最后將經(jīng)過浸泡復(fù)合后的絲素蛋白支架再次經(jīng)液氮冷凍后放入到冷凍干燥機(jī)中冷凍干燥，得到外表層可溶于水內(nèi)部支架結(jié)構(gòu)不溶于水的多孔的絲素蛋白生物支架。

本例提供的制備方法制備的復(fù)合表皮生長(zhǎng)因子的絲素蛋白生物材料，可用作洞口型創(chuàng)傷上框的填充材料。

由于絲素蛋白是從蠶絲絲素中提取的一種天然高分子材料，具有良好的生物相容性，對(duì)機(jī)體無毒性，無致敏和刺激作用，又可部分生物降解，其降解產(chǎn)物本身不僅對(duì)組織無毒副作用，還對(duì)如皮膚、牙周組織等有營(yíng)養(yǎng)與修復(fù)的作用。大量研究證明，絲素蛋白基組織工程支架能夠應(yīng)用于骨、皮膚、血管、神經(jīng)、肝、軟骨、韌帶多種組織的再生。

表皮生長(zhǎng)因子(EGF)是人體內(nèi)的一種活性物質(zhì)，由53個(gè)氨基酸殘基組成的肽類活性物質(zhì)，分子量6201Da，分子內(nèi)有6個(gè)半胱氨酸組成的三對(duì)二硫鍵，形成3個(gè)分子內(nèi)環(huán)型結(jié)構(gòu)，組成生物活性所必須的受體結(jié)合區(qū)域。它能刺激表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體之酪氨酸磷酸化，達(dá)到修補(bǔ)增生的效果。對(duì)受傷、受損之表皮肌膚擁有絕佳之療效。表皮生長(zhǎng)因子EGF還能止血，并具有加速皮膚和粘膜創(chuàng)傷愈合，消炎鎮(zhèn)痛，增強(qiáng)表皮細(xì)胞的活力，能與人體內(nèi)各種酶形成良好的協(xié)調(diào)效應(yīng)。

使得由絲素蛋白和表皮生長(zhǎng)因子制成的生物材料具有可降解及促進(jìn)傷口愈合的作用，并且其制備操作簡(jiǎn)單。

實(shí)施例二：

本例提供了一種復(fù)合表皮生長(zhǎng)因子的絲素蛋白生物材料，復(fù)合表皮生長(zhǎng)因子的絲素蛋白生物材料絲素蛋白和表皮生長(zhǎng)因子，由上述實(shí)施例一的制備方法制備而成。

由絲素蛋白和表皮生長(zhǎng)因子制成的生物材料具有可降解及促進(jìn)傷口愈合的作用，故該材料可用作填充洞口型傷口內(nèi)部，外面再包覆傷口敷料，促進(jìn)傷口的愈合。

以上應(yīng)用了具體個(gè)例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行闡述，只是用于幫助理解本發(fā)明，并不用以限制本發(fā)明。對(duì)于本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員，依據(jù)本發(fā)明的思想，還可以做出若干簡(jiǎn)單推演、變形或替換。