本發(fā)明涉及一種復(fù)合水凝膠軟骨修復(fù)材料及其制備方法，特別涉及制備具有降解速率可調(diào)控，且降解行為熒光可視化功能的軟骨修復(fù)材料的方法。

背景技術(shù)：

軟骨是一種透明的軟組織，在關(guān)節(jié)潤滑、減震和承重中起重要作用。當(dāng)人體內(nèi)的軟骨發(fā)生損傷時(shí)，由于缺乏血液供應(yīng)，其再生能力很弱，要想治療只有采取體外移植軟骨替代材料進(jìn)行修復(fù)。因此研發(fā)力學(xué)性能優(yōu)良、在體降解程度可控及可視的軟骨修復(fù)材料具有迫切的必要性。

聚合物水凝膠因具有良好的力學(xué)性能、生物兼容性等性質(zhì)，引起了生物醫(yī)學(xué)界的廣泛關(guān)注。采用水凝膠制備生物體內(nèi)軟骨損傷修復(fù)材料具有諸多優(yōu)勢。聚乙烯醇(PVA)是一種無毒、無腐蝕性并且擁有良好的生物相容性的聚合物，其力學(xué)性能良好，且可生物降解，目前已被廣泛應(yīng)用于組織工程的支架材料、軟骨組織替代、修復(fù)等領(lǐng)域(J. P. Gong, Advanced Materials, 2003, 15，1155-1158)。目前已有許多研究者在PVA中摻雜與成骨細(xì)胞具有高度親和能力的納米羥基磷灰石（HA），從而達(dá)到提高軟骨修復(fù)材料的生物親和性并改善其力學(xué)性能的目的。

碳點(diǎn)是一種具有良好的上轉(zhuǎn)換熒光性能及生物兼容性的納米材料(Y. Y. Zhang, M. Wu, Y. Q. Wang, Talanta, 2013, 117, 196-202)，其較高的熒光量子產(chǎn)率為它在生物醫(yī)藥領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。目前，碳點(diǎn)在與聚合物材料的結(jié)合方面取得許多進(jìn)展(P. Zhang, W. C. Li, X. Y. Zhai, Chemical Communications, 2012, 48, 10431-10433；P. P. Li, Nanotechnology, 2014, 25, 055603-055609)。在臨床醫(yī)學(xué)應(yīng)用中，外科醫(yī)生發(fā)現(xiàn)，傳統(tǒng)的軟骨修復(fù)材料雖然力學(xué)性能良好，但是在實(shí)時(shí)、可視化跟蹤研究方面并不方便。要想跟蹤研究復(fù)合水凝膠軟骨修復(fù)材料移植入體內(nèi)后隨著生理代謝及機(jī)體正常的生命活動(dòng)，其轉(zhuǎn)移、變形及老化情況、受力后的變形情況及在體內(nèi)的降解程度等相對(duì)來說較為困難。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明旨在提供一種具有優(yōu)良力學(xué)性能、熒光自示蹤性能及降解速率可控功能的復(fù)合水凝膠軟骨修復(fù)材料及其制備方法，拓寬了人工關(guān)節(jié)軟骨的應(yīng)用范疇。該制備方法過程簡單，制備所得的復(fù)合水凝膠材料具有熒光示蹤性能，降解可控性能及良好的力學(xué)性能。

本發(fā)明提供了一種復(fù)合水凝膠軟骨修復(fù)材料，包括以下重量配比的原料：

碳點(diǎn)（CDs） 0-1.5%

納米羥基磷灰石（HA） 2%~6%

聚乙烯醇（PVA） 65%~85%

纖維蛋白凝膠 7.5%~33%

本發(fā)明提供了一種上述復(fù)合水凝膠軟骨修復(fù)材料的制備方法，首先采用碳點(diǎn)作為優(yōu)良的熒光信號(hào)源，采用聚乙烯醇作為高分子網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，采用納米羥基磷灰石作為共摻雜試劑，賦予了該水凝膠材料良好的骨組織親和性，制備得到碳點(diǎn)/納米羥基磷灰石/聚乙烯醇（CDs/HA/PVA）復(fù)合水凝膠軟骨修復(fù)材料，然后在其孔穴內(nèi)進(jìn)一步填充纖維蛋白凝膠。

上述復(fù)合水凝膠軟骨修復(fù)材料的制備方法，具體包括以下步驟：

①碳點(diǎn)的合成：將反應(yīng)容器用王水、乙醇、二次水依次洗滌后，先加入乳糖，再加入三羥甲基氨基甲烷，最后加入二次水，并攪拌均勻，在90℃-100℃下加熱回流，反應(yīng)進(jìn)行20-30h后即得到黃色的CDs溶液，所得產(chǎn)物透析24-48h；

②CDs/HA/PVA復(fù)合水凝膠的合成：稱取聚乙烯醇與納米羥基磷灰石并溶于去離子水中，90-100℃下加熱回流1-2h，然后將上述步驟①制備所得碳點(diǎn)溶液加入其中，于80-90℃下磁力攪拌1-4h，最后將該混合溶液冷卻至室溫并澆注于模具中，放入-15--20℃冰箱冷凍15-25h，然后取出并在室溫下放置10-15h解凍，如此冷凍-解凍循環(huán)3-10次，即可制備得到CDs/HA/PVA復(fù)合水凝膠，隨后采用冷凍干燥的方式將該水凝膠制成固體支架材料，冷凍干燥處理時(shí)間為36-48h；

③導(dǎo)入纖維蛋白原溶液：將纖維蛋白原溶液在負(fù)壓的條件導(dǎo)入到CDs/HA/PVA多孔支架中，然后在負(fù)壓的作用下把凝血酶的氯化鈣溶液導(dǎo)入，用無菌紗布吸去支架表面液體，將該材料置于恒溫培養(yǎng)箱中，充分孵育0.5-1h，待纖維蛋白原完全凝膠，最終得到孔穴內(nèi)填充有纖維蛋白凝膠的CDs/HA/PVA復(fù)合水凝膠軟骨修復(fù)材料。

上述制備方法中，所述碳點(diǎn)（CDs）的合成中，乳糖溶液的濃度為1.0-6.0g/L，三羥甲基氨基甲烷溶液的濃度為20.0-100.0g/L，采用逐滴加入NaOH稀溶液的方式調(diào)節(jié)該混合溶液的pH為9.5-11.5，隨后于100℃下加熱回流24-48小時(shí)。

上述制備方法中，所述CDs/HA/PVA復(fù)合水凝膠的合成中，所用碳點(diǎn)的濃度為0.5-4.0 mg/mL，所用各試劑比例為：水、碳點(diǎn)溶液的體積比為10：1-20：1，水、聚乙烯醇的質(zhì)量比為10:1-40:1。

上述制備方法中，所述步驟③中，CDs/HA/PVA復(fù)合水凝膠置于負(fù)壓中，采用注射器導(dǎo)入10-25mg/mL的纖維蛋白原溶液，隨后導(dǎo)入凝血酶（2-10U/mL)的氯化鈣溶液，氯化鈣溶液的濃度為0.01-0.05mol/mL，用無菌紗布吸去支架表面液體，最后將該材料置于35℃-40℃的恒溫培養(yǎng)箱中，充分孵育0.5-1h。

本發(fā)明在PVA水凝膠材料中摻雜碳點(diǎn)，由于碳點(diǎn)表面富含大量的羥基，可與聚乙烯醇上的羥基間形成良好的氫鍵相互作用，從而使碳點(diǎn)摻雜于HA/PVA的高分子網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中。通過觀察熒光信號(hào)的強(qiáng)度及范圍，便可實(shí)時(shí)掌握該軟骨替代材料在機(jī)體內(nèi)的降解程度。纖維蛋白原是人體血液蛋白的重要組成部分，含量極其豐富，其具有優(yōu)異的生物相容性和生物降解性能。纖維蛋白凝膠可誘使軟骨細(xì)胞再生并與周圍組織自然融合。通過調(diào)節(jié)PVA水凝膠中纖維蛋白原的比例，即可調(diào)節(jié)該軟骨支架材料的生物降解過程，從而實(shí)現(xiàn)軟骨修復(fù)材料的降解速率可控性。

本發(fā)明的有益效果：

1）碳點(diǎn)通過氫鍵作用力結(jié)合于聚丙烯酰胺的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中，不僅可賦予該軟骨修復(fù)材料熒光自示蹤能力，而且可提高其力學(xué)性能。

2）將纖維蛋白凝膠填充于水凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)內(nèi)，可賦予該軟骨修復(fù)材料誘導(dǎo)成骨細(xì)胞生長與分化的能力，并且通過調(diào)節(jié)纖維蛋白凝膠的比例，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)該軟骨修復(fù)材料降解速率的調(diào)控。

附圖說明

圖1是不同碳點(diǎn)含量的CDs/HA/PVA復(fù)合水凝膠在受到初始長度50%的拉伸變形情況下，循環(huán)加載-卸載時(shí)的應(yīng)力-應(yīng)變曲線圖。該復(fù)合水凝膠材料中碳點(diǎn)所占的質(zhì)量比分別為0%，0.3%，0.6%，0.9%，1.2%，1.5%。

圖2是不同碳點(diǎn)含量的CDs/HA/PVA復(fù)合水凝膠的熒光發(fā)射光譜圖。該復(fù)合水凝膠材料中碳點(diǎn)所占的質(zhì)量比分別為0%，0.6%，1.2%，1.5%。

圖3是不同碳點(diǎn)含量的CDs/HA/PVA復(fù)合水凝膠的溶脹率曲線圖。該復(fù)合水凝膠材料中碳點(diǎn)所占的質(zhì)量比重分別為0%，0.9%，1.5%。

具體實(shí)施方式

下面通過實(shí)施例來進(jìn)一步說明本發(fā)明，但不局限于以下實(shí)施例。

實(shí)施例1：一種復(fù)合水凝膠軟骨修復(fù)材料的制備方法

具體制備過程包括如下步驟：

①碳點(diǎn)（CDs）的合成：將反應(yīng)容器用王水、乙醇、二次水依次洗滌后，先加入0.2g乳糖，再加入4.0g三羥甲基氨基甲烷（Tris），最后加入100mL的二次水，并攪拌均勻，在100℃下加熱回流，采用稀NaOH溶液逐滴加入的方式調(diào)節(jié)溶液pH至10.5，反應(yīng)進(jìn)行24h后即得到黃色的CDs溶液，所得產(chǎn)物透析48h；

②稱取3g聚乙烯醇(PVA)與0.1g納米羥基磷灰石(HA)并溶于20mL去離子水中，90℃下加熱回流1h，然后將4.5mL的上述步驟①制備所得碳點(diǎn)溶液加入其中，于85℃下磁力攪拌2h，最后將該混合溶液冷卻至室溫并澆注于模具中，放入-20℃冰箱冷凍20h，然后取出并在室溫下放置10h解凍，如此冷凍-解凍循環(huán),5次，即可制備得到CDs/HA/PVA復(fù)合水凝膠；

③采用冷凍干燥的方式將該水凝膠制成固體支架材料，冷凍干燥時(shí)間為48h，隨后將20mg/mL的纖維蛋白原溶液在負(fù)壓的條件導(dǎo)入到CDs/HA/PVA多孔支架中，并在負(fù)壓的作用下把3.0U/mL凝血酶的氯化鈣溶液導(dǎo)入，用無菌紗布吸去支架表面液體，將該材料置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中，充分孵育30min，待纖維蛋白原完全凝膠，最終得到孔穴內(nèi)填充有纖維蛋白凝膠的CDs/HA/PVA水凝膠軟骨修復(fù)材料，如圖1中曲線2所對(duì)應(yīng)即為按照實(shí)施例1的步驟制備所得樣品，該樣品中所對(duì)應(yīng)碳點(diǎn)的重量比為0.3%。

實(shí)施例2：一種復(fù)合水凝膠軟骨修復(fù)材料的制備方法

實(shí)驗(yàn)條件和操作步驟與實(shí)施例1部分相同，改變的條件如下：

將0mL的碳點(diǎn)溶液加入該混合溶液，制備得到HA/PVA復(fù)合水凝膠。如圖1中曲線1所對(duì)應(yīng)即為按照本實(shí)施例制備所得樣品，該樣品中所對(duì)應(yīng)碳點(diǎn)的重量比為0%。

實(shí)施例3：一種復(fù)合水凝膠軟骨修復(fù)材料的制備方法

實(shí)驗(yàn)條件和操作步驟與實(shí)施例1部分相同，改變的條件如下：

將9mL的碳點(diǎn)溶液加入該混合溶液，制備得到HA/PVA復(fù)合水凝膠。如圖1中曲線3所對(duì)應(yīng)即為按照本實(shí)施例制備所得樣品，該樣品中所對(duì)應(yīng)碳點(diǎn)的重量比為0.6%。

實(shí)施例4：一種復(fù)合水凝膠軟骨修復(fù)材料的制備方法

實(shí)驗(yàn)條件和操作步驟與實(shí)施例1其他相同，改變的條件如下：

將13.5mL的碳點(diǎn)溶液加入該混合溶液，制備得到HA/PVA復(fù)合水凝膠。如圖1中曲線4所對(duì)應(yīng)即為按照本實(shí)施例制備所得樣品，該樣品中所對(duì)應(yīng)碳點(diǎn)的重量比為0.9%。

實(shí)施例5：一種復(fù)合水凝膠軟骨修復(fù)材料的制備方法

實(shí)驗(yàn)條件和操作步驟與實(shí)施例1其他相同，改變的條件如下：

將18mL的碳點(diǎn)溶液加入該混合溶液，制備得到HA/PVA復(fù)合水凝膠。如圖1中曲線5所對(duì)應(yīng)即為按照本實(shí)施例制備所得樣品，該樣品中所對(duì)應(yīng)碳點(diǎn)的重量比為1.2%。

實(shí)施例6：一種復(fù)合水凝膠軟骨修復(fù)材料的制備方法

實(shí)驗(yàn)條件和操作步驟與實(shí)施例1其他相同，改變的條件如下：

將22.5mL的碳點(diǎn)溶液加入該混合溶液，制備得到HA/PVA復(fù)合水凝膠。如圖1中曲線6所對(duì)應(yīng)即為按照本實(shí)施例制備所得樣品，該樣品中所對(duì)應(yīng)碳點(diǎn)的重量比為1.5%。

用熒光分光光度計(jì)測定制備所得的CDs/HA/PVA水凝膠（熒光分光光度計(jì)：Horiba，日本，F(xiàn)luoroMax-4；激發(fā)狹縫10nm，發(fā)射狹縫10nm，激發(fā)波長設(shè)定在400nm，在450-750nm范圍內(nèi)記錄熒光發(fā)射光譜的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，光電培增管的電壓為950V）。

圖1是不同碳點(diǎn)含量的CDs/HA/PVA復(fù)合水凝膠在受到初始長度50%的拉伸變形情況下，循環(huán)加載-卸載時(shí)的應(yīng)力-應(yīng)變曲線圖。該復(fù)合水凝膠材料中碳點(diǎn)所占的質(zhì)量比重分別為0%，0.3%，0.6%，0.9%，1.2%，1.5%。圖中顯示，隨著復(fù)合水凝膠中碳點(diǎn)所占的質(zhì)量百分比的增加，復(fù)合材料的抗拉剛度逐漸減小，但是總體影響不大，復(fù)合材料的機(jī)械強(qiáng)度仍在軟骨修復(fù)材料的可應(yīng)用范圍。

圖2是不同碳點(diǎn)含量的CDs/HA/PVA復(fù)合水凝膠的熒光發(fā)射光譜圖。該復(fù)合水凝膠材料中碳點(diǎn)所占的質(zhì)量比重分別為0%，0.6%，1.2%，1.5%。圖中顯示，隨著碳點(diǎn)所占質(zhì)量百分比的增加，復(fù)合水凝膠的熒光強(qiáng)度也在逐漸增強(qiáng)。

圖3是不同碳點(diǎn)含量的CDs/HA/PVA復(fù)合水凝膠的溶脹率曲線圖。該復(fù)合水凝膠材料中碳點(diǎn)所占的質(zhì)量比重分別為0%，0.9%，1.5%。圖中顯示，隨著碳點(diǎn)所占質(zhì)量百分比的增加，復(fù)合水凝膠達(dá)到溶脹平衡所需的時(shí)間越短。