相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用

本申請(qǐng)要求2010年11月5日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)No.61/410,729的優(yōu)先權(quán)，其公開內(nèi)容全部通過引用方式并入本文中。

發(fā)明領(lǐng)域

本申請(qǐng)涉及包含將電磁輻射由紅外或近紅外波長(zhǎng)上轉(zhuǎn)換成可見光譜的鑭系元素?fù)诫s納米粒子的組合物以及使用鑭系元素?fù)诫s納米粒子遞送光以激活在神經(jīng)元中表達(dá)的光響應(yīng)性視蛋白(light-responsive opsin)和選擇性改變神經(jīng)元的膜極化狀態(tài)的方法。

背景

光遺傳學(xué)是用于控制活組織的靶向細(xì)胞中，甚至在自由移動(dòng)哺乳動(dòng)物和其它動(dòng)物內(nèi)特異性事件的遺傳和光學(xué)方法和與完整生物系統(tǒng)運(yùn)行同步所需的時(shí)間精度(毫秒時(shí)間量程)的組合。光遺傳學(xué)的標(biāo)志是將快速光響應(yīng)性視蛋白通道或泵蛋白引至靶神經(jīng)元細(xì)胞的質(zhì)膜，這使得可在時(shí)間上精確操作神經(jīng)元膜電位，同時(shí)通過使用特異性靶向機(jī)制來維持細(xì)胞類型分辨率?？捎糜谘芯可窠?jīng)系統(tǒng)功能的微生物視蛋白有鹽細(xì)菌視紫紅質(zhì)(halorhodopsin)(NpHR)，在照射時(shí)用于促進(jìn)膜超極化；和光敏感通道(channelrhodopsin)，在暴露于光時(shí)用于使膜去極化。在短短數(shù)年間，光遺傳學(xué)領(lǐng)域已經(jīng)深化對(duì)特異性細(xì)胞類型如何體內(nèi)作用于生物組織(例如神經(jīng)回路)的功能的基本科學(xué)理解。而且，在臨床方面，光遺傳學(xué)驅(qū)動(dòng)的研究已引起對(duì)復(fù)雜哺乳動(dòng)物行為例如憂慮、記憶、恐懼和成癮的潛在神經(jīng)機(jī)制的深刻理解。

盡管具有這些進(jìn)展，但在動(dòng)物中使用光遺傳學(xué)方法面臨著需要將動(dòng)物拴至光源或者需要將光源通過外科手術(shù)植入動(dòng)物體內(nèi)的重大缺陷的阻礙。而且，當(dāng)光遺傳學(xué)方法用于改變腦中神經(jīng)元的功能時(shí)，必須將光源接近這些神經(jīng)元放置。這需要在動(dòng)物顱骨上鉆孔，并且當(dāng)目標(biāo)腦區(qū)域位于腦自身內(nèi)深處時(shí)也會(huì)遇到實(shí)際困難。由于光較差地通過神經(jīng)組織，這需要將導(dǎo)光纖維光源插入至腦內(nèi)，這可導(dǎo)致對(duì)周圍腦組織的非預(yù)期損傷。

因此，需要非侵入地將光遞送至位于動(dòng)物的腦和周圍神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的在神經(jīng)細(xì)胞的質(zhì)膜上表達(dá)光響應(yīng)性視蛋白的神經(jīng)元的方法。

在本說明書中，參考了出版物(例如，科技論文)、專利申請(qǐng)、專利等，所有這些據(jù)此全部通過引用方式并入本文中。

發(fā)明概述

本文提供通過使用能夠?qū)㈦姶泡椛鋸呐c紅外(IR)或近紅外(NIR)光譜相關(guān)的波長(zhǎng)上轉(zhuǎn)成與可見光相關(guān)的波長(zhǎng)的納米粒子而非侵入地將光遞送至在神經(jīng)質(zhì)膜上表達(dá)光響應(yīng)性視蛋白的神經(jīng)元的組合物和方法。

因此，本文提供使個(gè)體中神經(jīng)細(xì)胞的質(zhì)膜去極化的方法，其包括：(a)接近神經(jīng)細(xì)胞放置多種鑭系元素?fù)诫s納米粒子；以及(b)將多種納米粒子暴露于在紅外(IR)或近紅外(NIR)光譜中的電磁輻射，其中通過納米粒子將在IR或NIR光譜中的電磁輻射上轉(zhuǎn)換成在可見光譜中的光，并且其中光響應(yīng)性視蛋白在神經(jīng)細(xì)胞的質(zhì)膜上表達(dá)并且通過在可見光譜中的光對(duì)視蛋白的激活誘導(dǎo)質(zhì)膜的去極化。

在其它方面，本文提供使個(gè)體中神經(jīng)細(xì)胞的質(zhì)膜去極化的方法，其包括：(a)向個(gè)體施用編碼光響應(yīng)性視蛋白的多核苷酸，其中光響應(yīng)性蛋白在個(gè)體中的神經(jīng)細(xì)胞的質(zhì)膜上表達(dá)，并且當(dāng)使用光照射時(shí)視蛋白能夠誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞的膜去極化；(b)接近神經(jīng)細(xì)胞施用多種鑭系元素?fù)诫s納米粒子；以及(c)將多種納米粒子暴露于在紅外(IR)或近紅外(NIR)光譜中的電磁輻射，其中將在IR或NIR光譜中的電磁輻射上轉(zhuǎn)換成在可見光譜中的光并且通過在可見光譜中的光對(duì)視蛋白的激活誘導(dǎo)質(zhì)膜的去極化。

在一些方面，本文提供使個(gè)體中神經(jīng)細(xì)胞的質(zhì)膜超極化的方法，其包括：(a)接近神經(jīng)細(xì)胞放置多種鑭系元素?fù)诫s納米粒子；以及(b)將多種納米粒子暴露于在紅外(IR)或近紅外(NIR)光譜中的電磁輻射，其中通過納米粒子將在IR或NIR光譜中的電磁輻射上轉(zhuǎn)換成在可見光譜中的光，并且其中光響應(yīng)性視蛋白在質(zhì)膜上表達(dá)并且通過可見光譜中的光對(duì)視蛋白的激活誘導(dǎo)質(zhì)膜的超極化。

在其它方面，本文提供使個(gè)體中神經(jīng)細(xì)胞的質(zhì)膜超極化的方法，其包括：(a)向個(gè)體施用編碼光響應(yīng)性視蛋白的多核苷酸，其中光響應(yīng)性蛋白在個(gè)體中神經(jīng)細(xì)胞的質(zhì)膜上表達(dá)，并且當(dāng)使用光照射時(shí)視蛋白能夠誘導(dǎo)所述神經(jīng)細(xì)胞的膜超極化；(b)接近神經(jīng)細(xì)胞施用多種鑭系元素?fù)诫s納米粒子；以及(c)將多種納米粒子暴露于在紅外(IR)或近紅外(NIR)光譜中的電磁輻射，其中將在IR或NIR光譜中的電磁輻射上轉(zhuǎn)換成在可見光譜中的光并且通過在可見光譜中的光對(duì)視蛋白的激活誘導(dǎo)質(zhì)膜的超極化。

本公開涉及包括用于體內(nèi)深度遞送光的上轉(zhuǎn)換的裝置和方法。本公開的各方面通常涉及使用近紅外光至可見光譜的上轉(zhuǎn)換將光體內(nèi)遞送至組織以及與本文所討論的申請(qǐng)相關(guān)的方法。

本公開的某些方面涉及植入活組織內(nèi)的光源。來自納米粒子溶液的納米粒子錨定至靶細(xì)胞群，該靶細(xì)胞群包括表達(dá)光響應(yīng)性通道/視蛋白細(xì)胞。納米粒子被構(gòu)造成通過發(fā)射第二不同波長(zhǎng)的光來響應(yīng)第一波長(zhǎng)的光的接收。例如，納米粒子可上轉(zhuǎn)換接收的光，并且因而發(fā)射更高頻率的光。

本公開的實(shí)施方案涉及對(duì)目標(biāo)位點(diǎn)注射攜帶視蛋白基因的病毒和納米粒子溶液。病毒導(dǎo)致在目標(biāo)位點(diǎn)處的靶細(xì)胞群表達(dá)視蛋白基因。各種不同光源是可能的。使用不同波長(zhǎng)尤其可用于促進(jìn)不同(外部)光源的使用，例如，某些波長(zhǎng)表現(xiàn)出通過腦或其它處組織吸收相應(yīng)降低。

與本公開的特定實(shí)施方案一致，將發(fā)光二極管("LED")放置在已經(jīng)薄化的部分顱骨上。將LED放置在皮膚下顱骨的薄化部分附近，并至少部分根據(jù)靶細(xì)胞群的位置來選擇LED的位置和/或定向。例如，可將LED放置以減少LED和靶細(xì)胞群之間的距離以及相應(yīng)地定向。

在本公開的某些更具體的方面，來自LED的光穿過周圍組織至納米粒子。當(dāng)(近)紅外光擊中納米粒子時(shí)，納米粒子吸收紅外(IR)光子以及射出可見光子。然后通過表達(dá)在靶細(xì)胞群內(nèi)的視蛋白來吸收可見光子，這導(dǎo)致其中的應(yīng)答(例如，觸發(fā)神經(jīng)刺激或抑制)。

通過類似于起搏器中使用的那些電池來為L(zhǎng)ED供電。LED可射出紅外光譜中的光，并且特別是介于700nm-1000nm之間，其可穿過顱骨和介于中間的組織。由納米粒子射出的光具有中心為450-550nm之間的光譜。射出的光的波長(zhǎng)取決于納米粒子的性質(zhì)。

以上綜述并不旨在描述本公開的每一個(gè)示出的實(shí)施方案或者每一種實(shí)施方式。

附圖簡(jiǎn)述

鑒于以下描述和附圖可更充分地理解各示例性實(shí)施方案，其中：

圖1顯示與本公開的實(shí)施方案一致的顱骨的剖視圖。

圖2顯示與本公開的實(shí)施方案一致的靶神經(jīng)元的光遞送。

圖3示出與本公開的實(shí)施方案一致的使用多種光源的系統(tǒng)。

盡管本公開可具有各種修改形式和替代形式，但其細(xì)節(jié)已在附圖中通過舉例的方式示出并將進(jìn)行詳細(xì)描述。然而，應(yīng)當(dāng)理解，目的不是將本公開限制于所描述的特定實(shí)施方案。相反，目的是涵蓋落入包括權(quán)利要求限定的各方面的本公開范圍內(nèi)的修改形式、等效形式和替代形式。

發(fā)明詳述

本發(fā)明尤其提供用于將光遞送至在神經(jīng)細(xì)胞的質(zhì)膜上表達(dá)一種或多種光響應(yīng)性視蛋白的那些神經(jīng)細(xì)胞的組合物和方法。發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，將紅外(IR)或近紅外(NIR)電磁輻射轉(zhuǎn)換為對(duì)應(yīng)可見光譜的波長(zhǎng)的摻雜鑭系金屬(例如，釓)的納米粒子可用于激活在神經(jīng)細(xì)胞的質(zhì)膜上的光響應(yīng)性視蛋白以及選擇性改變細(xì)胞的膜極化狀態(tài)。與可見光不同，IR或NIR電磁能容易地穿透生物組織。例如，NIR可穿透距離至多4厘米的生物組織(Heyward&DaleWagner,"Applied Body Composition Assessment"，第2版(2004),100頁)。作為波長(zhǎng)函數(shù)用于計(jì)算光透射的某些公式公開于美國(guó)專利No.7,043,287中，其內(nèi)容通過引用方式并入本文中。類似地，美國(guó)專利申請(qǐng)公開No.2007/0027411公開了近紅外低水平激光治療光穿透身體至3-5cm的深度。因此，在光遺傳學(xué)方法中使用電磁輻射的IR或NIR光源可減少直接接近神經(jīng)細(xì)胞放置光源的需求。具體而言，對(duì)于在腦中光遺傳技術(shù)，組合IR或NIR電磁能使用鑭系元素?fù)诫s納米粒子使得可激活視蛋白，而不需穿刺顱骨或?qū)?dǎo)光纖維光源至插入腦內(nèi)。類似地，在周圍神經(jīng)系統(tǒng)中，通過放置在皮膚下或者正對(duì)皮膚放置的IR或NIR源可激活表達(dá)視蛋白的神經(jīng)。

通用技術(shù)

除非另有說明，本發(fā)明的實(shí)施將采用分子生物學(xué)、微生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、生物化學(xué)、核酸化學(xué)、免疫學(xué)和生理學(xué)的常規(guī)技術(shù)，這些均是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的。這些技術(shù)完整解釋在以下文獻(xiàn)中，例如，Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第二版(Sambrook等，1989)和Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第三版(Sambrook和Russel,2001),(本文統(tǒng)稱為“Sambrook”)；Current Protocols in Molecular Biology(F.M.Ausubel等編輯，1987,包括2001年內(nèi)的增刊)；PCR:The Polymerase Chain Reaction,(Mullis等編輯，1994)；Harlow和Lane(1988),Antibodies,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Publications,New York；Harlow和Lane(1999),Using Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY(本文統(tǒng)稱為“Harlow和Lane”)；Beaucage等編輯，Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry,John Wiley&Sons,Inc.,New York,2000)，Handbook of Experimental Immunology,第4版(D.M.Weir&C.C.Blackwell編輯，Blackwell Science Inc.,1987)，以及Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells(J.M.Miller&M.P.Calos編輯，1987)。其它可使用的參考文獻(xiàn)包括Harrison’s Principles of Internal Medicine(McGraw Hill；J.Isseleacher等編輯)和Lanthanide Luminescence:Photophysical,Analytical and Biological Aspects(Springer-Verlag,Berlin,Heidelberg；Hanninen&Harma編輯，2011)。

定義

如本文所使用，“紅外”或“近紅外”或“紅外光”或者“近紅外光”是指由0.74μm處可見紅光的標(biāo)稱邊緣延伸至300μm測(cè)定的在可見光正上面的光譜中的電磁輻射。這些波長(zhǎng)對(duì)應(yīng)約1至400THz的頻率范圍。具體而言，“近紅外”或“近紅外光”也指在通過水吸收定義的波長(zhǎng)中測(cè)定為0.75-1.4μm的電磁輻射。

“可見光”定義為波長(zhǎng)介于380nm和750nm之間的電磁輻射。通常，包括光的“電磁輻射”由諸如具有高熱能的分子(或相鄰原子)部分、或者原子(或分子)中電子的帶點(diǎn)粒子運(yùn)動(dòng)(振動(dòng))加速和減速或者變化生成。

如本文所使用的術(shù)語“納米粒子”也可指納米晶體、納米棒、納米簇、簇、粒子、點(diǎn)、量子點(diǎn)、小粒子和納米結(jié)構(gòu)的材料。術(shù)語“納米粒子”涵蓋與量子尺寸效應(yīng)相關(guān)的具有小于100nm的小尺寸(通常但不必要)的所有材料。

“個(gè)體”是哺乳動(dòng)物，包括人。哺乳動(dòng)物包括但不限于農(nóng)場(chǎng)動(dòng)物、娛樂動(dòng)物、寵物、靈長(zhǎng)類、小鼠和大鼠。個(gè)體也包括伴侶動(dòng)物，其包括但不限于狗和貓。在一些方面，個(gè)體是非人動(dòng)物，例如哺乳動(dòng)物。在另一方面，個(gè)體是人。

如本文所使用，除非另有說明，單數(shù)形式“一個(gè)”、“一種”、和“所述”包括復(fù)數(shù)形式。

本說明書中通篇所給出的每一最大數(shù)值限值包括每一較小數(shù)量限值，如同這些較小數(shù)量限值在本文中明確寫出。本說明書中給出的每一最小數(shù)量限值將包括每一較大數(shù)量限值，如同這些較大數(shù)量限值在本文中明確寫出。本說明書所給出的每一數(shù)值范圍包括落入這些更寬數(shù)值范圍內(nèi)的每一較窄數(shù)值范圍，如同這些較窄數(shù)值范圍在本文中全部明確寫出。

鑭系元素?fù)诫s納米粒子

在材料科學(xué)中，摻雜通常用于將特定種類的離子或原子合并至主晶格芯體結(jié)構(gòu)內(nèi)以產(chǎn)生具有新的和可使用性能的混合材料。當(dāng)合成納米粒子時(shí)，摻雜不僅可影響粒子的尺寸和形狀，也可影響其它性能，例如將近紅外(NIR)激發(fā)轉(zhuǎn)換成光的可見發(fā)射的能力。

鑭系金屬或鑭系元素(也稱為“稀土”金屬)是原子序數(shù)57(鑭)至71(镥)的元素，并且由于它們的化學(xué)類似性通常包括釔(原子序數(shù)39)和鈧(原子序數(shù)21)。鑭系離子表現(xiàn)出獨(dú)特發(fā)光性能，其包括通過稱為光子上轉(zhuǎn)換的過程將近紅外長(zhǎng)波長(zhǎng)激發(fā)轉(zhuǎn)換成較短可見波長(zhǎng)的能力。鑭系元素通常以三價(jià)陽離子存在，在這種情況下它們的電子構(gòu)型是(Xe)4f，其中n從1(Ce³⁺)至14(Lu³⁺)變化。在f-流形內(nèi)躍遷是鑭系離子的許多光子物理性質(zhì)的原因，例如長(zhǎng)時(shí)間發(fā)光和尖銳吸收以及發(fā)射譜線。f-電子通過填充的5s和5p軌道隔離外部干擾，因而導(dǎo)致線狀光譜。此外，鑭系元素的f-f電子躍遷是LaPorte禁止的，這導(dǎo)致微秒至毫秒范圍的長(zhǎng)激發(fā)狀態(tài)期。

在一些實(shí)施方案中，任何已知方法可用于合成鑭系元素?fù)诫s納米粒子。這些方法是本領(lǐng)域眾所周知的(參見，例如，Xu&Li,2007,Clin Chem.,53(8):1503-10；Wang等，2010,Nature,463(7284):1061-5；美國(guó)專利申請(qǐng)公開No.:2003/0030067和2010/0261263；以及美國(guó)專利No.:7,550,201，每篇文獻(xiàn)的公開內(nèi)容通過引用方式全部并入本文中)。例如，在一些實(shí)施方案中，使用NaYF₄介電芯體可合成鑭系元素?fù)诫s納米棒，其中在邊攪拌下將0.3g NaOH的DI水溶液(1.5ml)與5ml乙醇和5ml油酸混合。向所得混合物中選擇性加入2ml的RECl₃(0.2M,RE＝Y(jié)、Yb、Er、Gd、Sm、Nd或La)以及1ml的NH₄F(2M)。然后將溶液轉(zhuǎn)移至高壓滅菌器內(nèi)，并在200℃下加熱2h。然后通過離心獲得納米棒，使用水和乙醇洗滌數(shù)次，最后重新分散在環(huán)己烷中。在另一非限制性例子中，使用添加至含有3ml油酸和7ml的1-十八烯的燒瓶中的在甲醇中2ml的RECl₃(0.2M,RE＝Y(jié)、Yb、Er、Gd、或Tm)可合成納米粒子。然后將該溶液加熱至160℃達(dá)30min，然后冷卻至室溫。此后，將NH₄F(1.6mmol)和NaOH(1mmol)的5ml甲醇溶液加入，并將溶液攪拌30min。在蒸發(fā)甲醇之后，接著在氬氣下將溶液加熱至300℃達(dá)1.5h并冷卻至室溫。通過加入乙醇來沉淀所得納米粒子，通過離心收集，使用甲醇和乙醇洗滌數(shù)次，并最終重新分散在環(huán)己烷中。

在一個(gè)實(shí)施方案中，鑭系元素?fù)诫s納米粒子芯體的材料可包括大量介電材料。在各實(shí)施方案中，介電芯體可包括鑭系元素?fù)诫s氧化物材料。鑭系元素包括鑭(La)、鈰(Ce)、鐠(Pr)、釹(Nd)、钷(Pm)、釤(Sm)、銪(Eu)、釓(Gd)、鋱(Tb)、鏑(Dy)、鈥(Ho)、鉺(Er)、銩(Tm)、鐿(Yb)、和镥(Lu)。其它合適的介電芯體材料包括非鑭系元素，例如釔(Y)和鈧(Sc)。因此，合適的介電芯體材料包括但不限于Y₂O₃、Y₂O₂S、NaYF₄、NaYbF4、Na摻雜的YbF₃、YAG、YAP、Nd₂O₃、LaF₃、LaCl₃、La₂O₃、TiO₂、LuPO₄、YVO₄、YbF₃、YF₃、或SiO₂。在一個(gè)實(shí)施方案中，介電納米粒子芯體是NaYF₄。使用一種或多種Er、Eu、Yb、Tm、Nd、Tb、Ce、Y、U、Pr、La、Gd和其它稀土種類或其組合可摻雜這些介電芯體。在一個(gè)實(shí)施方案中，使用Gd來摻雜介電芯體材料。在另一個(gè)實(shí)施方案中，鑭系元素?fù)诫s納米粒子包含NaYF₄:Yb/X/Gd，其中X是Er、Tm、或Er/Tm。在一些實(shí)施方案中，鑭系元素?fù)诫s納米粒子包含使用約0mol％、約5mol％、約10mol％、約15mol％、約20mol％、約25mol％、約30mol％、約35mol％、約40mol％、約45mol％、約50mol％、約55mol％、約60mol％(包括介于這些值之間的任意mol％)中的任一摩爾百分比的Gd³⁺離子摻雜的NaYF₄:Yb/Er(18/2mol％)介電芯體。在其它實(shí)施方案中，鑭系元素?fù)诫s納米粒子包含使用約0mol％、約5mol％、約10mol％、約15mol％、約20mol％、約25mol％、或約30mol％(包括介于這些值之間的任意mol％)中的任一摩爾百分比的Yb³⁺離子摻雜的NaYF₄:Yb/Er(18/2mol％)介電芯體。在其它實(shí)施方案中，鑭系元素?fù)诫s納米粒子包含使用約0mol％、約5mol％、約10mol％、約15mol％、約20mol％、約25mol％、或約30mol％(包括介于這些值之間的任意mol％)中的任一摩爾百分比的Er³⁺離子摻雜的NaYF₄:Yb/Er(18/2mol％)介電芯體。在其它實(shí)施方案中，鑭系元素?fù)诫s納米粒子包含使用約0mol％、約5mol％、約10mol％、約15mol％、約20mol％、約25mol％、或約30mol％(包括介于這些值之間的任意mol％)中的任一摩爾百分比的Tm³⁺離子摻雜的NaYF₄:Yb/Er(18/2mol％)介電芯體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，鑭系元素?fù)诫s納米粒子選自NaYF₄:Yb/Er/Gd(18/2/5mol％)；NaYF₄:Yb/Tm/Er/Gd(20/0.2/0.1/5mol％)；NaYF₄:Yb/Tm/Er/Gd(20/0.2/0.05/5mol％)；和NaYF₄:Yb/Tm/Gd(20/0.2/5mol％)。

在一些方面，使本文公開的鑭系元素?fù)诫s納米粒子與一種或多種遞送分子綴合以將它們靶向至在目標(biāo)神經(jīng)細(xì)胞(例如，在它的質(zhì)膜上表達(dá)一種或多種光響應(yīng)性視蛋白的神經(jīng)細(xì)胞)的表面上表達(dá)的一種或多種分子。這些可包括但不限于抗體或其片段、小分子、以及凝集素或者任何其它碳水化合物基序。遞送分子確保鑭系元素?fù)诫s納米粒子保持緊密接近視蛋白以使得在上轉(zhuǎn)換IR或NIR電磁輻射時(shí)可激活。綴合納米粒子的抗體是本領(lǐng)域眾所周知的(參見，例如，美國(guó)專利申請(qǐng)公開No.:2010/0209352和2008/0267876，其內(nèi)容據(jù)此各自通過引用方式全部并入本文中)。

在另一方面，可將鑭系元素?fù)诫s納米粒子嵌入或包埋在生物相容性材料內(nèi)，將其通過外科手術(shù)放置接近于(例如相鄰或周圍)目標(biāo)神經(jīng)細(xì)胞(例如在它的質(zhì)膜上表達(dá)一種或多種光響應(yīng)性視蛋白的神經(jīng)細(xì)胞)。在一些實(shí)施方案中，生物相容性材料透明，因而通過鑭系元素?fù)诫s納米粒子的IR或NIR電磁輻射的上轉(zhuǎn)換產(chǎn)生的可見光可到達(dá)在目標(biāo)神經(jīng)細(xì)胞的表面上表達(dá)的光響應(yīng)性視蛋白。用于嵌入或包埋鑭系元素?fù)诫s納米粒子的生物相容性材料可包括但不限于Ioplex材料和其它水凝膠，例如基于2-羥乙基甲基丙烯酸酯或丙烯酰胺的那些；以及聚醚聚氨酯脲(PEUU)，包括Biomer(Ethicon Corp.)、Avcothane(Avco-Everrett Laboratories)、聚乙烯、聚丙烯、聚四氟乙烯(Gore-Tex^TM)、聚(氯乙烯)、聚二甲基硅氧烷、乙烯-丙烯酸共聚物、針織或編織滌綸、聚酯-聚氨酯、聚氨酯、聚碳酸酯聚氨酯(Corethane^TM)、聚酰胺(Nylon)和聚苯乙烯。在一個(gè)實(shí)施方案中，生物相容性材料可以為聚二甲基硅氧烷(PDMS)?？捎糜谇度牒?或包埋本文所公開的鑭系元素?fù)诫s納米粒子的另外的化合物描述在Kirk-Othmer,Encyclopedia of Chemical Technology，第3版，1982(第19卷，275-313頁，和第18卷，219-2220頁)；van der Giessen等，1996,Circulation,94:1690-1997(1996)；美國(guó)專利申請(qǐng)公開No.:2011/0054305，和美國(guó)專利No.:6,491,965，其內(nèi)容據(jù)此各自通過引用方式全部并入本文中。

光響應(yīng)性視蛋白

本文提供用于選擇性超極化或去極化中樞或周圍神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)元的基于光遺傳學(xué)的組合物。光遺傳學(xué)是指用于控制活組織的靶向細(xì)胞中，甚至在自由移動(dòng)哺乳動(dòng)物和其它動(dòng)物內(nèi)特異性事件的遺傳和光學(xué)方法和與完整生物系統(tǒng)運(yùn)行同步所需的時(shí)間精度(毫秒時(shí)間量程)的組合。光遺傳學(xué)需要將快速光響應(yīng)性通道或泵蛋白引至靶神經(jīng)元細(xì)胞的質(zhì)膜，這使得可在時(shí)間上精確操作神經(jīng)元膜電位，同時(shí)通過使用特異性靶向機(jī)制來維持細(xì)胞類型分辨率。

在本發(fā)明中可使用的光響應(yīng)性視蛋白包括通過光在神經(jīng)元中誘導(dǎo)超極化的視蛋白并且通過光在神經(jīng)元中誘導(dǎo)去極化的視蛋白。視蛋白的例子顯示在以下表1和2中。

表1顯示在整個(gè)可見光譜中用于抑制細(xì)胞活性的經(jīng)鑒定的視蛋白：

表2顯示在整個(gè)可見光譜中用于激發(fā)和調(diào)制的經(jīng)鑒定的視蛋白：

如本文所使用，光響應(yīng)性視蛋白(例如NpHR、BR、AR、GtR3、Mac、ChR2、VChR1、DChR和ChETA)包括天然存在蛋白和功能性變體、片段、包含片段的融合蛋白或者全長(zhǎng)蛋白。例如，可缺失信號(hào)肽。變體可具有與天然存在的蛋白序列至少約90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％同一性中任一項(xiàng)的氨基酸序列。功能性變體可具有如天然存在蛋白相同或類似超極化功能或去極化功能。

增加的細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)氨基酸基序

本公開提供通過加入增強(qiáng)至哺乳動(dòng)物細(xì)胞的質(zhì)膜的轉(zhuǎn)運(yùn)的一種或多種氨基酸序列基序?qū)υ诩?xì)胞中表達(dá)的光響應(yīng)性視蛋白的修飾。具有來源于進(jìn)化上更簡(jiǎn)單生物體的組分的光響應(yīng)性視蛋白可以不通過哺乳動(dòng)物細(xì)胞來表達(dá)或耐受、或者當(dāng)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中高水平表達(dá)時(shí)可表現(xiàn)出破壞的亞細(xì)胞定位。因此，在一些實(shí)施方案中，可將在細(xì)胞中表達(dá)的光響應(yīng)性視蛋白與選自信號(hào)肽、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)輸出信號(hào)、膜運(yùn)輸信號(hào)、和/或N-末端高爾基輸出信號(hào)的一種或多種氨基酸序列基序融合?？蓪⒃鰪?qiáng)光響應(yīng)性視蛋白至哺乳動(dòng)物細(xì)胞的質(zhì)膜的轉(zhuǎn)運(yùn)的一種或多種氨基酸序列基序與光響應(yīng)性視蛋白的N-末端、C-末端或者N-和C-末端融合。任選地，通過接頭可將光響應(yīng)性視蛋白和一種或多種氨基酸序列基序分離。在一些實(shí)施方案中，通過加入增強(qiáng)蛋白至細(xì)胞質(zhì)膜的轉(zhuǎn)運(yùn)的運(yùn)輸信號(hào)(ts)可修飾光響應(yīng)性視蛋白。在一些實(shí)施方案中，運(yùn)輸信號(hào)可來源于人內(nèi)向整流鉀通道Kir2.1的氨基酸序列。在其它實(shí)施方案中，運(yùn)輸信號(hào)可包含氨基酸序列KSRITSEGEYIPLDQIDINV。

可增強(qiáng)光響應(yīng)性視蛋白至細(xì)胞的質(zhì)膜的轉(zhuǎn)運(yùn)的另外的蛋白基序描述在美國(guó)專利申請(qǐng)公開No.2009/0093403中，其全部通過引用方式并入本文中。在一些實(shí)施方案中，信號(hào)肽序列可在蛋白質(zhì)中缺失或者使用來自不同蛋白質(zhì)的信號(hào)肽序列來取代。

光響應(yīng)性氯泵

在一些方面，本文所描述的光響應(yīng)性視蛋白是光響應(yīng)性氯泵。在本文所提供的方法的一些方面，光響應(yīng)性氯泵的鹽細(xì)菌視紫紅質(zhì)家族的一個(gè)或多個(gè)成員在中樞神經(jīng)系統(tǒng)和周圍神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)元的質(zhì)膜上表達(dá)。

在一些方面，中樞神經(jīng)系統(tǒng)或周圍神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)細(xì)胞的質(zhì)膜上表達(dá)的所述一種或多種光響應(yīng)性氯泵蛋白可來源于鹽堿古菌。在一些實(shí)施方案中，當(dāng)使用琥珀或紅光照射光響應(yīng)性氯泵蛋白時(shí)，光響應(yīng)性氯泵蛋白可響應(yīng)琥珀光和紅光，并可介導(dǎo)在中間神經(jīng)元中的超極化電流。可激活光響應(yīng)性氯泵的光的波長(zhǎng)可介于約580至約630nm之間。在一些實(shí)施方案中，光的波長(zhǎng)可以為約590nm或者光可具有大于約630nm(例如，小于約740nm)的波長(zhǎng)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，光具有約630nm的波長(zhǎng)。在一些實(shí)施方案中，當(dāng)暴露于光的連續(xù)脈沖時(shí)，光響應(yīng)性氯泵蛋白可使神經(jīng)膜超極化至少約90分鐘。在一些實(shí)施方案中，光響應(yīng)性氯泵蛋白可包含與SEQ ID NO:1中所示序列至少約90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。此外，光響應(yīng)性氯泵蛋白可包含引入天然氨基酸序列的取代、缺失和/或插入以增加或降低對(duì)光的靈敏度、增加或降低對(duì)特定波長(zhǎng)的光的靈敏度、和/或增加或降低光響應(yīng)性蛋白調(diào)節(jié)細(xì)胞的質(zhì)膜的極化狀態(tài)的能力。在一些實(shí)施方案中，光響應(yīng)性氯泵蛋白含有一種或多種保守型氨基酸取代。在一些實(shí)施方案中，光響應(yīng)性蛋白含有一種或多種非保守型氨基酸取代。含有引入天然氨基酸序列內(nèi)的取代、缺失、和/或插入的光響應(yīng)性蛋白合適地保留超極化響應(yīng)光的神經(jīng)元細(xì)胞的質(zhì)膜的能力。

此外，在其它方面，光響應(yīng)性氯泵蛋白可含有與SEQ ID NO:1中所示序列至少約90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％同一性的核心氨基酸序列以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)輸出信號(hào)?？蓪⒃揈R輸出信號(hào)與核心氨基酸序列的C-末端融合或者可將其與核心氨基酸序列的N-末端融合。在一些實(shí)施方案中，通過接頭來連接ER輸出信號(hào)與核心氨基酸序列。接頭可包含長(zhǎng)度為約5、10、20、30、40、50、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、400、或500個(gè)氨基酸中的任一種。接頭可進(jìn)一步包含熒光蛋白，例如但不限于黃色熒光蛋白、紅色熒光蛋白、綠色熒光蛋白、或者藍(lán)綠色熒光蛋白。在一些實(shí)施方案中，ER輸出信號(hào)可包含氨基酸序列FXYENE，其中X可以為任何氨基酸。在另一個(gè)實(shí)施方案中，ER輸出信號(hào)可包含氨基酸序列VXXSL，其中X可以為任何氨基酸。在一些實(shí)施方案中，ER輸出信號(hào)可包含氨基酸序列FCYENEV。

在其它方面，本文所提供的光響應(yīng)性氯泵蛋白可包含在細(xì)胞膜上表達(dá)的光響應(yīng)性蛋白，其中蛋白包含與SEQ ID NO:1中所示的序列至少約90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％同一性的核心氨基酸序列以及運(yùn)輸信號(hào)(例如，其可增強(qiáng)光響應(yīng)性氯泵蛋白至質(zhì)膜的轉(zhuǎn)運(yùn))?？蓪⑦\(yùn)輸信號(hào)與核心氨基酸序列的C-末端融合或者可將其與核心氨基酸序列的N-末端融合。在一些實(shí)施方案中，通過接頭可連接運(yùn)輸信號(hào)與核心氨基酸序列，該接頭可包含長(zhǎng)度為約5、10、20、30、40、50、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、400、或500個(gè)氨基酸中任一種。接頭可進(jìn)一步包含熒光蛋白，例如但不限于黃色熒光蛋白、紅色熒光蛋白、綠色熒光蛋白、或者藍(lán)綠色熒光蛋白。在一些實(shí)施方案中，運(yùn)輸信號(hào)可來源于人內(nèi)向整流鉀通道Kir2.1的氨基酸序列。在其它實(shí)施方案中，運(yùn)輸信號(hào)可包含氨基酸序列KSRITSEGEYIPLDQIDINV。

在一些方面，光響應(yīng)性氯泵蛋白可包含與SEQ ID NO:1中所示序列至少約90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％同一性的核心氨基酸序列以及選自ER輸出信號(hào)、信號(hào)肽、和膜運(yùn)輸信號(hào)的增強(qiáng)至哺乳動(dòng)物細(xì)胞的質(zhì)膜的轉(zhuǎn)運(yùn)的至少一種(例如一種、兩種、三種或多種)氨基酸序列基序。在一些實(shí)施方案中，光響應(yīng)性氯泵蛋白包含N-末端信號(hào)肽、C-末端ER輸出信號(hào)、和C-末端運(yùn)輸信號(hào)。在一些實(shí)施方案中，通過接頭可連接C-末端ER輸出信號(hào)與C-末端運(yùn)輸信號(hào)。接頭可包含長(zhǎng)度為約5、10、20、30、40、50、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、400、或500個(gè)氨基酸中的任一種。接頭可進(jìn)一步包含熒光蛋白，例如但不限于黃色熒光蛋白、紅色熒光蛋白、綠色熒光蛋白、或者藍(lán)綠色熒光蛋白。在一些實(shí)施方案中，ER輸出信號(hào)可比運(yùn)輸信號(hào)更加靠近C-端。在其它實(shí)施方案中，運(yùn)輸信號(hào)比ER輸出信號(hào)更加靠近C-端。在一些實(shí)施方案中，信號(hào)肽包含氨基酸序列MTETLPPVTESAVALQAE。在另一個(gè)實(shí)施方案中，光響應(yīng)性氯泵蛋白包含與SEQ ID NO:2至少95％同一性的氨基酸序列。

而且，在其它方面，光響應(yīng)性氯泵蛋白可包含與SEQ ID NO:1中所示序列至少約90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％同一性的核心氨基酸序列，其中SEQ ID NO:1的N-末端信號(hào)肽缺失或被取代。在一些實(shí)施方案中，可使用其它信號(hào)肽(例如，來自其它視蛋白的信號(hào)肽)。光響應(yīng)性蛋白可進(jìn)一步包含本文所描述的ER轉(zhuǎn)運(yùn)信號(hào)和/或膜運(yùn)輸信號(hào)。在一些實(shí)施方案中，光響應(yīng)性氯泵蛋白包含與SEQ ID NO:3至少95％同一性的氨基酸序列。

在一些實(shí)施方案中，光響應(yīng)性視蛋白是包含與SEQ ID NO:1中所示序列至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列的NpHR視蛋白。在一些實(shí)施方案中，NpHR視蛋白進(jìn)一步包含內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)輸出信號(hào)和/或膜運(yùn)輸信號(hào)。例如，NpHR視蛋白包含與SEQ ID NO:1中所示序列至少95％同一性的氨基酸序列以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)輸出信號(hào)。在一些實(shí)施方案中，通過接頭來連接與SEQ ID NO:1中所示序列至少95％同一性氨基酸序列與ER輸出信號(hào)。在一些實(shí)施方案中，ER輸出信號(hào)包含氨基酸序列FXYENE，其中X可以為任何氨基酸。在另一個(gè)實(shí)施方案中，ER輸出信號(hào)包含氨基酸序列VXXSL，其中X可以為任何氨基酸。在一些實(shí)施方案中，ER輸出信號(hào)包含氨基酸序列FCYENEV。在一些實(shí)施方案中，NpHR視蛋白包含與SEQ ID NO:1中所示序列至少95％同一性的氨基酸序列、ER輸出信號(hào)、和膜運(yùn)輸信號(hào)。在其它實(shí)施方案中，NpHR視蛋白由N-末端至C-末端包含與SEQ ID NO:1中所示序列至少95％同一性的氨基酸序列、ER輸出信號(hào)、和膜運(yùn)輸信號(hào)。在其它實(shí)施方案中，NpHR視蛋白由N-末端至C-末端包含與SEQ ID NO:1中所示序列至少95％同一性的氨基酸序列、膜運(yùn)輸信號(hào)、和ER輸出信號(hào)。在一些實(shí)施方案中，膜運(yùn)輸信號(hào)來源于人內(nèi)向整流鉀通道Kir2.1的氨基酸序列。在一些實(shí)施方案中，膜運(yùn)輸信號(hào)包含氨基酸序列K S R I T S E G E Y I P L D Q I D I N V。在一些實(shí)施方案中，通過接頭來連接膜運(yùn)輸信號(hào)和與SEQ ID NO:1中所示序列至少95％同一性的氨基酸序列。在一些實(shí)施方案中，通過接頭來連接膜運(yùn)輸信號(hào)與ER輸出信號(hào)。接頭可包含長(zhǎng)度為5、10、20、30、40、50、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、400、或500個(gè)氨基酸中的任一種。接頭可進(jìn)一步包含熒光蛋白，例如但不限于黃色熒光蛋白、紅色熒光蛋白、綠色熒光蛋白、或者藍(lán)綠色熒光蛋白。在一些實(shí)施方案中，光響應(yīng)性視蛋白進(jìn)一步包含N-末端信號(hào)肽。在一些實(shí)施方案中，光響應(yīng)性視蛋白包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列。在一些實(shí)施方案中，光響應(yīng)性視蛋白包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列。

本文還提供編碼本文所述的任意光響應(yīng)性氯離子泵蛋白的多核苷酸，例如包含與SEQ ID NO:1中所示序列至少約90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％同一性的核心氨基酸序列、ER輸出信號(hào)、和膜運(yùn)輸信號(hào)的光響應(yīng)性蛋白。在另一個(gè)實(shí)施方案中，多核苷酸包含編碼與SEQ ID NO:2和/或SEQ ID NO:3至少95％同一性的氨基酸的序列。多核苷酸可以在表達(dá)載體中(例如但不限于本文所述病毒載體)。多核苷酸可用于在中樞或周圍神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)元中表達(dá)的光響應(yīng)性氯離子泵蛋白。

與光響應(yīng)性氯泵蛋白相關(guān)的進(jìn)一步公開可在美國(guó)專利申請(qǐng)公開No:2009/0093403和2010/0145418以及國(guó)際專利申請(qǐng)No:PCT/US2011/028893中找到，每篇文獻(xiàn)的公開內(nèi)容據(jù)此通過引用方式全部并入。

光響應(yīng)性質(zhì)子泵

在一些方面，本文所述的光響應(yīng)性視蛋白是光響應(yīng)性質(zhì)子泵。在本文所提供的組合物和方法的一些方面，一種或多種光響應(yīng)性質(zhì)子泵在中樞或周圍神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)元的質(zhì)膜上表達(dá)。

在一些實(shí)施方案中，當(dāng)使用藍(lán)光照射細(xì)胞時(shí)，光響應(yīng)性質(zhì)子泵蛋白可響應(yīng)藍(lán)光以及可來源于藍(lán)隱藻，其中質(zhì)子泵蛋白能夠介導(dǎo)在細(xì)胞中超極化電流。光可具有介于約450至約495nm之間的波長(zhǎng)或者可具有約490nm的波長(zhǎng)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，光響應(yīng)性質(zhì)子泵蛋白可包含與SEQ ID NO:4中所示序列至少約90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％同一性的氨基酸序列。光響應(yīng)性質(zhì)子泵蛋白可另外包含引入天然氨基酸序列的取代、缺失和/或插入以增加或降低對(duì)光的靈敏度、增加或降低對(duì)光的特定波長(zhǎng)的靈敏度、和/或增加或降低光響應(yīng)性質(zhì)子泵蛋白調(diào)節(jié)細(xì)胞的質(zhì)膜的極化狀態(tài)的能力。此外，光響應(yīng)性質(zhì)子泵蛋白可含有一種或多種保守型氨基酸取代和/或一種或多種非保守型氨基酸取代。含有引入天然氨基酸序列內(nèi)的取代、缺失、和/或插入的光響應(yīng)性質(zhì)子泵蛋白合適地保留超極化響應(yīng)光的神經(jīng)元細(xì)胞的質(zhì)膜的能力。

在本文所公開的方法的其它方面，光響應(yīng)性質(zhì)子泵蛋白可包含與SEQ ID NO:4中所示序列至少約90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％同一性的核心氨基酸序列以及選自信號(hào)肽、ER輸出信號(hào)、和膜運(yùn)輸信號(hào)的增強(qiáng)至哺乳動(dòng)物細(xì)胞的質(zhì)膜的轉(zhuǎn)運(yùn)的至少一種(例如一種、兩種、三種、或多種)氨基酸序列基序。在一些實(shí)施方案中，光響應(yīng)性質(zhì)子泵蛋白包含N-末端信號(hào)肽和C-末端ER輸出信號(hào)。在一些實(shí)施方案中，光響應(yīng)性質(zhì)子泵蛋白包含N-末端信號(hào)肽和C-末端運(yùn)輸信號(hào)。在一些實(shí)施方案中，光響應(yīng)性質(zhì)子泵蛋白包含N-末端信號(hào)肽、C-末端ER輸出信號(hào)、和C-末端運(yùn)輸信號(hào)。在一些實(shí)施方案中，光響應(yīng)性質(zhì)子泵蛋白包含C-末端ER輸出信號(hào)和C-末端運(yùn)輸信號(hào)。在一些實(shí)施方案中，通過接頭來連接C-末端ER輸出信號(hào)和C-末端運(yùn)輸信號(hào)。接頭可包含長(zhǎng)度為約5、10、20、30、40、50、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、400、或500個(gè)氨基酸中的任一種。接頭可進(jìn)一步包含熒光蛋白，例如但不限于黃色熒光蛋白、紅色熒光蛋白、綠色熒光蛋白、或者藍(lán)綠色熒光蛋白。在一些實(shí)施方案中，ER輸出信號(hào)可比運(yùn)輸信號(hào)更加靠近C-端。在一些實(shí)施方案中，運(yùn)輸信號(hào)比ER輸出信號(hào)更加靠近C-端。

本文還提供編碼本文所述的任何光響應(yīng)性質(zhì)子泵蛋白的分離的多核苷酸，例如包含與SEQ ID NO:4中所示序列至少約90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％同一性的核心氨基酸序列的光響應(yīng)性質(zhì)子泵蛋白。本文還提供包含編碼諸如包含與SEQ ID NO:4中所示序列至少約90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％同一性的核心氨基酸序列的光響應(yīng)性質(zhì)子泵蛋白的本文所述蛋白的多核苷酸的表達(dá)載體(例如本文所述的病毒載體)。多核苷酸用于在中樞或周圍神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)細(xì)胞中表達(dá)的光響應(yīng)性質(zhì)子泵。

與光響應(yīng)性質(zhì)子泵蛋白相關(guān)的進(jìn)一步公開可在國(guó)際專利申請(qǐng)No.PCT/US2011/028893中找到，其公開內(nèi)容據(jù)此通過引用方式全部并入。

光激活的陽離子通道蛋白

在一些方面，本文所述的光響應(yīng)性視蛋白是光激活的陽離子通道蛋白。在本文所提供的方法的一些方面，一種或多種光激活的陽離子通道可在中樞或周圍神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)細(xì)胞的質(zhì)膜上表達(dá)。

在一些方面，光激活的陽離子通道蛋白可來源于萊茵衣藻，其中當(dāng)使用光照射細(xì)胞時(shí)，陽離子通道蛋白能夠介導(dǎo)在細(xì)胞中去極化電流。在另一個(gè)實(shí)施方案中，光激活的陽離子通道蛋白可包含與SEQ ID NO:5中所示序列至少約90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％同一性的氨基酸序列。用于激活來源于萊茵衣藻的光激活的陽離子通道蛋白的光可具有介于約460至約495nm之間的波長(zhǎng)或者可具有約480nm的波長(zhǎng)。此外，光可具有至少約100Hz的強(qiáng)度。在一些實(shí)施方案中，使用具有100Hz的強(qiáng)度的光對(duì)來源于萊茵衣藻的光激活的陽離子通道的激活可導(dǎo)致表達(dá)光激活的陽離子通道的神經(jīng)元的去極化誘導(dǎo)的突觸耗竭。光激活的陽離子通道蛋白可另外包含引入天然氨基酸序列的取代、缺失和/或插入以增加或降低對(duì)光的靈敏度、增加或降低對(duì)光的特定波長(zhǎng)的靈敏度、和/或增加或降低光激活的陽離子通道蛋白調(diào)節(jié)細(xì)胞的質(zhì)膜的極化狀態(tài)的能力。

此外，光激活的陽離子通道蛋白可含有一種或多種保守型氨基酸取代和/或一種或多種非保守型氨基酸取代。含有引入天然氨基酸序列內(nèi)的取代、缺失、和/或插入的光激活的質(zhì)子泵蛋白合適地保留超極化響應(yīng)光的神經(jīng)元細(xì)胞的質(zhì)膜的能力。

與光激活的陽離子通道蛋白相關(guān)的進(jìn)一步公開可在美國(guó)專利申請(qǐng)公開No.2007/0054319和國(guó)際專利申請(qǐng)公開No.WO 2009/131837和WO 2007/024391中找到，每篇文獻(xiàn)的公開內(nèi)容據(jù)此通過引用方式全部并入。

階躍函數(shù)視蛋白(Step function opsin)和穩(wěn)定的階躍函數(shù)視蛋白

在其它實(shí)施方案中，光激活的陽離子通道蛋白可以為在蛋白的視黃醇結(jié)合袋(retinal binding pocket)中在關(guān)鍵位置處可具有特異性氨基酸取代的階躍函數(shù)視蛋白(SFO)或者穩(wěn)定的階躍函數(shù)視蛋白(SSFO)。在一些實(shí)施方案中，SFO蛋白可具有在SEQ ID NO:5中的氨基酸殘基C128處突變。在其它實(shí)施方案中，SFO蛋白具有在SEQ ID NO:5中C128A突變。在其它實(shí)施方案中，SFO蛋白具有在SEQ ID NO:5中C128S突變。在另一個(gè)實(shí)施方案中，SFO蛋白具有在SEQ ID NO:5中C128T突變。在一些實(shí)施方案中，SFO蛋白可包含與SEQ ID NO:6中所示序列至少約90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％同一性的氨基酸序列。

在一些實(shí)施方案中，SSFO蛋白可具有在SEQ ID NO:5的氨基酸殘基D156處突變。在其它實(shí)施方案中，SSFO蛋白可具有在SEQ ID NO:5的氨基酸殘基C128和D156處突變。在一個(gè)實(shí)施方案中，SSFO蛋白具有在SEQ ID NO:5中C128S和D156A突變。在另一個(gè)實(shí)施方案中，SSFO蛋白可包含與SEQ ID NO:7中所示序列至少約90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％同一性的氨基酸序列。

在一些實(shí)施方案中，當(dāng)使用藍(lán)光照射細(xì)胞時(shí)，本文所提供的SFO或SSFO蛋白能夠介導(dǎo)在細(xì)胞中去極化電流。在其它實(shí)施方案中，光可具有約445nm的波長(zhǎng)。此外，光可具有約100Hz的強(qiáng)度。在一些實(shí)施方案中，使用具有100Hz的強(qiáng)度的光對(duì)SFO或SSFO蛋白的激活可導(dǎo)致表達(dá)SFO或SSFO蛋白的神經(jīng)元的去極化誘導(dǎo)的突觸耗竭。在一些實(shí)施方案中，所公開的階躍函數(shù)視蛋白和穩(wěn)定的階躍函數(shù)視蛋白可分別具有用于去極化響應(yīng)光的神經(jīng)元細(xì)胞的膜的特異性性能和特征。

與SFO或SSFO蛋白相關(guān)的進(jìn)一步公開可在國(guó)際專利申請(qǐng)公開No.WO 2010/056970以及美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)No.61/410,704和61/511,905中找到，每篇文獻(xiàn)的公開內(nèi)容據(jù)此通過引用方式全部并入。

C1V1嵌合陽離子通道

在其它實(shí)施方案中，光激活的陽離子通道蛋白可以為來源于團(tuán)藻的VChR1蛋白和萊茵衣藻的ChR1蛋白的C1V1嵌合蛋白，其中蛋白包含具有被ChR1的第一和第二跨膜螺旋替代的至少第一和第二跨膜螺旋的VChR1的氨基酸序列；響應(yīng)光；并且當(dāng)使用光照射細(xì)胞時(shí)能夠介導(dǎo)在細(xì)胞中去極化電流。在一些實(shí)施方案中，C1V1蛋白可進(jìn)一步包含位于嵌合光響應(yīng)性蛋白的第二和第三跨膜螺旋之間的細(xì)胞內(nèi)環(huán)狀結(jié)構(gòu)域內(nèi)置換，其中細(xì)胞內(nèi)環(huán)狀結(jié)構(gòu)域的至少一部分被ChR1的對(duì)應(yīng)部分替代。在另一個(gè)實(shí)施方案中，C1V1嵌合蛋白的細(xì)胞內(nèi)環(huán)狀結(jié)構(gòu)域的部分可被延伸至ChR1的氨基酸殘基A145的ChR1的對(duì)應(yīng)部分替代。在其它實(shí)施方案中，C1V1嵌合蛋白可進(jìn)一步包含在嵌合光響應(yīng)性蛋白的第三跨膜螺旋內(nèi)置換，其中第三跨膜螺旋的至少一部分被ChR1的對(duì)應(yīng)序列替代。在又一實(shí)施方案中，C1V1嵌合蛋白的細(xì)胞內(nèi)環(huán)狀結(jié)構(gòu)域的部分可被延伸至ChR1的氨基酸殘基W163的ChR1的對(duì)應(yīng)部分替代。在其它實(shí)施方案中，C1V1嵌合蛋白可包含與SEQ ID NO:8中所示序列至少約90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％同一性的氨基酸序列。

在一些實(shí)施方案中，當(dāng)使用綠光照射時(shí)，C1V1蛋白可介導(dǎo)在細(xì)胞中去極化電流。在其它實(shí)施方案中，光可具有介于約540nm至約560nm的波長(zhǎng)。在一些實(shí)施方案中，光可具有約542nm的波長(zhǎng)。在一些實(shí)施方案中，當(dāng)使用紫色光照射細(xì)胞時(shí)，C1V1嵌合蛋白能夠介導(dǎo)在細(xì)胞中去極化電流。在一些實(shí)施方案中，當(dāng)使用具有約405nm的波長(zhǎng)的光照射細(xì)胞時(shí)，嵌合蛋白能夠介導(dǎo)在細(xì)胞中去極化電流。此外，光可具有約100Hz的強(qiáng)度。在一些實(shí)施方案中，使用具有100Hz的強(qiáng)度的光對(duì)C1V1嵌合蛋白的激活可導(dǎo)致表達(dá)C1V1嵌合蛋白的神經(jīng)元的去極化誘導(dǎo)的突觸耗竭。在一些實(shí)施方案中，公開的C1V1嵌合蛋白可具有用于去極化響應(yīng)光的神經(jīng)元細(xì)胞的膜的特異性性能和特征。

C1V1嵌合突變體

在一些方面，本發(fā)明可包括包含取代或突變的氨基酸序列的多肽，其中突變多肽保留前體C1V1嵌合多肽的特征性光響應(yīng)性質(zhì)，但在一些具體方面中也可具有改變的性能。例如，本文所述的突變光激活的C1V1嵌合蛋白在動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)或者在動(dòng)物細(xì)胞質(zhì)膜上可表現(xiàn)出增加水平的表達(dá)；當(dāng)暴露于光的不同波長(zhǎng)、特別是紅光時(shí)的改變的響應(yīng)；和/或特征的組合，其中嵌合C1V1多肽具有低脫敏作用、快速失活、與其它光激活的陽離子通道具有最小交叉激活的低紫光激活、和/或在動(dòng)物細(xì)胞中強(qiáng)烈表達(dá)的性能。

因此，本文提供在嵌合多肽的VChR1部分的視黃醇結(jié)合袋中在關(guān)鍵位置處可具有特異性氨基酸取代的C1V1嵌合光激活的蛋白。在一些實(shí)施方案中，C1V1蛋白可具有在SEQ ID NO:7的氨基酸殘基E122處突變。在一些實(shí)施方案中，C1V1蛋白可具有在SEQ ID NO:7的氨基酸殘基E162處突變。在其它實(shí)施方案中，C1V1蛋白可具有在SEQ ID NO:7的氨基酸殘基E162和E122處突變。在其它實(shí)施方案中，C1V1蛋白可包含與SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、或SEQ ID NO:11中所示序列至少約90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％同一性的氨基酸序列。在一些實(shí)施方案中，公開的突變C1V1嵌合蛋白可分別具有用于去極化響應(yīng)光的動(dòng)物細(xì)胞的膜的特異性性能和特征。

在一些方面，當(dāng)使用光照射細(xì)胞時(shí)，C1V1-E122突變嵌合蛋白能夠介導(dǎo)在細(xì)胞中去極化電流。在一些實(shí)施方案中，光可以為綠光。在其它實(shí)施方案中，光可具有介于約540nm至約560nm之間的波長(zhǎng)。在一些實(shí)施方案中，光可具有約546nm的波長(zhǎng)。在其它實(shí)施方案中，當(dāng)使用紅光照射細(xì)胞時(shí)，C1V1-E122突變嵌合蛋白可介導(dǎo)在細(xì)胞中去極化電流。在一些實(shí)施方案中，紅光可具有約630nm的波長(zhǎng)。在一些實(shí)施方案中，當(dāng)使用紫色光照射細(xì)胞時(shí)，C1V1-E122突變嵌合蛋白在細(xì)胞中未介導(dǎo)去極化電流。在一些實(shí)施方案中，當(dāng)使用具有約405nm的波長(zhǎng)的光照射細(xì)胞時(shí)，嵌合蛋白在細(xì)胞中未介導(dǎo)去極化電流。此外，光可具有約100Hz的強(qiáng)度。在一些實(shí)施方案中，使用具有100Hz的強(qiáng)度的光對(duì)C1V1-E122突變嵌合蛋白的激活可導(dǎo)致表達(dá)C1V1-E122突變嵌合蛋白的神經(jīng)元的去極化誘導(dǎo)的突觸耗竭。在一些實(shí)施方案中，公開的C1V1-E122突變嵌合蛋白可具有用于去極化響應(yīng)光的神經(jīng)元細(xì)胞的膜的特異性性能和特征。

在其它方面，當(dāng)使用光照射細(xì)胞時(shí)，C1V1-E162突變嵌合蛋白能夠介導(dǎo)在細(xì)胞中去極化電流。在一些實(shí)施方案中，光可以為綠光。在其它實(shí)施方案中，光可具有介于約540nm至約535nm之間的波長(zhǎng)。在一些實(shí)施方案中，光可具有約542nm的波長(zhǎng)。在其它實(shí)施方案中，光可具有約530nm的波長(zhǎng)。在一些實(shí)施方案中，當(dāng)使用紫色光照射細(xì)胞時(shí)，C1V1-E162突變嵌合蛋白在細(xì)胞中未介導(dǎo)去極化電流。在一些實(shí)施方案中，當(dāng)使用具有約405nm的波長(zhǎng)的光照射細(xì)胞時(shí)，嵌合蛋白在細(xì)胞中未介導(dǎo)去極化電流。此外，光可具有約100Hz的強(qiáng)度。在一些實(shí)施方案中，使用具有100Hz的強(qiáng)度的光對(duì)C1V1-E162突變嵌合蛋白的激活可導(dǎo)致表達(dá)C1V1-E162突變嵌合蛋白的神經(jīng)元的去極化誘導(dǎo)的突觸耗竭。在一些實(shí)施方案中，公開的C1V1-E162突變嵌合蛋白可具有用于去極化響應(yīng)光的神經(jīng)元細(xì)胞的膜的特異性性能和特征。

在其它方面，當(dāng)使用光照射細(xì)胞時(shí)，C1V1-E122/E162突變嵌合蛋白能夠介導(dǎo)在細(xì)胞中去極化電流。在一些實(shí)施方案中，光可以為綠光。在其它實(shí)施方案中，光可具有介于約540nm至約560nm之間的波長(zhǎng)。在一些實(shí)施方案中，光可具有約546nm的波長(zhǎng)。在一些實(shí)施方案中，當(dāng)使用紫色光照射細(xì)胞時(shí)，C1V1-E122/E162突變嵌合蛋白在細(xì)胞中未介導(dǎo)去極化電流。在一些實(shí)施方案中，當(dāng)使用具有約405nm的波長(zhǎng)的光照射細(xì)胞時(shí)，嵌合蛋白在細(xì)胞中未介導(dǎo)去極化電流。在一些實(shí)施方案中，當(dāng)暴露于紫色光時(shí)，相對(duì)于缺乏在E122/E162處突變的C1V1嵌合蛋白或者相對(duì)于其它光激活的陽離子通道蛋白，C1V1-E122/E162突變嵌合蛋白可表現(xiàn)出更少激活。此外，光可具有約100Hz的強(qiáng)度。在一些實(shí)施方案中，使用具有100Hz的強(qiáng)度的光對(duì)C1V1-E122/E162突變嵌合蛋白的激活可導(dǎo)致表達(dá)C1V1-E122/E162突變嵌合蛋白的神經(jīng)元的去極化誘導(dǎo)的突觸耗竭。在一些實(shí)施方案中，公開的C1V1-E122/E162突變嵌合蛋白可具有用于去極化響應(yīng)光的神經(jīng)元細(xì)胞的膜的特異性性能和特征。

與C1V1嵌合陽離子通道及其突變體相關(guān)的進(jìn)一步公開可在美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)No.61/410,736、61/410,744、和61/511,912中找到，每篇文獻(xiàn)的公開內(nèi)容據(jù)此通過引用方式全部并入。

多核苷酸

本公開也提供包含編碼本文所述光響應(yīng)性視蛋白的核苷酸序列的多核苷酸。在一些實(shí)施方案中，多核苷酸包含表達(dá)盒(expression cassette)。在一些實(shí)施方案中，多核苷酸是包含上述核酸的載體。在一些實(shí)施方案中，編碼本公開的光激活的蛋白的核酸可操作連接啟動(dòng)子。啟動(dòng)子是本領(lǐng)域眾所周知的。在宿主細(xì)胞中作用的任何啟動(dòng)子可用于表達(dá)本公開的光響應(yīng)性視蛋白和/或其任何變體。在一個(gè)實(shí)施方案中，用于驅(qū)動(dòng)光響應(yīng)性視蛋白的表達(dá)的啟動(dòng)子是對(duì)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元特異的啟動(dòng)子。在另一個(gè)實(shí)施方案中，用于驅(qū)動(dòng)光響應(yīng)性視蛋白的表達(dá)的啟動(dòng)子是對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元特異的啟動(dòng)子。在其它實(shí)施方案中，啟動(dòng)子能夠驅(qū)動(dòng)在交感神經(jīng)和/或副交感神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)元中光響應(yīng)性視蛋白的表達(dá)。有多種用于在具體動(dòng)物細(xì)胞中驅(qū)動(dòng)光響應(yīng)性視蛋白或其變體的表達(dá)的啟動(dòng)控制區(qū)或啟動(dòng)子，并且其均是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟悉的?？墒褂媚軌蝌?qū)動(dòng)這些核酸的幾乎任何啟動(dòng)子。運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元特異性基因的例子可在諸如Kudo,等，Human Mol.Genetics,2010,19(16):3233-3253中找到，其內(nèi)容全部通過引用方式并入。在一些實(shí)施方案中，用于驅(qū)動(dòng)光激活的蛋白的表達(dá)的啟動(dòng)子可以為Thy1啟動(dòng)子，其能夠驅(qū)動(dòng)在中樞和周圍神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)元中轉(zhuǎn)基因的穩(wěn)定表達(dá)(參見，例如，Llewellyn,等，2010,Nat.Med.,16(10):1161-1166)。在其它實(shí)施方案中，用于驅(qū)動(dòng)光響應(yīng)性視蛋白的表達(dá)的啟動(dòng)子可以為EF1α啟動(dòng)子、巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動(dòng)子、CAG啟動(dòng)子、突觸蛋白(sinapsin)啟動(dòng)子、或者在哺乳動(dòng)物的周圍和/或中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元中能夠驅(qū)動(dòng)光響應(yīng)性視蛋白的表達(dá)的任何其它普遍存在的啟動(dòng)子。

本文還提供包含編碼本文所述的光響應(yīng)性視蛋白或其變體的核苷酸序列的載體。根據(jù)本發(fā)明可施用的載體也包括包含編碼RNA(例如，mRNA)的核苷酸序列的載體，當(dāng)由載體的多核苷酸轉(zhuǎn)錄時(shí)，其導(dǎo)致在靶動(dòng)物細(xì)胞的質(zhì)膜上光響應(yīng)性視蛋白的累積。可使用的載體包括但不限于慢病毒(lentiviral)、HSV、腺病毒、和腺伴隨病毒(AAV)載體。慢病毒屬包括但不限于HIV-1、HIV-2、SIV、FIV和EIAV。使用包括但不限于VSV、狂犬病、Mo-MLV、桿狀病毒和埃博拉病毒(Ebola)的其它病毒的包膜蛋白可得到假型慢病毒屬。使用本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)方法可制備這些載體。

在一些實(shí)施方案中，載體是重組AAV載體。AAV載體是具有相對(duì)較小尺寸的DNA病毒，可以穩(wěn)定和位點(diǎn)特異性方式將其整合至它們感染的細(xì)胞的基因組內(nèi)。它們能夠感染大量細(xì)胞，而不對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)、形態(tài)或分化產(chǎn)生任何作用，并且它們似乎與人病理無關(guān)。已經(jīng)克隆、測(cè)序和特征化AAV基因組。它包括約4700個(gè)堿基對(duì)以及在各端點(diǎn)處含有約145個(gè)堿基對(duì)的反向末端重復(fù)(ITR)區(qū)，其用作病毒復(fù)制的起點(diǎn)。基因組的剩余部分被分化為攜有衣殼化功能的兩個(gè)基本區(qū)：基因組的左側(cè)部分，其含有與病毒復(fù)制和病毒基因表達(dá)相關(guān)的rep基因；和基因組的右側(cè)部分，其含有編碼病毒的衣殼蛋白的cap基因。

使用本領(lǐng)域標(biāo)準(zhǔn)方法可制備AAV載體。任何血清型的腺伴隨病毒均合適(參見，例如，Blacklow，“Parvoviruses and Human Disease"J.R.Pattison編輯(1988)的165-174頁；Rose,Comprehensive Virology 3:1,1974；P.Tattersall“The Evolution of Parvovirus Taxonomy"in Parvoviruses(JR Kerr,SF Cotmore.ME Bloom,RM Linden,CR Parrish編輯)p5-14,Hudder Arnold,London,UK(2006)；和DE Bowles,JE Rabinowitz,RJ Samulski“The Genus Dependovirus"(JR Kerr,SF Cotmore.ME Bloom,RM Linden,CR Parrish編輯)p15-23,Hudder Arnold,London,UK(2006)，每篇文獻(xiàn)的公開內(nèi)容據(jù)此通過引用方式全部并入本文中)。純化載體的方法可在諸如美國(guó)專利No.6,566,118、6,989,264、和6,995,006以及標(biāo)題為“Methods for Generating High Titer Helper-free Preparation of Recombinant AAV Vectors"的國(guó)際專利申請(qǐng)公開No.:WO/1999/011764中找到，其公開內(nèi)容據(jù)此通過引用方式全部并入本文中?；旌陷d體的制備描述在諸如PCT申請(qǐng)No.PCT/US2005/027091中，其公開內(nèi)容據(jù)此通過引用方式全部并入本文中。已經(jīng)描述用于體外和體內(nèi)轉(zhuǎn)移基因的來源于AAV的載體的使用(參見，例如，國(guó)際專利申請(qǐng)公開No.:WO 91/18088和WO 93/09239；美國(guó)專利No.:4,797,368、6,596,535、和5,139,941；和歐洲專利No.:0488528，所有這些據(jù)此全部通過引用方式并入本文中)。這些出版物描述其中rep和/或cap基因缺失和通過目標(biāo)基因代替的各種來源于AAV的構(gòu)建體，以及用于體外(至培養(yǎng)的細(xì)胞內(nèi))或體內(nèi)(直接至機(jī)體內(nèi))轉(zhuǎn)移目標(biāo)基因的這些構(gòu)建體的使用。通過共轉(zhuǎn)染含有側(cè)面與兩個(gè)AAV反向末端重復(fù)(ITR)區(qū)連接的目標(biāo)核酸序列的質(zhì)粒、和攜帶AAV衣殼化基因(rep和cap基因)的質(zhì)粒至使用人輔助病毒(例如，腺病毒)感染的細(xì)胞系內(nèi)可制備根據(jù)本發(fā)明的復(fù)制缺陷性重組AAV。然后通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)來純化制備的AAV重組體。

在一些實(shí)施方案中，將在本發(fā)明的方法中使用的載體用殼體包裹到病毒顆粒(例如，包括但不限于AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5,AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV14、AAV15、和AAV16的AAV病毒顆粒)內(nèi)。因此，本發(fā)明包括包含本文所述的任何載體的重組病毒顆粒(由于它含有重組多核苷酸而為重組體)。制備這些顆粒的方法是本領(lǐng)域已知的，并且描述在美國(guó)專利No.6,596,535中，其公開內(nèi)容據(jù)此通過引用方式全部并入。

光響應(yīng)性視蛋白和鑭系元素?fù)诫s納米粒子的遞送

在一些方面，例如通過立體定位注射(參見，例如，Stein等，J.Virol.,1999,73:34243429；Davidson等，Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.,2000,97:3428-3432；Davidson等，Nat.Genet.,1993,3:219-223；和Alisky&Davidson,Hum.Gene Ther.,2000,11:2315-2329，其內(nèi)容據(jù)此各自通過引用方式全部并入本文中)或者熒光檢查法，使用本領(lǐng)域已知的神經(jīng)外科技術(shù)經(jīng)注射針、導(dǎo)管、或相關(guān)的裝置可將編碼本文所公開的光響應(yīng)性視蛋白的多核苷酸(例如，AAV1載體)直接遞送至中樞或周圍神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)元。在一些實(shí)施方案中，通過注射至任一種脊神經(jīng)(例如頸椎脊神經(jīng)、胸椎脊神經(jīng)、腰椎脊神經(jīng)、骶椎脊神經(jīng)、和/或尾椎脊神經(jīng))內(nèi)可將編碼本文所公開的光響應(yīng)性視蛋白的多核苷酸(例如，AAV1載體)遞送至周圍神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)元。

也可使用遞送光響應(yīng)性視蛋白至目標(biāo)神經(jīng)的其它方法，例如但不限于使用離子脂類或高分子轉(zhuǎn)染、電穿孔、光學(xué)轉(zhuǎn)染、impalefection、或者通過基因槍。

在另一方面，通過周圍神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)元支配的肌肉可直接遞送編碼本文公開的光響應(yīng)性視蛋白的多核苷酸(例如，AAV2載體)。由于直接注射病毒載體至支配特定肌肉的具體細(xì)胞體內(nèi)的固有限制性，研究者們已經(jīng)嘗試通過直接注射病毒載體至肌肉內(nèi)來遞送轉(zhuǎn)基因至周圍神經(jīng)元。這些試驗(yàn)顯示：諸如腺病毒、AAV2、和狂犬病糖蛋白假型慢病毒的一些病毒血清型可通過肌肉細(xì)胞吸收以及穿過神經(jīng)肌肉突觸來退行性轉(zhuǎn)運(yùn)至運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元(參見，例如，Azzouz等，2009,Antioxid Redox Signal.,11(7):1523-34；Kaspar等，2003,Science,301(5634):839-842；Manabe等，2002,Apoptosis,7(4):329-334，每篇文獻(xiàn)的公開內(nèi)容據(jù)此通過引用方式全部并入本文中)。

因此，在一些實(shí)施方案中，通過直接注射至目標(biāo)肌肉內(nèi)可將表達(dá)本文公開的光響應(yīng)性視蛋白的載體(例如，AAV2載體)遞送至負(fù)責(zé)神經(jīng)支配肌肉的神經(jīng)元。

取決于納米粒子待遞送的解剖位置，通過諸如血管內(nèi)、顱內(nèi)、腦內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮內(nèi)、靜脈內(nèi)、眼內(nèi)、口服、鼻腔、局部、或者通過開放式手術(shù)工序的任何途徑可將本文公開的鑭系元素?fù)诫s納米粒子遞送至表達(dá)一種或多種光響應(yīng)性視蛋白的神經(jīng)元。通過諸如以上所述那些任一種的用于遞送表達(dá)光響應(yīng)性視蛋白的多核苷酸載體的相同途徑可另外遞送納米粒子。如在開放式心臟手術(shù)時(shí)的心臟中、或者在立體定位手術(shù)時(shí)的腦中、或者通過使用進(jìn)入具體器官的血液供應(yīng)的導(dǎo)管對(duì)血管內(nèi)介入方法、或者通過其它介入方法，以開放式方式也可施用納米粒子。

根據(jù)用于制備藥學(xué)上可使用的組合物的已知方法可配制用于遞送和/或儲(chǔ)備編碼本文所公開的光響應(yīng)性視蛋白的多核苷酸和/或本文所公開的鑭系元素?fù)诫s納米粒子的藥物組合物。配制物描述在多種來源處，這些對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言眾所周知并容易獲得。例如，Remington's Pharmaceutical Sciences(Martin E W,1995,Easton Pa.,Mack Publishing Company，第19版)描述可結(jié)合本發(fā)明使用的配制物。適合于胃腸外施用的配制物包括諸如水性無菌注射溶液，其可含有抗氧化劑、緩沖劑、抑菌劑、和導(dǎo)致配制物與預(yù)期接受者血液等張的溶質(zhì)；以及可包含懸浮劑和增稠劑的水性和非水性無菌混懸物。配制物可裝入單位劑量或多劑量容器中，例如，密封安瓿和小瓶，并可保存在冷凍干燥(凍干)條件下，在使用之前，僅需諸如注射用水的無菌液體載體條件。

也可通過輸液或注射靜脈內(nèi)或腹腔施用鑭系元素?fù)诫s納米粒子。可將納米粒子和/或細(xì)胞的溶液制備在水中，任選與無毒表面活性劑混合。也可將分散物制備在甘油、液態(tài)聚乙二醇、三醋精、及其混合物中和在油中。在儲(chǔ)備和使用的普通條件下，這些制劑含有防腐劑以防微生物生長(zhǎng)。

適合本文所述的鑭系元素?fù)诫s納米粒子注射或輸液的藥物劑型可包括包含活性成分的無菌水性溶液或分散物或者無菌粉末，其適于無菌可注射或可輸液溶液或分散物的臨時(shí)制備。液態(tài)載體或賦形劑可以為包含諸如水、乙醇、多醇(例如，甘油、丙二醇、液態(tài)聚乙二醇等)、植物油、無毒甘油酯、及其合適混合物的溶劑或液態(tài)分散介質(zhì)。通過各種抗細(xì)菌和抗真菌試劑，例如，對(duì)羥苯甲酸酯、氯代丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等，可起到預(yù)防微生物的作用。

紅外或近紅外電磁輻射的來源

結(jié)合本文所述的鑭系元素?fù)诫s納米粒子，能夠產(chǎn)生具有在紅外(IR)或近紅外(NIR)光譜中波長(zhǎng)的電磁輻射的來源的任何裝置可用于激活在神經(jīng)元的表面上表達(dá)的一種或多種光響應(yīng)性蛋白。IR或NIR來源可配置提供對(duì)腦的特異性靶區(qū)域的光學(xué)刺激。IR或NIR來源可另外提供連續(xù)IR或NIR電磁輻射和/或脈沖的IR或NIR電磁輻射，并可將其程序化以提供按預(yù)先確定脈沖順序的IR或NIR電磁輻射。

在其它方面，植入式IR或NIR來源無需物理固定至外部電源。在一些實(shí)施方案中，電源可以為用于供電IR或NIR來源的外部電池。在另一個(gè)實(shí)施方案中，植入式IR或NIR來源可包括用于接收來自供電IR或NIR來源的外部電源的無線傳輸電磁能的外部天線。無線傳輸電磁能可以為無線電波、微波、或者可由外部來源傳輸以供電產(chǎn)生IR或NIR的來源的任何其它電磁能來源。在一個(gè)實(shí)施方案中，通過使用本領(lǐng)域已知的半導(dǎo)體或其它方法產(chǎn)生的集成電路來控制IR或NIR來源。

在一些方面，通過外部控制器可外部激活植入式IR或NIR電磁輻射來源。外部控制器可包括電力發(fā)電機(jī)，該電力發(fā)電機(jī)可安裝至發(fā)射線圈。在外部控制器的一些實(shí)施方案中，電池可連接電力發(fā)電機(jī)以用于對(duì)其供電。開關(guān)連接電力發(fā)電機(jī)，使得人們可手動(dòng)啟動(dòng)或關(guān)閉電力發(fā)電機(jī)。在一些實(shí)施方案中，一旦打開開關(guān)，電力發(fā)電機(jī)通過在外部控制器上發(fā)射線圈和植入式IR或NIR來源的外部天線之間的電磁耦合來為IR或NIR電磁輻射來源供電。當(dāng)使用射頻電磁感應(yīng)耦合時(shí)，無線電波的工作頻率可介于約1至20MHz之間，其包括這些數(shù)字之間的任何值(例如，約1MHz、約2MHz、約3MHz、約4MHz、約5MHz、約6MHz、約7MHz、約8MHz、約9MHz、約10MHz、約11MHz、約12MHz、約13MHz、約14MHz、約15MHz、約16MHz、約17MHz、約18MHz、約19MHz、或約20MHz)。然而，可使用其它耦合技術(shù)，例如光接收器或生物醫(yī)學(xué)遙測(cè)系統(tǒng)(參見，例如，Kiourti,“Biomedical Telemetry:Communication between Implanted Devices and the External World,Opticon1826,(8):Spring,2010)。

在一些方面，通過IR或NIR電磁輻射來源產(chǎn)生的到達(dá)神經(jīng)細(xì)胞(例如表達(dá)一種或多種光響應(yīng)性視蛋白的神經(jīng)細(xì)胞)的IR或NIR電磁輻射的強(qiáng)度具有以下任一種的強(qiáng)度：約0.05mW/mm²、0.1mW/mm²、0.2mW/mm²、0.3mW/mm²、0.4mW/mm²、0.5mW/mm²、約0.6mW/mm²、約0.7mW/mm²、約0.8mW/mm²、約0.9mW/mm²、約1.0mW/mm²、約1.1mW/mm²、約1.2mW/mm²、約1.3mW/mm²、約1.4mW/mm²、約1.5mW/mm²、約1.6mW/mm²、約1.7mW/mm²、約1.8mW/mm²、約1.9mW/mm²、約2.0mW/mm²、約2.1mW/mm²、約2.2mW/mm²、約2.3mW/mm²、約2.4mW/mm²、約2.5mW/mm²、約3mW/mm²、約3.5mW/mm²、約4mW/mm²、約4.5mW/mm²、約5mW/mm²、約5.5mW/mm²、約6mW/mm²、約7mW/mm²、約8mW/mm²、約9mW/mm²、或約10mW/mm²，包括這些數(shù)字之間的值。

在其它方面，通過IR或NIR電磁輻射來源產(chǎn)生的IR或NIR電磁輻射可具有涵蓋全部紅外光譜的波長(zhǎng)，例如約740nm至約300,000nm。在其它實(shí)施方案中，通過IR或NIR電磁輻射來源產(chǎn)生的IR或NIR電磁輻射可具有對(duì)應(yīng)于NIR光譜的波長(zhǎng)，例如約740nm至約1400nm。在其它實(shí)施方案中，產(chǎn)生的NIR電磁輻射具有介于700nm至1000nm之間的波長(zhǎng)。

在一些方面，當(dāng)結(jié)合本文所公開的鑭系元素?fù)诫s納米粒子使用時(shí)，IR或NIR電磁輻射來源用于超極化或去極化在個(gè)體的腦或中樞神經(jīng)系統(tǒng)中神經(jīng)細(xì)胞(例如表達(dá)一種或多種光響應(yīng)性視蛋白的神經(jīng)細(xì)胞)的質(zhì)膜。在一些實(shí)施方案中，在未穿刺骨骼下在臨近目標(biāo)腦區(qū)域的區(qū)域中將個(gè)體的顱骨手術(shù)薄化。然后將IR或NIR電磁輻射來源直接放置在薄化的顱骨區(qū)域。在其它實(shí)施方案中，將IR或NIR電磁輻射發(fā)生器植入直接臨近薄化顱骨區(qū)域的個(gè)體皮膚下。

在一些方面，當(dāng)結(jié)合本文所公開的鑭系元素?fù)诫s納米粒子使用時(shí)，IR或NIR電磁輻射來源用于超極化或去極化在個(gè)體的周圍神經(jīng)系統(tǒng)中神經(jīng)細(xì)胞(例如表達(dá)一種或多種光響應(yīng)性視蛋白的神經(jīng)細(xì)胞)的質(zhì)膜。在一些實(shí)施方案中，將IR或NIR電磁輻射來源手術(shù)植入直接臨近目標(biāo)外周神經(jīng)細(xì)胞的個(gè)體皮膚下。在其它實(shí)施方案中，將IR或NIR電磁輻射來源正對(duì)直接臨近目標(biāo)外周神經(jīng)細(xì)胞的皮膚放置。在一個(gè)實(shí)施方案中，IR或NIR電磁輻射來源以手鐲或袖口構(gòu)型保持在皮膚中。

IR或NIR電磁輻射來源的例子、特別是可植入皮膚下的足夠小的那些可在美國(guó)專利申請(qǐng)公開No.:2009/0143842、2011/0152969、2011/0144749、和2011/0054305中找到，每篇文獻(xiàn)的公開內(nèi)容據(jù)此通過引用方式全部并入本文中。

在再一方面，可將本文公開的鑭系元素?fù)诫s納米粒子暴露于可見光譜中較長(zhǎng)波長(zhǎng)光(例如紅光)以將較長(zhǎng)波長(zhǎng)可見光上轉(zhuǎn)換成較短波長(zhǎng)可見光(例如藍(lán)或綠光)。如上所述，光較差地通過生物組織。然而，當(dāng)可見光確實(shí)穿透至組織內(nèi)時(shí)，它通常為對(duì)應(yīng)紅光的較高波長(zhǎng)(例如，約620nm至740nm之間)。因此，本文公開的鑭系元素?fù)诫s納米粒子可結(jié)合可見光的光源用于將對(duì)應(yīng)紅光的波長(zhǎng)上轉(zhuǎn)成對(duì)應(yīng)綠或藍(lán)光的波長(zhǎng)內(nèi)(例如，約440nm至570nm之間)。包括光源的光刺激裝置的例子可在國(guó)際專利申請(qǐng)No.:PCT/US08/50628和PCT/US09/49936以及在Llewellyn等，2010,Nat.Med.,16(10):161-165中找到，每篇文獻(xiàn)的公開內(nèi)容據(jù)此通過引用方式全部并入本文中。

本發(fā)明的方法

神經(jīng)細(xì)胞的去極化

本文提供使個(gè)體中神經(jīng)細(xì)胞的質(zhì)膜去極化的方法，其包括：接近神經(jīng)細(xì)胞放置多種鑭系元素?fù)诫s納米粒子；和將多種納米粒子暴露于在紅外(IR)或近紅外(NIR)光譜中的電磁輻射，其中通過納米粒子將在IR或NIR光譜中的電磁輻射上轉(zhuǎn)換成在可見光譜中的光，并且其中光響應(yīng)性視蛋白在神經(jīng)細(xì)胞的質(zhì)膜上表達(dá)并且通過在可見光譜中的光對(duì)視蛋白的激活誘導(dǎo)質(zhì)膜的去極化。

本文還提供使個(gè)體中神經(jīng)細(xì)胞的質(zhì)膜去極化的方法，其包括：向個(gè)體的腦中的神經(jīng)細(xì)胞施用編碼光響應(yīng)性視蛋白的多核苷酸，其中光響應(yīng)性蛋白在神經(jīng)細(xì)胞的質(zhì)膜上表達(dá)和當(dāng)使用光照射時(shí)視蛋白能夠誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞的膜去極化；接近神經(jīng)細(xì)胞施用多種鑭系元素?fù)诫s納米粒子；以及將多種納米粒子暴露于在紅外(IR)或近(IR)光譜中的電磁輻射，其中將在IR或近IR光譜中的電磁輻射上轉(zhuǎn)換成在可見光譜中的光并且通過在可見光譜中的光對(duì)視蛋白的激活誘導(dǎo)質(zhì)膜的去極化。

在一些實(shí)施方案中，光響應(yīng)性視蛋白是ChR2、V ChR1或C1V1。在其它實(shí)施方案中，光響應(yīng)性視蛋白選自SFO、SSFO、C1V1-E122、C1V1-E162和C1V1-E122/E162。

鑭系金屬可以為任何鑭系元素的離子或原子，例如鑭、鈰、鐠、釹、钷、釤、銪、釓、鋱、鏑、鈥、鉺、銩、鐿或镥。在其它實(shí)施方案中，納米粒子包含NaYF4:Yb/X/Gd，其中X是Er、Tm或Er/Tm。

可將在IR或近IR光譜中的電磁輻射上轉(zhuǎn)換成具有約450nm至約550nm的波長(zhǎng)的光。光可具有對(duì)應(yīng)于紅、黃、琥珀、橙、綠、或藍(lán)光的波長(zhǎng)。在一些實(shí)施方案中，個(gè)體是人或非人動(dòng)物。在其它實(shí)施方案中，神經(jīng)細(xì)胞在周圍神經(jīng)系統(tǒng)中。在另一個(gè)實(shí)施方案中，神經(jīng)細(xì)胞在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中。

神經(jīng)細(xì)胞的超極化

本文提供使個(gè)體中神經(jīng)細(xì)胞的質(zhì)膜超極化的方法，其包括：接近神經(jīng)細(xì)胞放置多種鑭系元素?fù)诫s納米粒子；和將多種納米粒子暴露于在紅外(IR)或近紅外(NIR)光譜中的電磁輻射，其中通過納米粒子將在IR或NIR光譜中的電磁輻射上轉(zhuǎn)換成在可見光譜中的光，并且其中光響應(yīng)性視蛋白在神經(jīng)細(xì)胞的質(zhì)膜上表達(dá)并且通過在可見光譜中的光對(duì)視蛋白的激活誘導(dǎo)質(zhì)膜的超極化。

本文還提供使個(gè)體中神經(jīng)細(xì)胞的質(zhì)膜超極化的方法，其包括：向個(gè)體的腦中的神經(jīng)細(xì)胞施用編碼光響應(yīng)性視蛋白的多核苷酸，其中光響應(yīng)性蛋白在神經(jīng)細(xì)胞的質(zhì)膜上表達(dá)和當(dāng)使用光照射時(shí)視蛋白能夠誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞的膜去極化；接近神經(jīng)細(xì)胞施用多種鑭系元素?fù)诫s納米粒子；以及將多種納米粒子暴露于在紅外(IR)或近(IR)光譜中的電磁輻射，其中將在IR或近IR光譜中的電磁輻射上轉(zhuǎn)換成在可見光譜中的光并且通過在所述可見光譜中的光對(duì)視蛋白的激活誘導(dǎo)質(zhì)膜的超極化。

在一些實(shí)施方案中，光響應(yīng)性視蛋白是NpHR或GtR3。

鑭系金屬可以為任何鑭系元素的離子或原子，例如鑭、鈰、鐠、釹、钷、釤、銪、釓、鋱、鏑、鈥、鉺、銩、鐿或镥。在其它實(shí)施方案中，納米粒子包含NaYF4:Yb/X/Gd，其中X是Er、Tm或Er/Tm。

可將IR或近IR光譜中的電磁輻射上轉(zhuǎn)換成具有約450nm至約550nm的波長(zhǎng)的光。光可具有對(duì)應(yīng)于紅、黃、琥珀、橙、綠或藍(lán)光的波長(zhǎng)。在一些實(shí)施方案中，個(gè)體是人或非人動(dòng)物。在其它實(shí)施方案中，神經(jīng)細(xì)胞在周圍神經(jīng)系統(tǒng)中。在另一個(gè)實(shí)施方案中，神經(jīng)細(xì)胞在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中。

試劑盒

本文還提供包括編碼光響應(yīng)性視蛋白(例如本文所述的任何光響應(yīng)性視蛋白)的多核苷酸和在本文所公開的方法中用于改變中樞和/或周圍神經(jīng)系統(tǒng)的一種或多種神經(jīng)元的膜極化狀態(tài)的鑭系元素?fù)诫s納米粒子的試劑盒。在一些實(shí)施方案中，試劑盒進(jìn)一步包括紅外或近紅外電磁輻射來源。在其它實(shí)施方案中，試劑盒進(jìn)一步包括使用本文所述的多核苷酸和鑭系元素?fù)诫s納米粒子的說明書。在又一其它實(shí)施方案中，將本文所述的鑭系元素?fù)诫s納米粒子嵌入和/或包埋在生物相容性材料(例如上述的任何生物相容性材料)中。

示例性實(shí)施方案

鑒于結(jié)合附圖的本公開的各實(shí)施方案的詳細(xì)描述可更充分地理解本公開的各方面。該描述和各實(shí)施方案展示如下：

可結(jié)合一個(gè)或多個(gè)上述方面、實(shí)施方案和實(shí)施方式以及附圖中所示和以下所描述的那些來實(shí)施本文討論的實(shí)施方案和具體應(yīng)用。也可參照Wang等，2010,Nature,463(7284):1061-5，其全部通過引用方式并入本文中。對(duì)于光響應(yīng)性分子和/或視蛋白的進(jìn)一步細(xì)節(jié)，包括方法、裝置和材料，也可參照以下背景公開：Zhang等的標(biāo)題為"System for Optical Stimulation of Target Cells"的美國(guó)專利公開No.2010/0190229；Boyden等的標(biāo)題為"System for Optical Stimulation of Target Cells"的美國(guó)專利公開No.2007/0261127。這些申請(qǐng)構(gòu)成臨時(shí)專利文件的一部分，并通過引用方式全部并入本文中。與這些公開一致，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中可體內(nèi)和體外使用多種視蛋白以提供光刺激和對(duì)靶細(xì)胞的控制。例如，當(dāng)將ChR2引入諸如神經(jīng)元的電可興奮細(xì)胞內(nèi)時(shí)，ChR2光敏感通道的光激活可導(dǎo)致細(xì)胞的激發(fā)和/或激活。在將NpHR引入諸如神經(jīng)元的電可興奮細(xì)胞內(nèi)的情況下，NpHR視蛋白的光激活可導(dǎo)致對(duì)細(xì)胞激活的抑制。以上引用的專利申請(qǐng)的公開的這些和其它方面可用于實(shí)施本公開的各方面。

在本公開的各實(shí)施方案中，使用近紅外上轉(zhuǎn)換納米晶體實(shí)現(xiàn)光的最少侵入式遞送，例如可用于通過光遺傳學(xué)來操作神經(jīng)回路。這用于避免在包括諸如受試者的腦的活組織內(nèi)植入光源。哺乳動(dòng)物組織具有在光譜的近紅外段(700-1000nm)的透明窗。因此，本公開的各方面涉及通過在目標(biāo)位點(diǎn)處轉(zhuǎn)換紅外光至可見波長(zhǎng)用于使用(近)紅外光遞送能量至腦部深度內(nèi)對(duì)納米粒子的使用。

在某些實(shí)施方案中，通過在鑭系元素?fù)诫s納米晶體中光學(xué)上轉(zhuǎn)換的方法達(dá)到在腦內(nèi)目標(biāo)位點(diǎn)處遞送可見波長(zhǎng)。在上轉(zhuǎn)換時(shí)，通過材料吸收3-4個(gè)光子，然后其發(fā)射具有所吸收光子能量的～1.5-2倍能量的一個(gè)光子。取決于摻雜原子(X＝Er、Tm、Er/Tm)的性質(zhì)和相對(duì)含量，例如NaYF4:Yb/X/Gd納米晶體可吸收980nm光和射出中心介于450-550nm之間的光譜的光。對(duì)于改變由納米粒子發(fā)射出的光的更多信息，參見Wang等，Nature,2010,463(7284):1061-5，其公開內(nèi)容據(jù)此通過引用方式全部并入本文中。

在某些實(shí)施方案中，進(jìn)行一步手術(shù)以修飾靶細(xì)胞群和提供納米粒子以將近紅外光轉(zhuǎn)換成刺激修飾的靶細(xì)胞群的可見光。在手術(shù)中，外科醫(yī)生注射攜帶視蛋白基因和納米粒子溶液的腺伴隨病毒至目標(biāo)位點(diǎn)。

優(yōu)化病毒以僅感染靶細(xì)胞群。類似地，使用抗體功能化納米粒子，使得納米粒子也瞄定靶細(xì)胞群。在某些更具體實(shí)施方案中，靶細(xì)胞群是特定神經(jīng)元類型。在完成手術(shù)之后，將發(fā)射近紅外光的LED放置在皮膚下方患者顱骨的薄化部分上。也可將電池植入皮膚下以對(duì)LED供電。在某些實(shí)施方案中，電池具有類似于心臟起搏器電池的那些特征。微型控制器可用于控制電池以規(guī)定間隔遞送能量至LED，這得到規(guī)定間隔下LED光脈沖。

本公開的某些方面涉及體內(nèi)使用光遺傳學(xué)。體內(nèi)應(yīng)用的光遺傳學(xué)依賴于遞送至可位于腦部?jī)?nèi)深處的具體神經(jīng)元群的光。哺乳動(dòng)物組織高度吸收和發(fā)散可見光譜的光。然而，在未過度吸收或發(fā)散下近紅外光能夠深度穿透腦部。

本公開的某些方面涉及在接近靶神經(jīng)元的腦中嵌入納米粒子。納米粒子可以為鑭系元素?fù)诫s的納米粒子。特定視蛋白的激活光譜可優(yōu)化使用鑭系元素或使用其它摻雜元素?fù)诫s的納米粒子。如在其公開內(nèi)容通過引用方式全部并入的Wang等，Nature,2010,463(7284):1061-5中更詳細(xì)討論，根據(jù)使用何種和多少摻雜原子可操作由鑭系元素?fù)诫s納米晶體發(fā)射的光的光譜。類似地，根據(jù)摻雜原子的濃度可操作由摻雜其它分子的納米粒子發(fā)射的光。

根據(jù)納米粒子的摻雜提供不同輸出光譜的能力使得可得到急性神經(jīng)操作的非侵入式方法?？蓪⒅T如LED的光源安裝至皮膚下薄化顱骨上。取決于納米粒子的組成、和遞送至靶神經(jīng)元的視蛋白，本公開的各方面可用于神經(jīng)激發(fā)或沉默。類似地，通過結(jié)合使用各種摻雜原子和視蛋白可同時(shí)控制多種神經(jīng)元群。

參照?qǐng)D1，顯示患者的頭部100。靶(神經(jīng))細(xì)胞群114包括光響應(yīng)性分子。這些光響應(yīng)性分子可包括但不必限于來源于光敏感通道(例如，ChR1或ChR2)或者鹽細(xì)菌視紫紅質(zhì)(NpHR)的視蛋白。根據(jù)在分子響應(yīng)光處對(duì)靶細(xì)胞群和/或波長(zhǎng)的所需作用可調(diào)整/選擇具體分子。

將納米晶體110引入靠近或在靶細(xì)胞聚集處。本公開的各種實(shí)施方案涉及用于定位和保持定位納米晶體接近靶細(xì)胞群的方法和裝置。某些實(shí)施方案涉及使用抗體瞄定納米晶體至(或靠近)靶細(xì)胞群的細(xì)胞。

根據(jù)其它示例實(shí)施方案，可引入包括納米晶體的結(jié)構(gòu)。例如，可使用納米晶體來包覆網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。可構(gòu)建合成網(wǎng)眼，使得樹突和軸突可通過網(wǎng)眼，而使神經(jīng)元(例如，細(xì)胞體)不能全部通過。這些網(wǎng)眼的一個(gè)例子具有直徑約3-7微米的孔以及由聚乙烯對(duì)苯二甲酸酯制成。該網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)可由其中含有的光響應(yīng)性細(xì)胞/神經(jīng)元構(gòu)建和/或?qū)⑵浞胖每拷邪ü忭憫?yīng)性細(xì)胞的細(xì)胞群體。與另一實(shí)施方案一致，可將各自含有納米晶體溶液的一個(gè)或多個(gè)透明莢膜放置靠近靶細(xì)胞群。

本公開的實(shí)施方案也涉及刺激的各種光源。這些來源可包括但不限于外部激光源和光發(fā)射二極管(LED)。本公開的特定方面涉及當(dāng)光在某些波長(zhǎng)(例如，(近)紅外)下時(shí)通過介入材料所導(dǎo)致的相對(duì)較低吸收和/或散射/擴(kuò)散。因此，由于具有光強(qiáng)度或能量的較少損耗來穿透組織的能力，可將光源放置在外部。而且，降低的擴(kuò)散尤其可用于提供遞送光的相對(duì)高的空間精確性。因此，本公開的實(shí)施方案涉及具有使用空間精確性光學(xué)刺激可單獨(dú)控制的各自納米晶體的多種靶細(xì)胞群。例如，可將納米晶體植入腦內(nèi)多位置中。然后將光源瞄準(zhǔn)各自和具體位置處。多種光源也可用于同時(shí)刺激多個(gè)位置。

與本公開的特定實(shí)施方案一致，顱骨102具有薄化部分106。LED 104位于顱骨的薄化部分的上方，并且發(fā)射近紅外光108。當(dāng)IR擊中納米晶體110時(shí)，它被吸收。納米晶體射出響應(yīng)吸收IR光108的可見光112?？梢姽?12通過修飾的細(xì)胞114吸收。

在圖1中顯示的系統(tǒng)使得可遞送光至在患者的腦組織深處的靶細(xì)胞?？蓪⒐忭憫?yīng)性分子特異性靶向目標(biāo)神經(jīng)細(xì)胞類型。類似地，使用根據(jù)待靶向的神經(jīng)細(xì)胞114的類型選擇的抗體將納米晶體112瞄定神經(jīng)細(xì)胞。

參照?qǐng)D2，使用介于700-1000nm之間的紅外光208來照射一組神經(jīng)元。靶神經(jīng)元214表達(dá)視蛋白基因，這取決于通過神經(jīng)元214吸收何種視蛋白和光的波長(zhǎng)類型，使得神經(jīng)元可激活或抑制?？蓪猩窠?jīng)元214分散在其它神經(jīng)元216之間。如在插入物202中所示，使用通過抗體瞄定神經(jīng)膜的上轉(zhuǎn)換納米粒子210來包覆靶神經(jīng)元214。納米粒子210吸收IR光子和射出可見光子，然后通過觸發(fā)神經(jīng)激活的視蛋白來將其吸收。

圖2的系統(tǒng)可與各種靶神經(jīng)元214一起使用。根據(jù)靶神經(jīng)元來修飾在靶神經(jīng)元214中表達(dá)的視蛋白基因215。類似地，將用于瞄定納米粒子210至靶神經(jīng)元膜的抗體修飾以連接特定膜類型。如在插入物202中所示，將納米粒子210緊密連接靶神經(jīng)元，使得通過靶神經(jīng)元214來吸收通過納米粒子210射出的可見光光子。

與本公開的實(shí)施方案一致，圖3示出使用多光源的系統(tǒng)?；颊呔哂形挥诎形恢?08-312的納米粒子。系統(tǒng)包括光源302-306，可配置其產(chǎn)生在通過位于靶位置308-312處的納米粒子上轉(zhuǎn)換的頻率下的光。盡管示出三處光源，但可有任意數(shù)目的光源。使用嵌入的光源(例如，植入顱骨上的LED)或其組合，這些光源可在患者(例如，使用機(jī)械定位導(dǎo)向多光源的靶向系統(tǒng))外部。靶位置308-312包括具有光響應(yīng)性膜分子的細(xì)胞。這些光響應(yīng)性膜分子對(duì)上轉(zhuǎn)換的頻率下的光起反應(yīng)。

相對(duì)于其它位置(包括在來自單一光源的光途徑內(nèi)那些位置)，位于來自不同光源302-306的光的交叉點(diǎn)314處納米粒子接受增加強(qiáng)度的光刺激。以這種方式，可將各光源的光強(qiáng)度設(shè)置在閾值水平下。當(dāng)在相同位置處定向多光源時(shí)，在位置處可超出閾值強(qiáng)度水平。這使得可進(jìn)行三維空間控制，以及也使得可降低對(duì)非靶向的組織的非預(yù)期作用。與一個(gè)實(shí)施方案一致，根據(jù)對(duì)靶細(xì)胞產(chǎn)生所需作用(例如，激發(fā)或抑制)所必須的光量可設(shè)置閾值水平。與其它實(shí)施方案一致，可設(shè)置閾值水平以避免對(duì)非靶向組織的副作用(例如，加熱)。

多光源的使用也可引起光強(qiáng)度的逐步增加。例如，通過監(jiān)測(cè)由光強(qiáng)度增加導(dǎo)致的另外的刺激的作用可測(cè)定疾病模型。獨(dú)立光源的使用使得可相對(duì)簡(jiǎn)單地控制時(shí)間和空間上增加或降低。與本公開的其它實(shí)施方案一致，在不同光源之間光源的空間精確性可變化。例如，第一光源可提供照射全部靶細(xì)胞位置的光。這使得在群體內(nèi)所有細(xì)胞均可得到照射。第二光源可提供照射少于全部靶細(xì)胞位置的具有焦點(diǎn)的光。第一和第二(或者更多)光源的組合可用于提供在相同細(xì)胞群內(nèi)不同水平的刺激。

本公開的實(shí)施方案涉及以掃描模式操作的一種或多種光源的使用。將光源在靶細(xì)胞群內(nèi)瞄準(zhǔn)具體位置。當(dāng)將光源用于掃描或者在靶細(xì)胞群內(nèi)移動(dòng)它時(shí)，可監(jiān)測(cè)刺激的作用。這尤其可用于通過使用多光源的三維控制。

本公開的實(shí)施方案涉及發(fā)射不同波長(zhǎng)的光的納米晶體的使用。當(dāng)使用具有不同光吸收光譜的多種視蛋白時(shí)，這可特別地有用?？蓪⒓{米晶體靶向不同視蛋白和/或?qū)⑵浞胖迷谙鄳?yīng)位置處。盡管本公開可具有各種修改和替代形式，但其細(xì)節(jié)已在附圖中通過舉例的方式示出并將進(jìn)行詳細(xì)描述。應(yīng)當(dāng)理解，目的不是限于所述的特定實(shí)施方案和/或應(yīng)用。相反，目的在于涵蓋落入本公開的精神和范圍內(nèi)的所有修改形式、等效形式和替代形式。

實(shí)施例

實(shí)施例1：鑭系元素?fù)诫s納米粒子在使用光遺傳學(xué)來超極化伏隔核的膽堿能中間神經(jīng)元中的用途

伏隔核(NAc)是形成腹側(cè)紋狀體(ventral striatum)的主要部分的神經(jīng)元的集合。據(jù)認(rèn)為，NAc在與獎(jiǎng)賞、愉悅、歡笑、成癮、侵犯、恐懼和安慰劑作用相關(guān)的復(fù)雜哺乳動(dòng)物行為中起到重要作用。在NAc內(nèi)膽堿能中間神經(jīng)元由小于1％的局部神經(jīng)群構(gòu)成，但它們突出通過NAc和提供它僅已知的膽堿能輸入。在該例子中，結(jié)合鑭系元素?fù)诫s納米粒子使用的光響應(yīng)性氯泵蛋白的光遺傳方法用于阻斷在這些細(xì)胞中可能激動(dòng)作用，其具有高時(shí)間分辨力和高細(xì)胞類型特異性。為了在膽堿能中間神經(jīng)元中特異性表達(dá)細(xì)菌視蛋白基因，在膽堿乙?；D(zhuǎn)移酶(ChAT)啟動(dòng)子下采用表達(dá)Cre重組酶的轉(zhuǎn)基因小鼠系。立體定向注射攜帶結(jié)構(gòu)內(nèi)融合增加黃色熒光蛋白(eYFP)的編碼序列的黃光門控的第三代氯泵鹽細(xì)菌視紫紅質(zhì)(eNpHR3.0)基因的Cre-可誘導(dǎo)的腺伴隨病毒(AAV)載體。

具體而言，麻醉小鼠，然后放置在頭部立體定位裝置中。對(duì)4-6周齡小鼠進(jìn)行手術(shù)，并全程施用眼用軟膏以防眼睛干澀。在頭皮正中切口，然后行顱骨切開術(shù)，然后使用10μl注射器和34口徑金屬針注射AAV載體。通過注射泵控制注射體積和流速(在0.15μl/min下1μl)。各NAc接受兩次注射(注射1：AP 1.15mm,ML0.8mm,DV-4.8mm；注射2：AP 1.15mm,ML 0.8mm,DV-4.2mm)。選擇病毒注射和纖維位置，使得刺激幾乎全部腦殼。

接著，在卸下針頭之前，將NaYF₄:Yb/Er/Gd、納米粒子注射至Nac內(nèi)。使用3.4、8.5、或17納摩爾的NaYF4:Yb/Er/Gd、納米粒子的濃度。在完成AAV載體和鑭系元素?fù)诫s納米粒子的注射之后，將針對(duì)保持原位另外5分鐘，然后緩慢卸下。

在恢復(fù)期之后，再次麻醉小鼠，將小鼠的顱骨薄化，并將電磁輻射的NIR來源放置臨近薄化顱骨區(qū)域。使用光刺激根據(jù)之前所述的方法來同時(shí)進(jìn)行NIR刺激和細(xì)胞外電記錄(Gradinaru等，J.Neurosci.,27,14231-14238(2007))。電極由具有超出纖維300-500μm的電極端的鎢電極(1MΩ；.005英寸；聚對(duì)二甲苯絕緣體)構(gòu)成。以100μm增量降低通過NAc的電極，并且在各增量處記錄NIR上轉(zhuǎn)換的光響應(yīng)。在數(shù)字化和記錄至磁盤之前，將信號(hào)擴(kuò)增和過濾通帶(300Hz低截止，10kHz高截止)。在各位點(diǎn)處，呈現(xiàn)并保存5次重復(fù)刺激。

僅旨在對(duì)本發(fā)明進(jìn)行示例性并因此不應(yīng)認(rèn)為其以任何方式限制本發(fā)明的這些實(shí)施例還描述和詳述以上討論的本發(fā)明的方面和實(shí)施方案。通過闡述的方式而非限制的方式來提供前述實(shí)施例和詳細(xì)的描述。本說明書中所引用的所有出版物、專利申請(qǐng)、和專利通過引用方式并入本文中，如同明確且單獨(dú)地指出各單獨(dú)的出版物、專利申請(qǐng)、或?qū)＠ㄟ^引用方式并入一般。具體而言，本文所引用的所有出版物均通過引用方式明確并入本文中以用于描述和公開與本發(fā)明相關(guān)的組合物和方法。盡管出于清晰理解起見已經(jīng)通過闡述和實(shí)施例的方式對(duì)前述發(fā)明進(jìn)行了一定程度的詳述，但對(duì)本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員鑒于本發(fā)明的教導(dǎo)將顯而易見的是，在不脫離所附權(quán)利要求的精神和范圍的情況下可做出某些改變和修改。