本發(fā)明涉及預(yù)防和治療陰道疾病的菌劑技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種微生態(tài)陰道菌劑及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

據(jù)權(quán)威部門統(tǒng)計，我國成年女性婦科疾病的患病率高達87.5％。老年婦女，因卵巢功能衰退，雌激素水平降低，陰道壁萎縮，黏膜變薄，上皮細(xì)胞內(nèi)糖原含量減少，陰道內(nèi)pH值上升，局部抵抗力降低，致病菌易入侵繁殖引起炎癥。婦科炎癥包括女性外陰炎、陰道炎、宮頸炎、盆腔炎等，如果不及時預(yù)防和治療可能會引發(fā)其他病變，例如可影響精子的上行，妨礙精子與卵子的結(jié)合，或妨礙受精卵的著床發(fā)育，或?qū)е虏慌怕训?，進而便容易造成女性不孕。妊娠懷孕女性如果感染婦科炎癥，則也可對妊娠造成不利影響，可能會發(fā)生宮內(nèi)感染，以及流產(chǎn)、早產(chǎn)，胎兒智力低下等問題，不利于優(yōu)生優(yōu)育。

經(jīng)常使用婦科洗液和抗生素的婦女與不使用婦科洗液和抗生素的婦女相比患婦科炎癥的概率低73％，但是婦女連續(xù)使用一周抗生素不管是口服還是用于其它疾病，50％以上的婦女會患陰道炎。因此，使用婦科洗液是預(yù)防和治療婦科炎癥的有效方法。目前治療婦科炎癥的洗液種類繁多，有純中藥的黃蒲潔膚菌劑殺菌的作用來自于黃柏、黃連和蒲公英等多味中草藥成分；還有中藥和化學(xué)成分結(jié)合的菌劑，如：潔爾陰、婦炎潔、婦科千金洗液等等，利用化學(xué)成分的殺菌作用治標(biāo)，利用中藥成分治本。但是無論是純中藥還是中藥和化學(xué)成分結(jié)合的菌劑，都會由于濫用這些殺菌物質(zhì)嚴(yán)重破壞陰道自潔系統(tǒng)，直接導(dǎo)致陰道菌群紊亂，使婦科病易反復(fù)發(fā)作，治療效果不理想。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

有鑒于此，本發(fā)明的目的在于一種微生態(tài)陰道菌劑及其制備方法，通過調(diào)節(jié)女性陰道菌群，形成一個獨特穩(wěn)定而對人體無害的微生態(tài)系統(tǒng)，達到有效預(yù)防和治療婦科疾病的目的。

為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案：

本發(fā)明提供了一種微生態(tài)陰道菌劑，包括卷曲乳酸桿菌和詹森乳桿菌配伍發(fā)酵得到的發(fā)酵液。

優(yōu)選的，所述發(fā)酵液中卷曲乳酸桿菌的活菌數(shù)1～1.5億CFU/ml；所述詹森乳桿菌的活菌數(shù)0.5～1億CFU/ml。

本發(fā)明還提供了所述的微生態(tài)陰道菌劑的制備方法，包括以下步驟：

1)將卷曲乳酸桿菌和詹森乳桿菌混株配伍，將混株菌液接種至富集培養(yǎng)基上富集培養(yǎng)，得到富集培養(yǎng)液；

2)將所述步驟1)得到的富集培養(yǎng)液接種至擴大培養(yǎng)基上擴大培養(yǎng)，得到擴大培養(yǎng)液；

3)將所述步驟2)得到的擴大培養(yǎng)液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基上發(fā)酵培養(yǎng)，得到的發(fā)酵液為微生態(tài)陰道菌劑。

優(yōu)選的，所述步驟1)卷曲乳酸桿菌和詹森乳桿菌按照數(shù)量比為(1～2):(2～1)進行混株。

優(yōu)選的，所述步驟1)混株菌液的接種量為5～10％。

優(yōu)選的，所述步驟1)富集培養(yǎng)基包括以下組分：MgSO₄·7H₂O1.0～1.5g，KH₂PO₄0.5～1.0g，K₂HPO₄3.0～6g，NaCl 1.0～2g，CaCl₂15～25mg，F(xiàn)eSO₄3～8mg，MnCl₂·4H2O 3～8mg，CuCl₂0.3～0.6mg，微量元素液5～8ml，濃度為15mg/L的MC-RR和13mg/L的MC-LR的MCs粗提液200～300ml；所述富集培養(yǎng)基的pH值≤4.5；所述微量元素液含有以下質(zhì)量含量的組分：ZnSO₄0.29g/L，CaCl₂0.24g/L，CuSO₄0.25g/L，MgSO₄0.17g/L和FeSO₄0.28g/L。優(yōu)選的，所述步驟1)中富集培養(yǎng)的時間為1～2天；所述步驟1)中富集培養(yǎng)的溫度為28～30℃；所述步驟1)中富集培養(yǎng)在100rpm～140rpm的轉(zhuǎn)速條件下進行。

優(yōu)選的，所述步驟2)中擴大培養(yǎng)基包括以下組分含量：蛋白胨8～15g，酵母膏4～10g，NaCl3～8g，蒸餾水補充余量至1L；

優(yōu)選的，所述擴大培養(yǎng)基的pH值≤4.5；

優(yōu)選的，所述步驟2)中擴大培養(yǎng)的時間為3～5天；所述步驟2)中擴大培養(yǎng)的溫度為28～30℃；

優(yōu)選的，所述步驟2)中擴大培養(yǎng)在100rpm～140rpm的轉(zhuǎn)速條件下進行；

優(yōu)選的，所述步驟2)中擴大培養(yǎng)的接種量為5％～10％。

優(yōu)選的，所述步驟3)中發(fā)酵培養(yǎng)基包括下列重量份的組分：2～3份的EM有益微生物菌群、2～3份的紅糖、0.2～0.3份的L-抗壞血酸、0.05～0.2份的磷酸二氫鉀、0.2～0.5份的蚯蚓抗菌肽溶液、0.3～0.8份的蜂蜜和48～52份的水；

優(yōu)選的，所述步驟3)中發(fā)酵的接種量為1％～3％；

優(yōu)選的，所述步驟3)中發(fā)酵的條件為在常溫環(huán)境下；

優(yōu)選的，所述步驟3)中發(fā)酵的時間為12～15天。

優(yōu)選的，所述步驟3)中蚯蚓抗菌肽溶液的制備方法，包括以下步驟：

A將活蚯蚓與紅糖按照質(zhì)量為(4～6):(2～3.5)的比例混合，蚯蚓溶解后得到蚯蚓液；

B將所述步驟A得到的蚯蚓液分離，收集上清液；

C將所述步驟B得到的上清液進行沸水浴5～10min，分離，收集取上清液；

D將所述步驟C得到的上清液過濾收集濾液，得到蚯蚓抗菌肽溶液。

本發(fā)明提供所述的微生態(tài)陰道菌劑或本發(fā)明提供的方法制備的微生態(tài)陰道菌劑在制備預(yù)防和治療復(fù)發(fā)性陰道炎或分泌物異常婦科疾病的藥物中的應(yīng)用。

技術(shù)效果

本發(fā)明提供的一種微生態(tài)陰道菌劑，為卷曲乳酸桿菌和詹森乳桿菌配伍發(fā)酵得到的發(fā)酵液，卷曲乳酸桿菌和詹森乳桿菌能產(chǎn)H₂O₂，為有益微生物，科學(xué)組合，混株配伍，利用這些微生物之間的共生關(guān)系，形成一個復(fù)雜而穩(wěn)定的微生態(tài)系統(tǒng)，作用于患者的陰道內(nèi)，使乳酸菌等有益菌同婦女陰道中的功能菌形成一道強有力的微生態(tài)群，牢牢地占據(jù)陰道中的生態(tài)位，在抑制其它各種致病菌的同時，保留婦女陰道中的有益菌，使陰道內(nèi)微生態(tài)到達平衡pH值4～4.5之間，增強機體免疫力和陰道自潔功能，達到自然恢復(fù)的功效。本發(fā)明提供的微生態(tài)陰道菌劑治愈率在90％以上，有效率在92％以上，3個月內(nèi)復(fù)發(fā)率分別為低于3％，不良反應(yīng)發(fā)生率較低。微生物復(fù)合菌劑治療各種復(fù)發(fā)性陰道炎均有效。

同時，本發(fā)明提供的一種微生態(tài)陰道洗劑是再生型微生物，pH值在3～4.5之間，是病原菌最懼怕的對手，它的治療作用是靠控制有害菌不增殖，沒有抗生物質(zhì)全殲滅的性質(zhì)，因而不會產(chǎn)生具有耐性菌那樣的變異株，也就不會使機體產(chǎn)生耐藥性，因而安全無不良反應(yīng)。

本發(fā)明還提供了微生態(tài)陰道菌劑的制備方法，是卷曲乳酸桿菌和詹森乳桿菌有益微生物為有益菌，將EM有益微生物菌群、紅糖、L-抗壞血酸、0.1份的磷酸二氫鉀、蚯蚓抗菌肽溶液和蜂蜜螯合發(fā)酵，制備方法簡單，成本低廉，重復(fù)性好。

具體實施方式

本發(fā)明提供了一種微生態(tài)陰道菌劑，包括卷曲乳酸桿菌和詹森乳桿菌配伍發(fā)酵得到的發(fā)酵液。

本發(fā)明提供的一種微生態(tài)陰道菌劑，用先進的生物工程技術(shù)和醫(yī)學(xué)微生態(tài)學(xué)相結(jié)合，卷曲乳酸桿菌和詹森乳桿菌作為有益微生物，科學(xué)組合，混株配伍，利用這些微生物之間的共生關(guān)系，形成一個復(fù)雜而穩(wěn)定的微生態(tài)系統(tǒng)，在抑制其它各種致病菌的同時，保留婦女陰道中的有益菌，使陰道內(nèi)微生態(tài)到達平衡pH值4～4.5之間，增強機體免疫力和陰道自潔功能，達到自然恢復(fù)的功效。

本發(fā)明中，所述發(fā)酵液中卷曲乳酸桿菌的活菌數(shù)1～1.5億CFU/ml；所述詹森乳桿菌的活菌數(shù)0.5～1億CFU/ml。

本發(fā)明中，所述微生態(tài)陰道菌劑還優(yōu)選包括醫(yī)學(xué)上接受的輔料。在本發(fā)明中，所述的輔料優(yōu)選包括多孔淀粉。所述多孔淀粉與發(fā)酵液的質(zhì)量體積比優(yōu)選為1.5～2.5：3(mg:mL)，更優(yōu)選為2：3(mg:L)。

本發(fā)明還提供了所述的微生態(tài)陰道菌劑的制備方法，包括以下步驟：

1)將卷曲乳酸桿菌和詹森乳桿菌混株配伍后接種至富集培養(yǎng)基上富集培養(yǎng)，得到富集培養(yǎng)液；

2)將所述步驟1)得到的富集培養(yǎng)液接種至擴大培養(yǎng)基上擴大培養(yǎng)，得到擴大培養(yǎng)液；

3)將所述步驟2)得到的擴大培養(yǎng)液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基上發(fā)酵培養(yǎng)，得到的發(fā)酵液為微生態(tài)陰道菌劑。

本發(fā)明提供的所述的微生態(tài)陰道菌劑的制備方法，方法簡單，重復(fù)性好，成本低廉。

本發(fā)明將卷曲乳酸桿菌和詹森乳桿菌混株配伍后接種至富集培養(yǎng)基上富集培養(yǎng)，得到富集培養(yǎng)液。

本發(fā)明中，所述卷曲乳酸桿菌和詹森乳桿菌的種類沒有特殊限制，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的制備陰道菌劑的卷曲乳酸桿菌和詹森乳桿菌的種類即可。

本發(fā)明中，所述卷曲乳酸桿菌和詹森乳桿菌的來源是健康女性的陰道分泌物中篩選獲得。所述篩選的方法包括根據(jù)細(xì)菌學(xué)分離方法分離出乳桿菌,再通過生長溫度試驗(15℃～45℃)、運動性試驗、硝酸鹽還原試驗、明膠液化試驗、吲哚(靛基質(zhì))試驗、硫化氫試驗將疑似株菌鑒定為乳桿菌屬；再采用碳水化合物發(fā)酵產(chǎn)酸試驗對乳桿菌進行種的鑒定，進一步篩選出產(chǎn)生過氧化氫的優(yōu)勢菌株，并運用16S rRNA序列分析方法進行基因型鑒定。本發(fā)明中，所述16S rRNA序列分析方法沒有特殊限制，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的16S rRNA序列分析方法。所述16S rRNA序列分析方法中使用的引物序列優(yōu)選為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的細(xì)菌分子鑒定使用的16S rRNA引物正向序列5'-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3'，16S rRNA引物反向序列5'-TAGGGTTACCTTGTTACGACTT-3'。所述16S rRNA引物由上海生工合成。

本發(fā)明中，所述卷曲乳酸桿菌和詹森乳桿菌優(yōu)選按照數(shù)量比為(1～2):(2～1)進行混株配伍，更優(yōu)選為1:1。

所述卷曲乳酸桿菌和詹森乳桿菌的混株優(yōu)選按照接種量為5～10％進行接種，更優(yōu)選為8％。

本發(fā)明中，所述富集培養(yǎng)基優(yōu)選包括以下組分：MgSO₄·7H₂O 1.0～1.5g，KH₂PO₄0.5～1.0g，K₂HPO₄3.0～6g，NaCl 1.0～2g，CaCl₂15～25mg，F(xiàn)eSO₄3～8mg，MnCl₂·4H₂O 3～8mg，CuCl₂0.3～0.6mg，微量元素液5～8ml，濃度為15mg/L的MC-RR(藻毒素RR)和13mg/L的MC-LR(藻毒素LR)的MCs粗提液200～300ml，蒸餾水補充余量；所述富集培養(yǎng)基pH值≤4.5；更優(yōu)選為MgSO₄·7H₂O 1.2g，KH₂PO₄0.8g，K₂HPO₄4g，NaCl 1.5g，CaCl₂20mg，F(xiàn)eSO₄5mg，MnCl₂·4H₂O 5mg，CuCl₂0.5mg。微量元素液6ml，濃度為15mg/L的MC-RR和13mg/L的MC-LR的MCs粗提液200～300ml，蒸餾水補充至1000ml。所述富集培養(yǎng)基的pH值更優(yōu)選為4.0～4.4。所述富集培養(yǎng)基的pH值調(diào)整的方法采用體積濃度0.1％的HCl溶液和質(zhì)量濃度為0.1％的NaOH溶液進行調(diào)整。

本發(fā)明中，所述微量元素液優(yōu)選包括以下質(zhì)量含量的組分：ZnSO₄0.29g/L，CaCl₂0.24g/L，CuSO₄0.25g/L，MgSO₄0.17g/L和FeSO₄0.28g/L；所述微量元素液中的溶劑為蒸餾水。

本發(fā)明對所述富集培養(yǎng)基的配制方法沒有特殊限制采用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的培養(yǎng)基配制方法即可。

本發(fā)明中，所述MCs粗提液的制備方法優(yōu)選包括以下步驟：

凍干小球藻粉用體積濃度為5％～10％的乙酸提取3～4次，得到的懸濁液離心取上清液，并通過預(yù)處理的活性炭吸附柱吸附，隨后清洗活性炭吸附柱，用體積濃度為15％～20％甲醇洗一次，再用體積濃度為100％甲醇洗脫毒素；將體積濃度為100％甲醇洗脫液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上蒸干，得到的干粉為粗微囊藻毒素。所述的預(yù)處理方法優(yōu)選用體積濃度100％甲醇沖洗，后用去離子水沖洗。

本發(fā)明中，所述富集培養(yǎng)的時間優(yōu)選為1～2天，更優(yōu)選為1.5天。所述富集培養(yǎng)的溫度優(yōu)選為28～30℃，更優(yōu)選為29℃。所述富集培養(yǎng)優(yōu)選在轉(zhuǎn)速為100rpm～140rpm的條件下進行，更優(yōu)選為120rpm。

得到富集培養(yǎng)液后，本發(fā)明將所述富集培養(yǎng)液接種至擴大培養(yǎng)基上擴大培養(yǎng)，得到擴大培養(yǎng)液；

本發(fā)明中，所述擴大培養(yǎng)基優(yōu)選包括以下質(zhì)量含量的組分：蛋白胨8～15g/L，酵母膏4～10g/L，NaCl 3～8g/L；所述擴大培養(yǎng)基中的溶劑為蒸餾水；更優(yōu)選為蛋白胨10g/L，酵母膏46g/L，NaCl 5g/L；所述擴大培養(yǎng)基pH≤4.5，更優(yōu)選為4.0～4.4。所述pH值的調(diào)節(jié)方法優(yōu)選采用體積濃度為0.1％的HCl溶液和質(zhì)量濃度為0.1％的NaOH溶液調(diào)節(jié)。

本發(fā)明中，所述擴大培養(yǎng)的時間為3～5天，更優(yōu)選為4天。所述擴大培養(yǎng)的溫度為28～30℃，更優(yōu)選為29℃。所述擴大培養(yǎng)優(yōu)選在震蕩培養(yǎng)條件下進行，所述震蕩培養(yǎng)的轉(zhuǎn)速為100rpm～140rpm；更優(yōu)選為120rpm。所述擴大培養(yǎng)的接種量為5％～10％，更優(yōu)選為8％。

得到擴大培養(yǎng)液后，本發(fā)明將所述擴大培養(yǎng)液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基上發(fā)酵培養(yǎng)，得到的發(fā)酵液為微生態(tài)陰道菌劑。

本發(fā)明中，所述發(fā)酵培養(yǎng)基包括下列重量份的組分：2～3份的EM有益微生物菌群、2～3份的紅糖、0.2～0.3份的L-抗壞血酸、0.05～0.2份的磷酸二氫鉀、0.2～0.5份的蚯蚓抗菌肽溶液、0.3～0.8份的蜂蜜和48～52份的水，更優(yōu)選為2.5份的EM有益微生物菌群、2.5份的紅糖、0.25份的L-抗壞血酸、0.1份的磷酸二氫鉀、0.3份的蚯蚓抗菌肽溶液、0.5份的蜂蜜和50份的水。本發(fā)明對所述水的種類沒有特殊的限制，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的培養(yǎng)基用水即可，具體的，所述水為涼開水。

在本發(fā)明中，所述發(fā)酵培養(yǎng)的接種量優(yōu)選為1％～3％，更優(yōu)選為2％；所述發(fā)酵培養(yǎng)優(yōu)選在常溫環(huán)境下進行；所述發(fā)酵培養(yǎng)的時間為12～15天，更優(yōu)選為13～14天。

本發(fā)明中，所述EM有益微生物菌群的來源沒有特殊限制，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的EM有益微生物菌群的來源即可。本發(fā)明實施例中所述EM有益微生物菌群的來源為從江西天意生物有限公司購買得到。

本發(fā)明中，所述蚯蚓抗菌肽溶液的制備方法優(yōu)選包括以下步驟：

A將活蚯蚓與紅糖按照質(zhì)量為(4～6):(2～3.5)的比例混合，蚯蚓溶解后得到蚯蚓液；

B將所述步驟A得到的蚯蚓液分離，收集上清液；

C將所述步驟B得到的上清液進行沸水浴5～10min，分離，收集取上清液；

D將所述步驟C得到的上清液過濾收集濾液，得到蚯蚓抗菌肽溶液。

本發(fā)明將活蚯蚓與紅糖按照質(zhì)量為(4～6):(2～3.5)的比例混合，蚯蚓溶解后得到蚯蚓液；更優(yōu)選為5：3的比例混合。

本發(fā)明中，所述混合沒有特殊限制采用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的混合的技術(shù)方案即可。

本發(fā)明中，所述活蚯蚓優(yōu)選在與紅糖混合之前進行清洗干凈。本發(fā)明中，所述活蚯蚓和紅糖的來源沒有特殊限制，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的活蚯蚓和紅糖的來源即可。本發(fā)明中，所活蚯蚓在紅糖的作用下會發(fā)生溶解，得到蚯蚓液。

得到蚯蚓液后，本發(fā)明將所述蚯蚓液分離，收集上清液。

本發(fā)明中，所述分離的方法沒有特殊限制，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員所述之的分離的技術(shù)方案即可。本發(fā)明實施例中，所述分離的方案為離心。所述離心的轉(zhuǎn)速優(yōu)選為100rpm～140rpm；更優(yōu)選為120rpm。所述離心的時間優(yōu)選為5～8min；更優(yōu)選為6～7min。所述離心的溫度優(yōu)選為18℃-35℃；更優(yōu)選為30℃。

得到上清液后，本發(fā)明將所述上清液進行沸水浴5～10min，分離，收集取上清液。

本發(fā)明中，上清液進行沸水浴的時間5～10min，更優(yōu)選為8min。所述上清液進行沸水浴之前優(yōu)選用乙酸緩沖液稀釋。所述乙酸緩沖液的濃度優(yōu)選為30％～40％；更優(yōu)選為36％。所述稀釋的倍數(shù)優(yōu)選為80～120倍，更優(yōu)選為100倍。

本發(fā)明中，所述沸水浴優(yōu)選在攪拌的條件下進行。本發(fā)明對所述攪拌的速度沒有特殊限制，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的沸水浴攪拌速度即可。

得到上清液后，本發(fā)明將所述上清液過濾收集濾液，得到蚯蚓抗菌肽溶液。

本發(fā)明中，所述過濾優(yōu)選采用能通過分子量10000Da規(guī)格的超濾系統(tǒng)進行。

本發(fā)明中，所述發(fā)酵培養(yǎng)的過程具體優(yōu)選包括以下步驟：

Ⅰ、將紅糖、磷酸二氫鉀與涼開水混合，充分?jǐn)嚢柚寥咳芙猓?/p>

Ⅱ、加入EM有益微生物菌群、所述擴大培養(yǎng)液和蚯蚓抗菌肽溶液，攪拌，在半密封狀態(tài)下，在25～35℃、光照強度在100～550Lex的環(huán)境下發(fā)酵，每三天攪拌一次，每次攪拌1～2min；

Ⅲ、發(fā)酵進行到第3天時，水面會出現(xiàn)泡沫，加入蜂蜜以加快發(fā)酵速度，促進有益微生物的生成；第8天時，泡沫慢慢消失，水面浮起一片白色的懸浮物，加入L-抗壞血酸，以增強抗氧化能力，到第13天時，懸浮物形成沉淀物，pH值在4.5以下，固液分離，得到的發(fā)酵上清液為微生態(tài)陰道菌劑。

本發(fā)明中，所述半密封狀態(tài)下優(yōu)選發(fā)酵容器蓋上蓋的狀態(tài)。

本發(fā)明中，所述發(fā)酵液優(yōu)選采用多孔淀粉吸附，得到多孔淀粉吸附的復(fù)合菌劑，噴霧干燥后的產(chǎn)品分裝成膠囊，制備得到微生態(tài)陰道菌膠囊劑。所述噴霧干燥的進風(fēng)溫度優(yōu)選為150～180℃；更優(yōu)選為170℃。所述噴霧干燥的出風(fēng)溫度優(yōu)選為60～70℃；更優(yōu)選為65℃。

本發(fā)明中，所述多孔淀粉與發(fā)酵上清液的質(zhì)量體積比優(yōu)選為1.5～2.5：3(mg:mL)，更優(yōu)選為2：3(mg:L)。所述多孔淀粉的來源沒有特殊限制，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的多孔淀粉即可。

基于上述微生態(tài)陰道菌劑的特點，本發(fā)明提供的微生態(tài)陰道菌劑在制備預(yù)防和治療復(fù)發(fā)性陰道炎或分泌物異常婦科疾病的藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明中，所述微生態(tài)陰道菌劑在使用的過程中，優(yōu)選連續(xù)用藥5d～6d，每天1次，每次1粒膠囊。所述膠囊中盛裝所述微生態(tài)陰道菌劑的活菌數(shù)優(yōu)選為8～15億CFU/g。

下面結(jié)合實施例對本發(fā)明提供的一種微生態(tài)陰道菌劑及其制備方法進行詳細(xì)的說明，但是不能把它們理解為對本發(fā)明保護范圍的限定。

實施例1

將活用水洗凈蚯蚓，以蚯蚓跟紅糖5:3的比例，加入紅糖(又名甘蔗糖)，等蚯蚓溶解后，將蚯蚓液離心分離，取上清液，用乙酸緩沖液稀釋后，入沸水浴，邊加熱邊攪動5min，然后離心分離，取上清液，用乙酸緩沖液稀釋后，用能通過分子量10000Da規(guī)格的超濾系統(tǒng)過濾或高速離心機分離得到蚯蚓抗菌肽溶液。

實施例2

將活用水洗凈蚯蚓，以蚯蚓跟紅糖4：3.5的比例，加入紅糖(又名甘蔗糖)，等蚯蚓溶解后，將蚯蚓液離心分離，取上清液，用乙酸緩沖液稀釋后，入沸水浴，邊加熱邊攪動8min，然后離心分離，取上清液，用乙酸緩沖液稀釋后，用能通過分子量10000Da規(guī)格的超濾系統(tǒng)過濾或高速離心機分離得到蚯蚓抗菌肽溶液。

實施例3

將活用水洗凈蚯蚓，以蚯蚓跟紅糖6：2的比例，加入紅糖(又名甘蔗糖)，等蚯蚓溶解后，將蚯蚓液離心分離，取上清液，用乙酸緩沖液稀釋后，入沸水浴，邊加熱邊攪動10min，然后離心分離，取上清液，用乙酸緩沖液稀釋后，用能通過分子量10000Da規(guī)格的超濾系統(tǒng)過濾或高速離心機分離得到蚯蚓抗菌肽溶液。

實施例4

篩選出健康婦女陰道中卷曲乳酸桿菌和詹森乳桿菌有益菌，混株配伍，按照5％的接種量接種至富集培養(yǎng)基中，以120轉(zhuǎn)/min，30℃下震蕩培養(yǎng)1天，得到有益菌培養(yǎng)液，富集培養(yǎng)基培養(yǎng)基的組成為MgSO₄·7H₂O 1.0g，KH₂PO₄1.0g，K₂HPO₄3.0g，NaCl 2g，CaCl₂15mg，F(xiàn)eSO₄8mg，MnCl₂·4H₂O 3mg，CuCl₂0.6mg，微量元素液5ml，濃度為15mg/L的MC-RR和13mg/L的MC-LR的MCs粗提液200ml，蒸餾水補充至1000ml，調(diào)節(jié)pH為4.5，其中微量元素液為1L蒸餾水中含有ZnSO₄0.29g，CaCl₂0.24g，CuSO₄0.25g，MgSO₄0.17g和FeSO₄0.28g。將培養(yǎng)液按5％的接種量接種到擴大培養(yǎng)基上，以120rpm，30℃下繼續(xù)培養(yǎng)5天，得到發(fā)酵液，篩選優(yōu)良菌種，所述擴大培養(yǎng)基的組成為蛋白胨8g，酵母膏10g，NaCl 3g，蒸餾水補充至1000ml，調(diào)節(jié)pH為4.5。將得到的擴大培養(yǎng)液菌種按照接種量為1％的量接入含2kg EM菌種紅糖，0.05kg磷酸二氫鉀和實施例1制備得到的0.2份的的蚯蚓抗菌肽的溶液的50kg的水溶液，攪拌，在半密封狀態(tài)下，室溫在35℃、光照強度在100Lex的環(huán)境下發(fā)酵，每三天攪拌一次，每次攪拌2min；發(fā)酵進行到第3天時，水面會出現(xiàn)泡沫，需加入0.3kg蜂蜜以加快發(fā)酵速度，促進有益微生物的生成；第8天時，泡沫慢慢消失，水面浮起一片白色的懸浮物，需加入0.2kg L-抗壞血酸，以增強抗氧化能力，到第l3天時，懸浮物形成沉淀物，pH值在4.5，固液分離，收集發(fā)酵上清液，按照多孔淀粉與發(fā)酵上清液的質(zhì)量體積比1.5：3(mg:mL)的比例添加多孔淀粉后進行噴霧干燥，得到微生態(tài)陰道菌劑干粉。將干粉分裝至膠囊中，保證每膠囊中盛裝的微生態(tài)陰道菌劑的活菌數(shù)為8億CFU/g，即得到微生態(tài)陰道菌劑產(chǎn)品。

實施例5

篩選出健康婦女陰道中卷曲乳酸桿菌和詹森乳桿菌有益菌，混株配伍，按照10％的接種量接種至富集培養(yǎng)基中，以100轉(zhuǎn)/min，28℃下震蕩培養(yǎng)3天，得到有益菌培養(yǎng)液，富集培養(yǎng)基培養(yǎng)基的組成為MgSO₄·7H₂O 1.5g，KH₂PO₄0.5g，K₂HPO₄6g，NaCl 1.0g，CaCl₂25mg，F(xiàn)eSO₄3mg，MnCl₂·4H₂O3mg，CuCl₂0.3mg，微量元素液8ml，濃度為15mg/L的MC-RR和13mg/L的MC-LR的MCs粗提液200～300ml，蒸餾水800～1000ml，調(diào)節(jié)pH為4，其中微量元素液為1L蒸餾水中含有ZnSO₄0.29g，CaCl₂0.24g，CuSO₄0.25g，MgSO₄0.17g和FeSO₄0.28g。將培養(yǎng)液按8％的接種量接種到擴大培養(yǎng)基上，以140rpm，30℃下繼續(xù)培養(yǎng)3天，得到發(fā)酵液，篩選優(yōu)良菌種，所述擴大培養(yǎng)基的組成為蛋白胨15g，酵母膏4g，NaCl 8g，蒸餾水補充1L，調(diào)節(jié)pH為4。將得到的擴大培養(yǎng)液菌種按照接種量為1％的量接入含3kg EM菌種紅糖，0.2kg磷酸二氫鉀和實施例2制備得到的0.5份的蚯蚓抗菌肽的溶液的52kg的水溶液，攪拌，在半密封狀態(tài)下，室溫在25℃、光照強度在550Lex的環(huán)境下發(fā)酵，每三天攪拌一次，每次攪拌1min；發(fā)酵進行到第3天時，水面會出現(xiàn)泡沫，需加入0.8kg蜂蜜以加快發(fā)酵速度，促進有益微生物的生成；第8天時，泡沫慢慢消失，水面浮起一片白色的懸浮物，需加入0.3kg L-抗壞血酸，以增強抗氧化能力，到第l3天時，懸浮物形成沉淀物，pH值在4.2，固液分離，發(fā)酵上清液，按照多孔淀粉與發(fā)酵上清液的質(zhì)量體積比2.5：3(mg:mL)的比例多孔淀粉后噴霧干燥，得到微生態(tài)陰道菌劑干粉。將干粉分裝至膠囊中，保證每膠囊中盛裝的微生態(tài)陰道菌劑的活菌數(shù)為15億CFU/g，即得到微生態(tài)陰道菌劑產(chǎn)品。

實施例6

篩選出健康婦女陰道中卷曲乳酸桿菌和詹森乳桿菌有益菌，混株配伍，按照8％的接種量接種至富集培養(yǎng)基中，以140轉(zhuǎn)/min，29℃下震蕩培養(yǎng)2天，得到有益菌培養(yǎng)液，富集培養(yǎng)基培養(yǎng)基的組成為MgSO₄·7H₂O 1.2g，KH₂PO₄0.8g，K₂HPO₄4g，NaCl 1.5g，CaCl₂20mg，F(xiàn)eSO₄5mg，MnCl₂·4H₂O 5mg，CuCl₂0.5mg，微量元素液6ml，濃度為15mg/L的MC-RR和13mg/L的MC-LR的MCs粗提液200～300ml，蒸餾水補充至1000ml，調(diào)節(jié)pH為4.2，其中微量元素液為1L蒸餾水中含有ZnSO₄0.29g，CaCl₂0.24g，CuSO₄0.25g，MgSO₄0.17g和FeSO₄0.28g。將培養(yǎng)液按10％的接種量接種到擴大培養(yǎng)基上，以100rpm，30℃下繼續(xù)培養(yǎng)4天，得到發(fā)酵液，篩選優(yōu)良菌種，所述擴大培養(yǎng)基的組成為蛋白胨10g，酵母膏46g，NaCl 5g，蒸餾水補充1L，調(diào)節(jié)pH為4.2。將得到的擴大培養(yǎng)液菌種按照接種量為1％的量接入含2.5kg EM菌種紅糖，0.1kg磷酸二氫鉀和實施例3制備得到的0.3份的蚯蚓抗菌肽的溶液的48kg的水溶液，攪拌，在半密封狀態(tài)下，室溫在30℃、光照強度在300Lex的環(huán)境下發(fā)酵，每三天攪拌一次，每次攪拌1.5min；發(fā)酵進行到第3天時，水面會出現(xiàn)泡沫，需加入0.5kg蜂蜜以加快發(fā)酵速度，促進有益微生物的生成；第8天時，泡沫慢慢消失，水面浮起一片白色的懸浮物，需加入0.25kg L-抗壞血酸，以增強抗氧化能力，到第l3天時，懸浮物形成沉淀物，pH值在4.0，固液分離，發(fā)酵上清液，按照多孔淀粉與發(fā)酵上清液的質(zhì)量體積比2：3(mg:mL)的比例多孔淀粉后噴霧干燥，得到微生態(tài)陰道菌劑干粉。將干粉分裝至膠囊中，保證每膠囊中盛裝的微生態(tài)陰道菌劑的活菌數(shù)為10億CFU/g，即得到微生態(tài)陰道菌劑產(chǎn)品。

實施例7～10

將門診200例復(fù)發(fā)性陰道炎患者按照優(yōu)勢菌及菌群密集度、多樣性的不同、特殊菌群的檢出、機體炎性反應(yīng)及臨床表現(xiàn)分為4組，每組50例。

A組：陰道炎治療后仍有癥狀，陰道微生態(tài)表現(xiàn)無優(yōu)勢菌、密集度+、多樣性+，給予重點恢復(fù)陰道酸性環(huán)境、補充乳酸桿菌，陰道用微生物復(fù)合菌劑5d，每晚1次。

B組：陰道炎治療后仍有癥狀，陰道微生態(tài)表現(xiàn)革蘭陽性球菌或革蘭陰性桿菌為優(yōu)勢菌，密集度及多樣性為給予恢復(fù)陰道酸性環(huán)境，分別應(yīng)用針對革蘭陽性球菌或針對革蘭陰性桿菌為主的抗生素治療1周，陰道用微生物復(fù)合菌劑5d，每晚1次。

C組：滴蟲感染，鏡下見滴蟲，給予口服硝唑類治療1周后，用微生物復(fù)合菌劑5d，每晚1次。

D組：假絲酵母菌性陰道炎復(fù)發(fā)，鏡下看見菌絲或孢子，菌群失調(diào)，臨床有外陰瘙癢癥狀，白帶典型或不典型，口服氟康唑150mg(第1日)同時陰道用達克寧400mg，每晚1次，連用3d，停藥后陰道用微生物復(fù)合菌劑5d，每晚1次。

評定療效。結(jié)果：A、B、C、D 4組治愈率分別為98％，96％，96％，88％，有效率分別為100％，98％，98％，92％，3個月內(nèi)復(fù)發(fā)率分別為0％，2％，2％，6％，不良反應(yīng)發(fā)生率低。微生物復(fù)合菌劑治療各種復(fù)發(fā)性陰道炎均有效。

實施例11～14

根據(jù)分泌物顏色、氣味、pH值及陰道微生態(tài)診斷、線索細(xì)胞、特殊病原體分為4組。

A組：有臨床癥狀，微生態(tài)檢查所有細(xì)菌均少，表現(xiàn)為沒有優(yōu)勢菌，密集度+、多樣性+，治療重點是恢復(fù)陰道酸性環(huán)境，3％硼酸坐浴，每日2次，乳酸桿菌活菌膠囊1枚置陰道深處，每晚1次，共5d。

B組：有臨床癥狀，陰道微生態(tài)表現(xiàn)革蘭陰性桿菌為優(yōu)勢菌，密集度及多樣性為應(yīng)用針對革蘭陰性桿菌為主的抗生素環(huán)丙沙星500mg，每日2次，共治療7d，如發(fā)現(xiàn)有線索細(xì)胞，氨試驗陽性，陰道pH>4.5，陰道均質(zhì)稀薄的分泌物診斷細(xì)菌性陰道病，給予甲硝唑400mg口服，每日2次，共7d。若陰道炎治療后仍有癥狀，陰道微生態(tài)表現(xiàn)革蘭陽性球菌，應(yīng)用針對革蘭陽性球菌的抗生素頭孢拉定0.5g，每日4次，共7d。

C組：典型的黃綠色泡沫樣白帶，瘙癢、灼熱、疼痛，分泌物懸滴法可見滴蟲，治療采用甲硝唑或替硝唑2g單次口服，局部用3％硼酸溶液沖洗，性伴同治，1周后乳桿菌活菌膠囊1枚置陰道深處，每晚1次，共5d。

D組：臨床癥狀及體征典型或不典型，可見孢子或菌絲，口服氟康唑150mg(第1天)同時陰道用達克寧400mg，每晚1次，連用3d，停藥后用乳酸桿菌活菌膠囊5d，每晚1次。

評定療效。結(jié)果：A、B、C、D 4組治愈率分別為97％，95％，98％，90％，有效率分別為100％，98％，98％，92％，3個月內(nèi)復(fù)發(fā)率分別為1％，1％，0％，3％，不良反應(yīng)發(fā)生率低。微生物復(fù)合菌劑治療各種復(fù)發(fā)性陰道炎均有效。

由以上實施例可知，本發(fā)明提供的一種微生態(tài)陰道菌劑，用先進的生物工程技術(shù)和醫(yī)學(xué)微生態(tài)學(xué)相結(jié)合，卷曲乳酸桿菌和詹森乳桿菌作為有益微生物，科學(xué)組合，混株配伍，應(yīng)用治療婦科疾病，結(jié)果顯示本發(fā)明提供的微生態(tài)陰道菌劑能有效預(yù)防和治療多種婦科疾病，并且使用安全無不良反應(yīng)。

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護范圍。