本發(fā)明涉及探針技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種細胞標記探針及其制備方法。

背景技術(shù)：

細胞治療是通過將自體或異體功能細胞在體外進行培養(yǎng)，而后回輸?shù)讲∪梭w內(nèi)，借助細胞自身治療和免疫功能達到疾病治療目的，作為一種有效的臨床疾病治療方案備受關(guān)注。然而，回輸?shù)襟w內(nèi)的細胞，其聚集部位難以判別，對注射部位的準確性難以做出診斷，從而影響其治療功能發(fā)揮。因此在臨床實施中，急需非侵入性成像技術(shù)對回輸細胞監(jiān)測。

磁共振成像技術(shù)，光學成像技術(shù)，以及光聲成像技術(shù)，在活體標記與示蹤治療細胞方面具有較大應(yīng)用潛能，當結(jié)合高靈敏度造影劑探針能夠極大地增強成像靈敏度，獲得細胞準確的生物學信息。利用納米探針對細胞進行標記，則可以很好地獲得細胞成像并進行示蹤分析。

現(xiàn)有細胞標記用探針材料制備技術(shù)一般是通過陽離子脂質(zhì)體或陽離子聚合物包裹或修飾納米粒子形成復合粒子，通過陽離子與細胞膜表面的磷脂雙分子層相互作用，促使細胞內(nèi)吞，完成標記。但是這種強靜電相互作用往往致使細胞膜破損，造成細胞損傷。因此以陽離子脂質(zhì)體以及陽離子聚合物，構(gòu)建納米探針表現(xiàn)出較大的生物毒性。陰離子型納米探針則具備較高生物安全性，但構(gòu)建復雜，往往難以形成較好的細胞標記效果。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明主要解決的技術(shù)問題是提供一種細胞標記探針及其制備方法，能夠具備較好的成像性能以及良好的生物相容性，且其構(gòu)建也比較簡單方便。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的一個技術(shù)方案是：提供一種細胞標記探針，所述探針包括納米粒子或量子點以及包裹或修飾所述納米粒子或量子點的抗壞血酸棕櫚酸酯。

其中，所述探針還包括熒光染料。

其中，所述納米粒子為氧化鐵納米粒子。

其中，所述納米粒子為四氧化三鐵納米粒子，所述熒光染料為IR780染料。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的另一個技術(shù)方案是：提供一種細胞標記探針的制備方法，所述方法包括：提供納米粒子或量子點、抗壞血酸棕櫚酸酯，并使之混合均勻；向混合均勻后的混合物中加入揮發(fā)性有機溶劑和水，并使之震蕩均勻；將震蕩均勻后的混合物中的所述揮發(fā)性有機溶劑揮發(fā)完全，進而獲得所述抗壞血酸棕櫚酸酯包裹或修飾所述納米粒子或量子點的所述細胞標記探針。

其中，所述提供納米粒子或量子點、抗壞血酸棕櫚酸酯，并使之混合均勻的步驟，包括：提供納米粒子或量子點、抗壞血酸棕櫚酸酯以及熒光染料，并使之混合均勻。

其中，所述納米粒子為四氧化三鐵納米粒子，所述揮發(fā)性有機溶劑為四氫呋喃。

其中，所述四氧化三鐵納米粒子為0.001-0.5重量份，所述抗壞血酸棕櫚酸酯為0.001-10重量份，所述四氫呋喃為1-10重量份，所述水為5-100重量份。

其中，所述提供納米粒子或量子點、抗壞血酸棕櫚酸酯，并使之混合均勻的步驟，包括：提供四氧化三鐵納米粒子、抗壞血酸棕櫚酸酯以及IR780染料，并使之混合均勻，其中，所述IR780染料為0.001-1重量份。

其中，所述提供四氧化三鐵納米粒子的步驟，包括：提供濃度為2-10毫克每毫升、分散在三氯甲烷、正己烷或二氯甲烷中的四氧化三鐵納米膠體溶液；將所述四氧化三鐵納米膠體溶液中的三氯甲烷、正己烷或二氯甲烷揮發(fā)完全，進而獲得所述四氧化三鐵納米粒子。

其中，所述向混合均勻后的混合物中加入揮發(fā)性有機溶劑和水，并使之震蕩均勻的步驟，包括：向混合均勻后的混合物中加入1-10重量份的四氫呋喃，在25-30攝氏度下，進行超聲處理，并將超聲處理后的混合物加入到5-100重量份水中，震蕩均勻；所述四氫呋喃是通過減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)方法揮發(fā)完全的。

本發(fā)明的有益效果是：區(qū)別于現(xiàn)有技術(shù)的情況，本發(fā)明細胞標記探針包括納米粒子或量子點以及包裹或修飾所述納米粒子或量子點的抗壞血酸棕櫚酸酯，由于該細胞標記探針是一類陰離子型探針，因此具有良好的生物相容性，且具備較好的成像性能。該探針的制備方法包括提供納米粒子或量子點、抗壞血酸棕櫚酸酯，并使之混合均勻；向混合均勻后的混合物中加入揮發(fā)性有機溶劑和水，并使之震蕩均勻；將震蕩均勻后的混合物中的所述揮發(fā)性有機溶劑揮發(fā)完全，進而獲得該探針，相比較現(xiàn)有的陰離子型納米探針的制備工藝，該探針的制備工藝簡單方便，操作步驟少，材料價格也不昂貴。

附圖說明

圖1是樣品1、樣品2以及水的磁共振成像檢測結(jié)果示意圖；

圖2是樣品2和水的光聲成像檢測結(jié)果示意圖；

圖3是樣品1的細胞磁共振成像檢測結(jié)果示意圖；

圖4是樣品1的細胞毒性檢測結(jié)果示意圖；

圖5是本發(fā)明細胞標記探針的制備方法一實施方式的流程圖；

圖6是樣品1的動態(tài)光散射檢測圖片示意圖；

圖7是樣品3的動態(tài)光散射檢測圖片示意圖。

具體實施方式

下面結(jié)合附圖和實施方式對本發(fā)明進行詳細說明。

本發(fā)明提供一種細胞標記探針，該探針包括納米粒子或量子點以及包裹或修飾所述納米粒子或量子點的抗壞血酸棕櫚酸酯。

納米粒子是指粒度在1-100nm之間的粒子(納米粒子又稱超細微粒)，屬于膠體粒子大小的范疇。它們處于原子簇和宏觀物體之間的過度區(qū)，處于微觀體系和宏觀體系之間，是由數(shù)目不多的原子或分子組成的集團，因此它們既非典型的微觀系統(tǒng)亦非典型的宏觀系統(tǒng)。

納米材料在醫(yī)學和生物工程也有許多應(yīng)用。已成功開發(fā)以納米磁性材料為藥物載體的靶向藥物，稱為“生物導彈”。即在磁性Fe₃O₄納米微粒包敷的蛋白質(zhì)表面攜帶藥物，注射進入人體血管，通過磁場導航輸送到病變部位釋放藥物，可減少肝、脾、腎等所受由于藥物產(chǎn)生的副作用。利用納米傳感器可獲取各種生化反應(yīng)的信息和電化學信息。還可以利用納米粒子研制成納米機器人，注入人身的血液，對人體進行全身健康檢查，疏通腦血管中血栓，清除心臟動脈脂肪沉積物，甚至還能吞噬病毒，殺死癌細胞等，可以預(yù)言，隨著制備納米材料技術(shù)的發(fā)展和功能開發(fā)，會有越來越多的新型納米材料在眾多的高科技領(lǐng)域中得到廣泛的應(yīng)用。

量子點(quantum dot)是準零維的納米材料，由少量的原子所構(gòu)成。粗略地說，量子點三個維度的尺寸都在100nm以下，外觀恰似一極小的點狀物。量子點一般為球形或類球形，是由半導體材料(通常由IIB～ⅥA或IIIA～VA元素組成)制成的、穩(wěn)定直徑在2-20nm的納米粒子，在光學生物標記等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用情景。

抗壞血酸棕櫚酸酯為棕櫚酸與L-抗壞血酸等天然成分酯化而成，其分子式為C₂₂H₃₈O₇，是一種高效的氧清除劑和增效劑，被世界衛(wèi)生組織(WHO)食品添加劑委員會評定為具有營養(yǎng)性、無毒、高效、使用安全的食品添加劑，是我國唯一可用于嬰幼兒食品的抗氧化劑，本品用于食品可起到抗氧化、食品(油脂)護色、營養(yǎng)強化等功效。

因此，采用抗壞血酸棕櫚酸酯包裹或修飾納米粒子或量子點，構(gòu)建而成的探針具有良好的生物相容性，該探針標記細胞之后可以用于細胞治療，不會對細胞造成損傷。

其中，該探針還包括熒光染料。熒光染料泛指吸收某一波長的光波后能發(fā)射出另一波長大于吸收光的光波的物質(zhì)。標記上熒光染料，還可以進一步進行熒光檢測。

其中，該納米粒子為氧化鐵納米粒子。氧化鐵納米粒子是一種多功能材料。當氧化鐵顆粒尺寸小到納米級(1～100nm)時，其表面原子數(shù)、比表面積和表面能等均隨著粒徑的減小而急劇增加，從而表現(xiàn)出小尺寸效應(yīng)、量子尺寸效應(yīng)、表面效應(yīng)和宏觀量子隧道效應(yīng)等特點，具有良好的光學性質(zhì)、磁性、催化性能等。

進一步，該納米粒子為四氧化三鐵納米粒子，該熒光染料為IR780染料。當然，該納米粒子還可以是四氧化三鐵納米粒子之外的其他納米粒子，例如納米金等；該熒光染料可以是IR780染料之外的其他熒光染料，例如吲哚菁綠等。

下面以樣品1的探針和樣品2的探針為例來說明本發(fā)明的探針的成像性能以及生物相容性。其中，樣品1和樣品2中，納米粒子均是四氧化三鐵納米粒子，樣品1沒有標記熒光染料，樣品2標記有IR780染料。

參見圖1，圖1是樣品1、樣品2以及水的磁共振成像檢測結(jié)果示意圖。從圖1可以看出，樣品1與樣品2納米探針，其橫向弛豫成像性能與對照組的水相比，呈現(xiàn)出明顯的信號差異。當該探針標記細胞的時候，根據(jù)這種信號差異，可以判斷出標記細胞所在的位置，或者哪里有標記細胞，哪里沒有標記細胞。

參見圖2，圖2是樣品2和水的光聲成像檢測結(jié)果示意圖(原始圖片是彩色的圖片)。光聲成像(Photoacoustic Imaging，PAI)是近年來發(fā)展起來的一種非入侵式和非電離式的新型生物醫(yī)學成像方法。當脈沖激光照射到生物組織中時，組織的光吸收域?qū)a(chǎn)生超聲信號，稱這種由光激發(fā)產(chǎn)生的超聲信號為光聲信號。

從圖2可以看出，樣品2納米探針其光聲成像性能與對照組的水相比，呈現(xiàn)出明顯的信號差異。當該探針標記細胞的時候，根據(jù)這種信號差異，可以判斷出標記細胞所在的位置，或者哪里有標記細胞，哪里沒有標記細胞。

參見圖3，圖3是樣品1的細胞磁共振成像檢測結(jié)果示意圖。從圖3可以看出，樣品1納米探針標記細胞后，細胞呈現(xiàn)明顯的信號差異。

參見圖4，圖4是樣品1的細胞毒性檢測結(jié)果示意圖。圖4中，橫坐標是鐵在細胞培養(yǎng)基中的濃度，反應(yīng)的是環(huán)境中探針的量對細胞的影響；第一個柱形圖對應(yīng)的是控制組?？v坐標是細胞生存能力。從圖4可以看出，鐵的濃度從1-25微克每毫升培養(yǎng)基情況下(ug/ml)，細胞的生存能力均大于100％，這說明樣品1納米探針不會對細胞造成損傷，其具有較好的生物相容性。

參見圖5，圖5是本發(fā)明細胞標記探針的制備方法一實施方式的流程圖，該方法包括：

步驟S101：提供納米粒子或量子點、抗壞血酸棕櫚酸酯，并使之混合均勻。

步驟S102：向混合均勻后的混合物中加入揮發(fā)性有機溶劑和水，并使之震蕩均勻。

抗壞血酸棕櫚酸酯是非水溶性的，只能溶解在有機溶劑中，例如乙醇、油脂等。揮發(fā)性有機溶劑是為了溶解抗壞血酸棕櫚酸酯，以便于溶解狀態(tài)的抗壞血酸棕櫚酸酯更好地包裹或修飾納米粒子或量子點。后續(xù)抗壞血酸棕櫚酸酯包裹或修飾納米粒子或量子點的探針需要用于細胞標記，必須去掉有機溶劑，以免對細胞產(chǎn)生損傷，因此需要加入水，有機溶劑需要是揮發(fā)性的有機溶劑，以便于去掉。

步驟S103：將震蕩均勻后的混合物中的揮發(fā)性有機溶劑揮發(fā)完全，進而獲得抗壞血酸棕櫚酸酯包裹或修飾納米粒子或量子點的細胞標記探針。

本發(fā)明實施方式提供納米粒子或量子點、抗壞血酸棕櫚酸酯，并使之混合均勻；向混合均勻后的混合物中加入揮發(fā)性有機溶劑和水，并使之震蕩均勻；將震蕩均勻后的混合物中的所述揮發(fā)性有機溶劑揮發(fā)完全，進而獲得該探針，相比較現(xiàn)有的陰離子型納米探針的制備工藝，該探針的制備工藝簡單方便，操作步驟少，材料價格也不昂貴。

其中，步驟S101還可以包括：提供納米粒子或量子點、抗壞血酸棕櫚酸酯以及熒光染料，并使之混合均勻。也就是說，在制備探針的時候，也標記上熒光染料。以備后續(xù)需要利用熒光染料進行檢測的情況。

其中，納米粒子為四氧化三鐵納米粒子，揮發(fā)性有機溶劑為四氫呋喃。

其中，四氧化三鐵納米粒子為0.001-0.5重量份，例如：0.001、0.01、0.05、0.1、0.3、0.5重量份等等；抗壞血酸棕櫚酸酯為0.001-10重量份，例如：0.001、0.01、0.1、1、5、10重量份等等；四氫呋喃為1-10重量份，例如：1、3、5、7、10重量份等等；水為5-100重量份，例如：5、25、50、75、100重量份等等。

在實際應(yīng)用中，通過調(diào)節(jié)四氧化三鐵納米粒子和抗壞血酸棕櫚酸酯的重量份的比例，可以調(diào)節(jié)探針顆粒粒徑的大小。抗壞血酸棕櫚酸酯的比例越大，探針顆粒粒徑越小，抗壞血酸棕櫚酸酯的比例越小，探針顆粒粒徑越大。在調(diào)節(jié)探針顆粒粒徑的大小時，還可以微調(diào)節(jié)四氫呋喃和水的量份的比例，一般來說，四氫呋喃和水的量份的比例可以是1：5-1：20。

其中，在一具體的實施方式中，步驟S101具體包括：提供四氧化三鐵納米粒子、抗壞血酸棕櫚酸酯以及IR780染料，并使之混合均勻，其中，IR780染料為0.001-1重量份。

具體地，提供四氧化三鐵納米粒子的步驟，包括：

提供濃度為2-10毫克每毫升、分散在三氯甲烷、正己烷或二氯甲烷中的四氧化三鐵納米膠體溶液；將四氧化三鐵納米膠體溶液中的三氯甲烷、正己烷或二氯甲烷揮發(fā)完全，進而獲得四氧化三鐵納米粒子。

進一步，步驟S102可以包括：向混合均勻后的混合物中加入1-10重量份的四氫呋喃，在25-30攝氏度下，進行超聲處理，并將超聲處理后的混合物加入到5-100重量份水中，震蕩均勻；此時，四氫呋喃是通過減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)方法揮發(fā)完全的。

下面以三個具體的實施例來說明上述的方法。

實施例1，構(gòu)建抗壞血酸棕櫚酸酯包裹或修飾的四氧化三鐵納米探針：

(1)將濃度為10mg/ml分散在三氯甲烷、正己烷或二氯甲烷中的四氧化三鐵納米晶體，加入試劑瓶中，通過真空干燥或使用惰性氣體吹干的方式去除有機溶劑，然后稱量納米晶體0.005重量份；

(2)將0.010重量份的抗壞血酸棕櫚酸酯與上述干燥的0.005重量份的四氧化三鐵納米晶體于溫度25-30攝氏度振蕩混合?；旌虾蠹尤胨臍溥秽芤?重量份；

(3)將上述有機混合溶液在溫度25-30攝氏度下進行超聲，超聲功率130W，振幅65％，然后將超聲后的混合物加入到5重量份的水溶液中，震蕩均勻。

(4)通過減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)方法去除上述水相溶液中殘留的四氫呋喃溶劑，制得抗壞血酸棕櫚酸酯構(gòu)建的四氧化三鐵納米探針，記錄為樣品1。

實施例2，構(gòu)建抗壞血酸棕櫚酸酯包裹或修飾的四氧化三鐵/IR780納米探針：

(1)將濃度為10mg/ml分散在三氯甲烷、正己烷或二氯甲烷中的四氧化三鐵納米晶體，加入試劑瓶中，通過真空干燥或使用惰性氣體吹干的方式去除有機溶劑，然后稱量納米晶體0.005重量份；

(2)將0.001重量份IR780與0.025重量份抗壞血酸棕櫚酸酯與上述干燥的0.005重量份的四氧化三鐵納米晶體于溫度25-30攝氏度振蕩混合?；旌虾蠹尤胨臍溥秽芤?重量份；

(3)將上述有機混合溶液在溫度25-30攝氏度下進行超聲，超聲功率130W，振幅65％，然后將超聲后的混合物加入到5重量份的水溶液中，震蕩均勻。

(4)通過減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)方法去除上述水相溶液中殘留的四氫呋喃溶劑，制得抗壞血酸棕櫚酸酯構(gòu)建的四氧化三鐵/IR780納米探針，記錄為樣品2。

應(yīng)用實施例1的樣品1探針進行細胞標記：

將所選取的小鼠腹腔巨噬細胞(RAW264.7)或骨髓間充質(zhì)干細胞在2cm²細胞培養(yǎng)皿上進行常規(guī)細胞鋪板(5*105個細胞/ml)，24小時后加入0.02mg-2mg按照實施例1制備的樣品1探針，標記2-6小時后棄掉標記液，加入完全培養(yǎng)基后繼續(xù)常規(guī)培養(yǎng)24-48小時后制得由樣品1探針標記的小鼠腹腔巨噬細胞(RAW264.7)或骨髓間充質(zhì)干細胞。樣品1的動態(tài)光散射監(jiān)測數(shù)據(jù)如圖6所示，該樣品1的探針粒徑分布區(qū)間在60nm范圍內(nèi)。其成像效果如圖1所示，與對照組相比，樣品1及樣品1標記的細胞的磁共振成像效果好，如圖3所示。CCK-8實驗驗證其細胞毒性，如圖4所示，樣品1未見顯著細胞毒性。

應(yīng)用實施例2的樣品2探針進行細胞標記：

將所選取的小鼠骨髓基質(zhì)干細胞在2cm²細胞培養(yǎng)皿上進行常規(guī)細胞鋪板(5*105個細胞/ml)，24小時后加入0.02mg-2mg按照實施例2制備的樣品2探針，標記2-6小時后棄掉標記液，加入完全培養(yǎng)基后繼續(xù)常規(guī)培養(yǎng)24-48小時后制得由四氧化三鐵/IR780納米探針標記的小鼠骨髓基質(zhì)干細胞。其成像效果如圖1-2所示，與對照組相比，樣品2的磁共振成像及光聲成像效果好。

實施例3，構(gòu)建抗壞血酸棕櫚酸酯包裹或修飾的四氧化三鐵納米探針：

(1)將濃度為10mg/ml分散在三氯甲烷、正己烷或二氯甲烷中的四氧化三鐵納米晶體，加入試劑瓶中，通過真空干燥或使用惰性氣體吹干的方式去除有機溶劑，然后稱量納米晶體0.005重量份；

(2)將0.025重量份的抗壞血酸棕櫚酸酯與上述干燥的0.005重量份的四氧化三鐵納米晶體于溫度25-30攝氏度振蕩混合?；旌虾蠹尤胨臍溥秽芤?重量份；

(3)將上述有機混合溶液在溫度25-30攝氏度下進行超聲，超聲功率130W，振幅65％，然后將超聲后的混合物加入到5重量份的水溶液中，震蕩均勻。

(4)通過減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)方法去除上述水相溶液中殘留的四氫呋喃溶劑，制得抗壞血酸棕櫚酸酯構(gòu)建的四氧化三鐵納米探針，記錄為樣品3。

樣品3的動態(tài)光散射監(jiān)測數(shù)據(jù)如圖7所示，該樣品3的探針粒徑分布區(qū)間在40nm范圍內(nèi)。

通過實施例1和實施例3可知，調(diào)整四氧化三鐵納米晶體與抗壞血酸棕櫚酸酯之間的重量份比例，可以調(diào)整探針粒徑的大小。當加大抗壞血酸棕櫚酸酯的重量份時，在包裹或修飾的過程中，由于有更多的抗壞血酸棕櫚酸酯圍繞在四氧化三鐵納米晶體的周圍，因此可以得到更小粒徑的探針。當減少抗壞血酸棕櫚酸酯的重量份時，在包裹或修飾的過程中，由于有更少的抗壞血酸棕櫚酸酯圍繞在四氧化三鐵納米晶體的周圍，四氧化三鐵納米晶體便已自動聚集，形成大顆粒的四氧化三鐵納米晶體，抗壞血酸棕櫚酸酯包裹或修飾大顆粒的四氧化三鐵納米晶體，因此可以得到更大粒徑的探針。

以上所述僅為本發(fā)明的實施方式，并非因此限制本發(fā)明的專利范圍，凡是利用本發(fā)明說明書及附圖內(nèi)容所作的等效結(jié)構(gòu)或等效流程變換，或直接或間接運用在其他相關(guān)的技術(shù)領(lǐng)域，均同理包括在本發(fā)明的專利保護范圍內(nèi)。