本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥技術(shù)，特別涉及一種以芫花酯甲為活性成分的干粉吸入制劑，該制劑可以提高藥效，濃集藥物濃度，減少對非靶部位的毒副作用。

背景技術(shù)：

肺癌是目前最為常見的惡性腫瘤之一，在全球范圍內(nèi)，肺癌的發(fā)病率和死亡率都呈上升態(tài)勢，這種趨勢在中國等發(fā)展中國家尤為顯著。在我國，肺癌的發(fā)病率和死亡率已居所有惡性腫瘤之首，其中男性發(fā)病率和死亡率均居第一位，女性發(fā)病率居第二位(僅低于乳腺癌)，死亡率則居第一位。工業(yè)化迅速發(fā)展導(dǎo)致的環(huán)境污染和居高不下的吸煙率使得肺癌對我國居民的危害在逐漸增大，為了控制肺癌發(fā)病率和死亡率的增長，我國衛(wèi)生部已將肺癌列為今后癌癥防治的重點

目前，肺癌的治療手段主要包括：手術(shù)、化療、放療、分子靶向治療、介入治療等，雖然根治性手術(shù)至今仍是唯一有可能治愈肺癌患者的方式，但是中醫(yī)藥在穩(wěn)定瘤灶、延長帶瘤生存時間、減輕放化療毒副作用等方面表現(xiàn)出了一定的療效和優(yōu)勢，已經(jīng)成為肺癌治療的重要組成部分，我們的研究就主要集中在中草藥中某些成分治療肺癌的可行性。

芫花為瑞香科植物，主要有效成分為植物中罕見的瑞香烷型二砧原酸酯類化合物，包括芫花酯甲(yuanhuacine)、芫花酯乙(yuanhuadine)、芫花酯丙(yuanhuafine)、芫花酯丁(yuanhuatine)、芫花酯戊(yuanhuapine)，主要成分為芫花酯甲，早期主要用于中期妊娠引產(chǎn)和利尿等作用。前期研究表明，芫花酯甲對多種腫瘤細胞具有較強的殺傷作用，其結(jié)構(gòu)與喜樹堿類完全不同,屬于新結(jié)構(gòu)類型的DNA拓撲異構(gòu)酶I抑制劑。Zha-Jun Zhan等報道了芫花酯甲對P-388淋巴白血病細胞(IC50 30.0μM),人肺癌A-549(IC50 0.15μM)和人血管內(nèi)皮細胞HMEC(IC50 14.0μM)的體外抑制活性，結(jié)果顯示其對肺癌抑制活性最為顯著。韓國癌癥研究所Bo-Young Park等研究了芫花酯甲對HL-60人早幼骨髓性白血病細胞(IC50 10.8μM)和SNU-1胃癌細胞的體外抑制活性(IC50 13.7μM)，結(jié)果顯示其抗癌活性顯著，證明其能夠激活細胞凋亡過程，包括DNA斷裂，染色質(zhì)凝聚，使細胞周期停止在G1期。

如上所述，芫花酯甲是一種罕見的全新天然結(jié)構(gòu)骨架的抗腫瘤活性成分，體外抗癌活性強于與其它臨床常用的天然抗癌藥物。芫花酯甲治療癌癥的作用雖令人鼓舞，但在使用的同時依然存在嚴重的毒副作用，對皮膚及粘膜有一定的刺激性，有一定的細胞毒性，同時給藥后對肝臟和腎臟等器官均有較大的毒性甚至還存在一定的生殖毒性，對人體的傷害較大，這就為應(yīng)用芫花酯甲治療肺癌帶來了不便。

肺部給藥治療呼吸系統(tǒng)局部疾病在臨床上的應(yīng)用由來已久，局部給藥能直接將藥物運送至肺部發(fā)揮藥效，一方面可減少治療肺部疾病的藥物用量，另一方面也可以減小藥物的全身毒副作用，是治療呼吸系統(tǒng)疾病理想的給藥途徑，廣泛的應(yīng)用于治療肺炎、肺癌、哮喘、急性肺損傷等肺部局部疾病。近些年來，干粉吸入劑(dry powder inhalation,DPI)已逐漸成為肺部給藥研究的關(guān)注點，干粉吸入劑是指微粉化藥物或與載體以膠囊、泡囊或多劑量貯庫形式，采用特制的干粉吸入裝置，由患者主動吸入霧化藥物至肺部的制劑，可發(fā)揮局部或全身作用。

在干粉吸入劑中由于微粉化后的藥物粒徑小，易團聚而難以分散，流動性不佳，穩(wěn)定性無法保證，因此，性能優(yōu)良的載體是提高藥物粉末霧化效果和穩(wěn)定性的關(guān)鍵因素。常用的材料主要分為四類：碳水化合物、氨基酸類、無機鹽類、蛋白質(zhì)類?，F(xiàn)有的研究表明DPI中粗糙乳糖和細粉乳糖的比例對其肺部沉積量有著顯著的影響，研究發(fā)現(xiàn)，重結(jié)晶乳糖表面細粉顆粒濃度增加使得表面更為粗糙，有效改善藥物在肺部的沉積，但是載體乳糖的粒徑過小無法改善藥物的分散性，粒徑過大，則由于慣性碰撞會沉積在呼吸道的上部，影響對藥物的輸送能力。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于解決芫花酯甲在治療肺癌時所帶來的許多毒性等問題，克服在應(yīng)用上的障礙，通過大量實驗篩選，創(chuàng)新性的將芫花酯甲用于肺部給藥，選用乳糖作為芫花酯甲干粉吸入劑DPI的載體材料。并且本發(fā)明在體外通過新一代的藥用撞擊器，通過大量實驗篩選肺部給藥干粉吸入劑處方，模擬活體的肺部給藥方式，篩選最佳的處方工藝，使得藥物最大可能的沉積于肺泡，用于藥物的肺部給藥。

技術(shù)方案：為了達到以上目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案如下：

一種具有抗肺癌活性的干粉吸入劑，它包括芫花酯甲和乳糖載體，所述的乳糖載體由直徑大于110μm的粗糙乳糖和直徑為4-11μm的細粉乳糖混合制成。

作為優(yōu)選方案，以上所述的具有抗肺癌活性的干粉吸入劑，芫花酯甲的重量份數(shù)為1，乳糖載體的重量份數(shù)為1-10。

作為優(yōu)選方案，以上所述的具有抗肺癌活性的干粉吸入劑，直徑大于110μm的粗糙乳糖和直徑為4-11μm的細粉乳糖的重量比為5-50:1。

作為優(yōu)選方案，以上所述的具有抗肺癌活性的干粉吸入劑，干粉吸入劑通過干粉吸入裝置給藥。

有益效果：本發(fā)明提供的以芫花酯甲為活性成分的抗肺癌活性的干粉吸入劑與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點：

1、本發(fā)明創(chuàng)新的將芫花酯甲制成肺部局部給藥，能直接將芫花酯甲運送至肺部發(fā)揮藥效，可減少治療肺部疾病的藥物用量，提高在靶部位的濃度，減小藥物的全身毒副作用，安全性更高，不良反應(yīng)更低。

2、本發(fā)明通過大量實驗篩選，選用乳糖作為芫花酯甲干粉吸入劑DPI的載體材料，并且本發(fā)明在體外通過新一代的藥用撞擊器，通過大量實驗篩選肺部給藥干粉吸入劑處方用量，模擬活體的肺部給藥方式，篩選最佳的處方工藝。

附圖說明

圖1為本發(fā)明實施例1中芫花酯甲的結(jié)構(gòu)示意圖圖；

圖2為本發(fā)明實施例2中不同處方芫花酯甲干粉吸入劑DPI的FPF值；

圖3為本發(fā)明實施例3中芫花酯甲兩種不同給藥方式的組織分布圖；

圖4為本發(fā)明實施例3中芫花酯甲兩種不同給藥方式的相對攝取效率圖；

圖5為本發(fā)明實施例3中芫花酯甲兩種不同給藥方式在靶組織的峰濃度比。

具體實施方式

實施例1：芫花酯甲的液相條件及標(biāo)曲的建立

試驗采用芫花酯甲原料藥，結(jié)構(gòu)式如圖1，建立液相分析條件，色譜柱：Merck C18柱(4.6mm×250mm,5μm)，流動相：甲醇—水(82:18)，柱溫為40℃，流速1.0mL/min，檢測波長233nm，進樣量20μL。以峰面積(A)為縱坐標(biāo)，濃度(C)為橫坐標(biāo)進行線性回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：A＝19910C-12788(r²＝1，準(zhǔn)確度、精密度和回收率良好，符合分析方法要求)，線性范圍2.5-80μg/mL。

實施例2：芫花酯甲干粉吸入劑的制備

處方中所使用的乳糖為粗糙乳糖(d＞110μm)和細粉乳糖(d:4-11μm)，通過改變兩者的比例后制成干粉吸入劑(DPI)，以考察乳糖粒徑對芫花酯甲DPI肺部給藥性能的影響，五種處方見下表，稱取處方量的粗糙乳糖和細粉乳糖，各處方均并按芫花酯甲與總?cè)樘堑闹亓糠輸?shù)為1：5稱取芫花酯甲，混合均勻。

表1不同比例的粗糙乳糖與細粉乳糖的芫花酯甲DPI處方

實施例3：藥用撞擊器對芫花酯甲干粉吸入制劑處方篩選實驗方法

將實施例2中的各處方分別制成20粒含藥膠囊，每粒膠囊中含有粉末50mg。用NGI裝置在60L/min的流速模擬人體肺部給藥，用50％的甲醇水沖洗各個收集盤和適配器等部件，12000r/min離心5min后取上清液置于液相小瓶中，用于芫花酯甲DPI體外肺部沉積量的測定。進樣后計算NGI裝置各級的藥物沉積量。結(jié)果見表2。

表2：不同處方的芫花酯甲DPI在NGI裝置中的各級沉積量

體外沉積率FPF的計算結(jié)果

體外沉積率(FPF)是考察DPI空氣動力學(xué)粒徑分布的最直觀的指標(biāo)，能夠用以表征DPI在肺部的有效沉積量。FPF是指60L/min標(biāo)準(zhǔn)流速條件下，能沉積到肺部的有效微細粒子劑量，在數(shù)據(jù)計算中則表現(xiàn)為二到七級的藥物沉積量之和，將二到七級的藥物沉積量加和得到各個處方DPI的FPF值，根據(jù)規(guī)定FPF值在大于12％時可以有效的沉積于肺部，見圖2，由圖2可知，隨著細粉乳糖比例的增加，該DPI的FPF值一開始呈上升的趨勢，當(dāng)細粉乳糖的量達到9.1％(即粗糙乳糖量：細粉乳糖量＝10:1)的時候，F(xiàn)PF值又開始下降，據(jù)此趨勢可知，在5-50：1范圍內(nèi)，F(xiàn)PF均符合要求，且當(dāng)細粉乳糖的量達到9.1％時，該DPI有最高的FPF值，能夠沉積在肺部的藥物量最高，表明能夠到達肺部發(fā)揮療效的芫花酯甲量最多。

實施例4：芫花酯甲DPI肺部吸入及靜脈注射后組織分布研究

實驗藥物配置：選取實施例3中的處方三(粗糙乳糖量：細粉乳糖量＝10:1)制備DPI，芫花酯甲與總?cè)樘堑闹亓勘葹?:5。另精密稱取芫花酯甲2mg，用一定量的DMSO溶解，再用生理鹽水稀釋至75μg/mL用于靜脈注射芫花酯甲。

D大鼠雌雄各半，分為2組，每組72只，一組尾靜脈注射芫花酯甲，另外一組肺部吸入芫花酯甲，劑量為100μg/kg,于給藥后1、2、3、4、6、9h將大鼠處死。處死大鼠后取心、肝、脾、肺、腎、腦和睪丸(子宮，卵巢)，用生理鹽水洗凈，隨后用濾紙吸干殘留生理鹽水。

取大鼠各組織樣品(心、肝、脾、肺、腎、腦、子宮、卵巢、睪丸)，稱重，按組織重量與生理鹽水體積比為1:3加入生理鹽水制成勻漿液，吸取各組織勻漿液100μL于2mL的尖底離心管中，加入內(nèi)標(biāo)液10μL，400μL的Na2CO3溶液(0.02M)搖振，再加入1mL的萃取試劑(乙醚：二氯甲烷＝8:1)，渦旋混合5min，離心(12000r/min)5min，上清液轉(zhuǎn)移至1.5mL離心管中，37℃旋轉(zhuǎn)濃縮至干，殘渣用100μL甲醇復(fù)溶，離心(12000r/min)5min，取上清液用于UHPLC-MS/MS分析。

組織分布圖，見圖3。實驗結(jié)果表明，芫花酯甲在脾，肺，腎以及雌性生殖系統(tǒng)中均有分布，在心，肝，腦和睪丸中幾乎檢測不到，同時由圖3可以看出芫花酯甲肺部吸入后在肺部的濃度顯著高于靜脈注射，同時可大大降低在脾，腎和生殖系統(tǒng)的濃度。

靶向評價參數(shù)可以更直觀地評價給藥系統(tǒng)的靶向性，本實驗采用了相對攝取率、峰濃度比、靶向效率以及相對靶向效率四個指標(biāo)對制劑的肺靶向性能進行評價。結(jié)果如下：

1.相對攝取率(relative ratio,Re)考察的是兩種給藥方式在肺組織中AUC的比值，即Re＝(AUCTT)p/(AUCTT)i,其中，TT表示靶組織(targeting tissue)，p表示肺部給藥組(pulmonary administration)，i表示靜脈給藥組(intravenous administration)。Re大于1表示肺部給藥組相對于靜脈給藥組對肺組織有靶向性，Re越大靶向性越強，實驗結(jié)果如圖4所示。RE＝6.1，肺部給藥組在肺組織中的相對攝取率大于1，表明肺部給藥組相對于靜脈給藥組，具有一定的肺靶向性。

2.峰濃度比(concentration ratio，Ce)考察的是兩種給藥方式在靶組織中Cmax的比值,即Ce＝(CmaxTT)p/(CmaxTT)i，其中，TT表示靶組織(targeting tissue)，p表示肺部給藥組(pulmonary administration)，i表示靜脈給藥組(intravenous administration)。峰濃度比Ce值表明制劑改變藥物分布的效果，Ce值越大，表明改變藥物分布的效果越明顯。肺部給藥組相對于靜脈給藥組的峰濃度比如圖5所示，Ce＝5.07。相對于靜脈給藥組，肺部給藥組能改善芫花酯甲在肺組織的分布。

3.靶向效率(targeting efficiency,Te)是同一種給藥方式在靶組織中的AUC與非靶組織的AUC的比值，即Te＝AUC_TT/AUCN_TT，其中TT表示靶組織(targeting tissue)，NTT表示非靶組織(non-targeting tissue)。Te值越大，則表明相對于被比較的非靶組織，該給藥方式對靶組織的選擇性越強。靜脈給藥組和肺部給藥組的靶向效率如表3所示。

表3芫花酯甲不同給藥方式在大鼠各組織中的靶向效率

以肺為靶組織，其它組織為非靶組織計算得到靶向效率Te，如以上表3所示，它反映了靜脈給藥和肺部給藥對于肺組織的選擇性，可見藥物顯著濃集于肺部，且在腎及生殖系統(tǒng)中的濃度較小，從而毒性較小。