本發(fā)明涉及生物組織工程領(lǐng)域，特別是涉及一種梯度組織工程支架制作方法。

背景技術(shù)：

組織工程是是一門以細(xì)胞生物學(xué)和材料科學(xué)相結(jié)合，進(jìn)行體外或體內(nèi)構(gòu)建組織或器官的新興學(xué)科。通過細(xì)胞、支架結(jié)構(gòu)與生長因子的混合培養(yǎng)，制造適用于修復(fù)人體組織或器官缺損的移植材料，可以實(shí)現(xiàn)缺損部位結(jié)構(gòu)的再生和功能的重建。用于人體內(nèi)的組織工程技術(shù)對(duì)材料生物特性、物理化學(xué)特性等方面提出了較高的要求，其中骨和軟骨組織的重建對(duì)力學(xué)強(qiáng)度的要求最高，也對(duì)微觀組織形態(tài)提出了一定的要求。

骨和軟骨是人體中較為重要的承力組織，具有力學(xué)強(qiáng)度高，結(jié)構(gòu)非均質(zhì)的特征。復(fù)雜的非均質(zhì)結(jié)構(gòu)，或稱為梯度結(jié)構(gòu)，提供了非均勻的力學(xué)強(qiáng)度，適于支撐人體的重量和運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致的應(yīng)力。軟骨組織具有優(yōu)秀的梯度、非線性、粘彈性的力學(xué)性能；骨組織則具備皮質(zhì)骨-松質(zhì)骨的二級(jí)結(jié)構(gòu)，在減輕重量的基礎(chǔ)上具有極高的力學(xué)強(qiáng)度。在骨和軟骨的組織工程重建中，如修復(fù)材料力學(xué)強(qiáng)度過弱，則難以承受恢復(fù)過程中的體內(nèi)應(yīng)力，導(dǎo)致材料變形、修復(fù)效果變差；如力學(xué)強(qiáng)度過強(qiáng)，也可能出現(xiàn)應(yīng)力遮擋效應(yīng)，令修復(fù)材料以外的正常組織承擔(dān)應(yīng)力減弱，造成骨質(zhì)疏松等負(fù)面影響。

因此，仿生的，非線性梯度化的力學(xué)強(qiáng)度，對(duì)于組織工程支架的設(shè)計(jì)制造提出了苛刻和重要而要求。此外，微觀組織形態(tài)的仿生化，對(duì)于重建過程中的細(xì)胞長入具有積極意義，也具有優(yōu)化設(shè)計(jì)的價(jià)值。

生物3D打印(又稱增材制造、快速成形)是一種新興、靈活的組織工程技術(shù)，可以在不產(chǎn)生明顯分界面的前提下實(shí)現(xiàn)分級(jí)/梯度軟骨支架的制造。3D打印技術(shù)的核心是，依據(jù)離散/堆積成形原理的數(shù)字化成形——即在計(jì)算機(jī)的控制管理下，根據(jù)零件的CAD模型，通過材料的精確堆積，制造原型或零件，在產(chǎn)品開發(fā)與設(shè)計(jì)、快速工具(Rapid Tooling)、三維復(fù)制和臨床醫(yī)學(xué)領(lǐng)域均有應(yīng)用。

定向冷凍是一種控制流體解凍時(shí)的溫度場(chǎng)實(shí)現(xiàn)定向結(jié)晶，以令冷凍產(chǎn)物具有定向微觀結(jié)構(gòu)的加工方法。與冷凍干燥技術(shù)結(jié)合，可以獲得具有定向微觀組織的生物支架。

軟骨組織具有結(jié)構(gòu)較為簡單、組織內(nèi)無血管等有利條件，在組織工程研究中發(fā)展較快，具有較早進(jìn)入臨床應(yīng)用的前景。然而，常見的軟骨支架多為均質(zhì)或準(zhǔn)均質(zhì)結(jié)構(gòu)，力學(xué)強(qiáng)度的仿生性不夠。多篇論文及專利CN201410097482中介紹了具有梯度化結(jié)構(gòu)的軟骨支架，但其制作方法多為分層粘接、分層澆鑄或多材料打印，具有工藝繁瑣，粘接/澆鑄界面強(qiáng)度較差，難以進(jìn)行定量力學(xué)強(qiáng)度優(yōu)化等問題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的主要目的在于針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種梯度組織工程支架制作方法。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

一種梯度組織工程支架制作方法，包括采用生物高分子材料和水凝膠，利用低溫沉積3D打印機(jī)打印三種網(wǎng)格，形成分層結(jié)構(gòu)，分別為對(duì)應(yīng)于淺層切向纖維的切向型網(wǎng)格、對(duì)應(yīng)于中層過渡纖維的均勻網(wǎng)格以及對(duì)應(yīng)于底層法向纖維的法向型網(wǎng)格，形成網(wǎng)格支架，其在力學(xué)強(qiáng)度上具有抗壓力從淺到深逐漸增加，抗剪力從淺到深逐漸降低的特征；打印完后對(duì)網(wǎng)格支架進(jìn)行第一次冷凍干燥，之后在成形的網(wǎng)格支架孔隙內(nèi)灌入dECM溶液，并進(jìn)行第二次冷凍干燥，除去dECM中的溶劑成分，獲得具有接近正常軟骨定向微觀組織的復(fù)合的梯度組織工程支架。

進(jìn)一步地：

所述生物高分子材料為PLGA在1，4-二氧六環(huán)溶劑中的分散系，所述水凝膠為天然軟骨脫細(xì)胞基質(zhì)dECM在乙酸中的分散系、膠原、殼聚糖或明膠，優(yōu)選地，PLGA的粘度1.7，濃度0.15g/ml；優(yōu)選地，打印材料在-20℃下擠出，并進(jìn)行8h的第一次冷凍干燥。

打印時(shí)，通過以下任一者或多者來改變網(wǎng)格的壓縮和剪切力學(xué)強(qiáng)度：(1)提高或降低單層網(wǎng)格的疏密程度；(2)增加或降低單一方向連續(xù)打印的網(wǎng)格層數(shù)；(3)改變不同方向網(wǎng)格的層數(shù)比例。

打印使得所述切向型網(wǎng)格的剪切模量略高于真實(shí)軟骨，法向型網(wǎng)格的壓縮模量略高于真實(shí)軟骨，其余各模量則與真實(shí)軟骨相當(dāng)或略低。

還包括力學(xué)測(cè)量確定各層的力學(xué)強(qiáng)度，其中針對(duì)正面承壓的軟骨或骨缺損修補(bǔ)的需求，對(duì)網(wǎng)格支架各層上下加載壓縮或剪切載荷；針對(duì)側(cè)面承壓的軟骨或骨缺損修補(bǔ)的需求，將網(wǎng)格支架繞水平軸旋轉(zhuǎn)90度再進(jìn)行相應(yīng)壓縮或剪切載荷的加載。

三種分層網(wǎng)格在組合時(shí)近似于等截面疊加。

將三種分層網(wǎng)格相互間進(jìn)行固接約束，邊界和加載條件為周邊無約束，上下使用剛體壓頭的壓縮或剪切，調(diào)節(jié)三種網(wǎng)格在厚度方向的分布比例，通過力學(xué)仿真的形變量，反比例換算復(fù)合支架力學(xué)強(qiáng)度。

對(duì)于正面承壓復(fù)合支架，通過下式確定三層的分層比例：

對(duì)于側(cè)面承壓復(fù)合支架，通過下式確定三層的分層比例：

E＝aE₁+bE₂+cE₃

其中E為期望達(dá)到的真實(shí)軟骨力學(xué)強(qiáng)度、E1、E2、E3為各分層的力學(xué)強(qiáng)度，a+b+c＝1。

第二次冷凍時(shí)，將灌入dECM的網(wǎng)格支架置放入定向冷凍匣進(jìn)行定向冷凍，所述定向冷凍匣具有高熱導(dǎo)率部分優(yōu)選紫銅，和低熱導(dǎo)率部分優(yōu)選PLA，在外圍具有用PLA隔開的隔熱空氣層。

在dECM和PLGA溶液中加入水溶性致孔劑，在加工完畢后，通過溶解除去致孔劑，以獲得微觀孔徑，實(shí)現(xiàn)連通度高的分級(jí)孔隙結(jié)構(gòu)；優(yōu)選地，在dECM中加入特定營養(yǎng)物質(zhì)，如誘導(dǎo)軟骨形成的IGF-1蛋白等，以促進(jìn)軟骨組織的形成。

本發(fā)明的有益效果：

本發(fā)明的梯度組織工程支架制作方法，從力學(xué)強(qiáng)度和微觀組織結(jié)構(gòu)出發(fā)進(jìn)行工藝設(shè)計(jì)，實(shí)現(xiàn)了梯度復(fù)合支架的一次性成形，并顯著優(yōu)化了仿生效果，可以很好地進(jìn)行定量力學(xué)強(qiáng)度優(yōu)化，本發(fā)明提出的具有梯度結(jié)構(gòu)的組織工程支架制造工藝，能更好地促進(jìn)組織再生，提供具有非均質(zhì)梯度特征的組織工程支架，適用于臨床應(yīng)用和研究。

本發(fā)明通過3D打印和定向冷凍技術(shù)的結(jié)合，實(shí)現(xiàn)了一次性成形具有梯度結(jié)構(gòu)的軟骨支架，便于進(jìn)行力學(xué)強(qiáng)度的仿生優(yōu)化，且具有宏觀網(wǎng)格和微觀組織的二級(jí)仿生結(jié)構(gòu)。推廣地，這種工藝手段也可以用于制造其他具有力學(xué)強(qiáng)度要求的組織工程支架，包括但不限于骨組織和骨-軟骨復(fù)合組織。

附圖說明

圖1為本發(fā)明實(shí)施例軟骨打印的三種網(wǎng)格設(shè)計(jì)思想，提高或降低單層網(wǎng)格的疏密程度(101)；增加或降低單一方向連續(xù)打印的網(wǎng)格層數(shù)(102)；改變不同方向(通常為橫縱兩向)網(wǎng)格的層數(shù)比例(103)；

圖2為真實(shí)軟骨的梯度組織結(jié)構(gòu)示意圖；

圖3為本發(fā)明實(shí)施例三種網(wǎng)格結(jié)構(gòu)示意圖，分別為強(qiáng)調(diào)切向的切向型網(wǎng)格(301)，均勻網(wǎng)格(302)和強(qiáng)調(diào)法向的法向型網(wǎng)格(303)；

圖4為本發(fā)明實(shí)施例針對(duì)正面承壓的軟骨或骨缺損修補(bǔ)的需求，作為正面承壓復(fù)合支架(401)，對(duì)網(wǎng)格各層上下加載壓縮或剪切載荷，以及針對(duì)側(cè)面承壓的軟骨或骨缺損修補(bǔ)的需求，作為側(cè)面承壓復(fù)合支架(402)，將網(wǎng)格支架繞水平軸旋轉(zhuǎn)90度再進(jìn)行相應(yīng)壓縮或剪切載荷的加載；

圖5為本發(fā)明實(shí)施例將灌入dECM的網(wǎng)格置放入定向冷凍匣進(jìn)行定向冷凍的示意圖；

圖6為本發(fā)明實(shí)施例制作的實(shí)際復(fù)合支架的切片SEM觀察驗(yàn)證圖。

具體實(shí)施方式

以下對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方式作詳細(xì)說明。應(yīng)該強(qiáng)調(diào)的是，下述說明僅僅是示例性的，而不是為了限制本發(fā)明的范圍及其應(yīng)用。

參閱圖1至圖6，在一種實(shí)施例中，一種梯度組織工程支架制作方法，包括采用生物高分子材料和水凝膠，利用低溫沉積3D打印機(jī)打印三種網(wǎng)格，形成分層結(jié)構(gòu)，分別為對(duì)應(yīng)于淺層切向纖維的切向型網(wǎng)格、對(duì)應(yīng)于中層過渡纖維的均勻網(wǎng)格以及對(duì)應(yīng)于底層法向纖維的法向型網(wǎng)格，形成網(wǎng)格支架，其在力學(xué)強(qiáng)度上具有抗壓力從淺到深逐漸增加，抗剪力從淺到深逐漸降低的特征；打印完后對(duì)網(wǎng)格支架進(jìn)行第一次冷凍干燥，之后在成形的網(wǎng)格支架孔隙內(nèi)灌入dECM溶液，并進(jìn)行第二次冷凍干燥，除去dECM中的溶劑成分，獲得具有接近正常軟骨定向微觀組織的復(fù)合的梯度組織工程支架。

3D打印使用的材料為生物高分子材料和水凝膠，具有較好的生物活性，對(duì)進(jìn)一步臨床研究有積極意義。

在打印軟骨的實(shí)施例中，材料優(yōu)選為：所述生物高分子材料為粘度1.7，濃度0.15g/ml的PLGA溶質(zhì)，在1，4-二氧六環(huán)溶劑中的分散系。此外，溶質(zhì)也可選擇PCL等其他生物高分子材料，溶劑也可選擇三氯甲烷等其他常見有機(jī)溶劑。所述水凝膠為天然軟骨脫細(xì)胞基質(zhì)dECM在乙酸中的分散系。此外，水凝膠也可選擇膠原、殼聚糖、明膠等其具有生物活性的材料。

在打印骨的實(shí)施例中，材料優(yōu)選為：羥基磷灰石、磷酸三鈣等鈣磷陶瓷材料，與上述生物高分子材料的混合溶液，陶瓷與高分子材料的質(zhì)量比為1～10:1。該配比參考自專利文獻(xiàn)CN201210344908。水凝膠具體可采用前述材料。

打印骨軟骨復(fù)合支架時(shí)，優(yōu)選采取雙噴頭打印。

在制造軟骨的實(shí)施例中，實(shí)現(xiàn)工藝路徑如下：

利用低溫沉積3D打印機(jī)打印三種網(wǎng)格，材料選取為適用于生物實(shí)驗(yàn)，且具備一定力學(xué)強(qiáng)度的PLGA和1，4-二氧六環(huán)溶液，-20℃下擠出，并進(jìn)行8h冷凍干燥。獲得的支架具有常溫下的穩(wěn)定性、與真實(shí)軟骨數(shù)量級(jí)接近的力學(xué)強(qiáng)度和宏觀/微觀上的孔隙率，有利于細(xì)胞長入。之后，在成形的網(wǎng)格支架孔隙內(nèi)灌入dECM溶液，并進(jìn)行第二次冷凍干燥，獲得生物性能改良的雙材料支架。

優(yōu)選地，在打印中，可以通過以下的路徑編程設(shè)計(jì)來改變網(wǎng)格設(shè)計(jì)的壓縮和剪切力學(xué)強(qiáng)度，以供優(yōu)化使用，如圖1：

提高或降低單層網(wǎng)格的疏密程度(101)；增加或降低單一方向連續(xù)打印的網(wǎng)格層數(shù)(102)；改變不同方向(通常為橫縱兩向)網(wǎng)格的層數(shù)比例(103)。

在進(jìn)一步優(yōu)選中，針對(duì)正面承壓的軟骨或骨缺損修補(bǔ)的需求，考慮到真實(shí)軟骨具有如圖2所示的梯度組織結(jié)構(gòu)，包括淺層切向纖維201，中層過渡纖維202，底層法向纖維203，箭頭定性表示纖維走向；力學(xué)強(qiáng)度上，具有抗壓力從淺到深逐漸增加，抗剪力從淺到深逐漸降低的特征。故，設(shè)計(jì)如圖3所示的三種網(wǎng)格結(jié)構(gòu)，分別為強(qiáng)調(diào)切向的網(wǎng)格301(簡稱切向型網(wǎng)格)，均勻網(wǎng)格302和強(qiáng)調(diào)法向的網(wǎng)格303(簡稱法向型網(wǎng)格)，并通過路徑編程打印復(fù)合的梯度支架304。對(duì)應(yīng)于圖3中，三種網(wǎng)格結(jié)構(gòu)分別采用多橫少縱周期交錯(cuò)的結(jié)構(gòu)，橫縱均勻長周期交錯(cuò)的結(jié)構(gòu)，橫縱均勻短周期交錯(cuò)的結(jié)構(gòu)。

并為了進(jìn)一步進(jìn)行力學(xué)強(qiáng)度優(yōu)化，通過分層打印和力學(xué)測(cè)量確定各層的關(guān)鍵力學(xué)強(qiáng)度E1、E2、E3，可以為抗壓模量或剪切模量；并通過打印路徑設(shè)計(jì)，規(guī)劃各層的厚度占比a、b、c(a+b+c＝1)，如圖4的401所示。進(jìn)行力學(xué)設(shè)計(jì)和優(yōu)化時(shí)，可直接上下加載壓縮或剪切載荷。

在另一種優(yōu)選方案中，針對(duì)側(cè)面承壓的軟骨或骨缺損修補(bǔ)的需求，同樣設(shè)計(jì)如圖3所示的三種網(wǎng)格結(jié)構(gòu)，并打印復(fù)合支架304，但在進(jìn)行力學(xué)設(shè)計(jì)和優(yōu)化時(shí)，將網(wǎng)格繞水平軸旋轉(zhuǎn)90度再進(jìn)行相應(yīng)壓縮或剪切載荷的加載，各層厚度占比轉(zhuǎn)為寬度占比a、b、c，如圖4的402。

優(yōu)選地，對(duì)上述三種網(wǎng)格進(jìn)行力學(xué)強(qiáng)度測(cè)量和局部優(yōu)化設(shè)計(jì)，令網(wǎng)格301的剪切模量略高于真實(shí)軟骨，網(wǎng)格303的壓縮(楊氏)模量略高于真實(shí)軟骨，其余各模量則與真實(shí)軟骨相當(dāng)或略低，以通過三種網(wǎng)格在復(fù)合支架中所占比例的調(diào)節(jié)，使復(fù)合支架的力學(xué)性能接近真實(shí)軟骨。

如上所述的工藝流程，既可以單獨(dú)打印特征固定的均質(zhì)網(wǎng)格支架，如網(wǎng)格301；也可以通過路徑編程，在一次打印中成形各部分分別具有301、302、303特征的復(fù)合梯度支架304，而無需其他附加工藝。

由此，實(shí)現(xiàn)了均質(zhì)支架和非均質(zhì)支架具有相同的制造流程，均可一次性制造成形，省去了多材料打印、分步粘接等工藝中的切換材料和粘接步驟。因此，可以改善分級(jí)界面性能，避免因粘接和分層鑄造出現(xiàn)的力學(xué)強(qiáng)度缺陷或力學(xué)性能突變，對(duì)于力學(xué)強(qiáng)度的定量研究和定量優(yōu)化具有積極意義。

對(duì)于骨和骨-軟骨復(fù)合組織的制造而言，只需針對(duì)皮質(zhì)骨和松質(zhì)骨的特性，選用適宜的分層網(wǎng)格結(jié)構(gòu)與打印材料。

力學(xué)優(yōu)化工藝路徑如下：

對(duì)用所述工藝獲得的分層網(wǎng)格，分別測(cè)量其關(guān)鍵力學(xué)性能，主要為壓縮模量，剪切模量和抗壓強(qiáng)度。將獲得的三種力學(xué)性能作為參數(shù)，計(jì)算并優(yōu)化復(fù)合網(wǎng)格的力學(xué)強(qiáng)度。

優(yōu)選地，三種分層網(wǎng)格在組合時(shí)近似于等截面疊加，組合支架抗壓強(qiáng)度可用三種網(wǎng)格中的最低者代表。

優(yōu)選地，壓縮模量、剪切模量優(yōu)化方案有以下兩種，并通過實(shí)際復(fù)合網(wǎng)格的力學(xué)測(cè)試驗(yàn)證(兩種方案也可以互為驗(yàn)證)：

1.利用計(jì)算機(jī)進(jìn)行力學(xué)仿真。將三種分層網(wǎng)格作為均質(zhì)材料，相互間進(jìn)行固接約束，邊界和加載條件為周邊無約束，上下使用剛體壓頭的壓縮或剪切。調(diào)節(jié)三種網(wǎng)格在厚度方向的分布比例，通過力學(xué)仿真的形變量，反比例換算復(fù)合支架力學(xué)強(qiáng)度。

2.近似為等截面疊加，通過簡化公式計(jì)算。

對(duì)于401所示的正面承壓復(fù)合支架，已知壓縮/剪切模量等于相應(yīng)條件下的應(yīng)力除以應(yīng)變。因此，等截面疊加下，應(yīng)力與壓/剪力為正比例關(guān)系，又壓/剪力恒定，則壓縮/剪切模量反比于厚度方向上的應(yīng)變，即形變率。

此關(guān)系對(duì)單一分層和整體支架均成立，因此復(fù)合網(wǎng)格的壓縮/剪切模量之倒數(shù)，等于各分層相應(yīng)模量之倒數(shù)的加權(quán)平均，權(quán)重為分層厚度占比。

即：由比例a的分層1，比例b的分層2和比例c的分層3構(gòu)成的復(fù)合網(wǎng)格(a+b+c＝1)，其模量

對(duì)壓縮模量和剪切模量都成立。

又，對(duì)于402所示的側(cè)面承壓復(fù)合支架，可以近似為三種分層支架的等厚并聯(lián)，容易推得壓縮/剪切模量等于三種分層相應(yīng)模量的加權(quán)平均，權(quán)重為分層寬度占比。

即：由比例a的分層1，比例b的分層2和比例c的分層3構(gòu)成的復(fù)合網(wǎng)格(a+b+c＝1)，其模量

E＝aE₁+bE₂+cE₃

對(duì)壓縮模量和剪切模量都成立。

因此，對(duì)于所述的兩種承壓形式的優(yōu)化例，均可找出以E1、E2、E3為實(shí)測(cè)參數(shù)，a、b、c中的任意兩個(gè)為可調(diào)參數(shù)的簡化公式，為力學(xué)優(yōu)化提供理論計(jì)算或理論參考。

根據(jù)如上所述的兩種優(yōu)化方案，可以看出：三級(jí)復(fù)合的網(wǎng)格結(jié)構(gòu)，提供了厚度分布比例a、b、c中的任意兩個(gè)作為一對(duì)獨(dú)立參數(shù)。需要優(yōu)化的主要參數(shù)有兩個(gè)，為壓縮模量和剪切模量；需要保證下限的次要參數(shù)有一個(gè)，為抗壓強(qiáng)度。因此，在保證抗壓強(qiáng)度滿足要求的條件下，可以通過一對(duì)獨(dú)立參數(shù)的調(diào)整，實(shí)現(xiàn)雙自由度的參數(shù)優(yōu)化，令壓縮模量和剪切模量都符合真實(shí)力學(xué)強(qiáng)度。

因此，在分層網(wǎng)格力學(xué)強(qiáng)度互有差異，且與真實(shí)軟骨相當(dāng)?shù)幕A(chǔ)上，可以通過合理的優(yōu)化，實(shí)現(xiàn)整體力學(xué)強(qiáng)度接近真實(shí)軟骨，受壓/剪復(fù)合應(yīng)力時(shí)應(yīng)力云仿生的復(fù)合支架，理想的優(yōu)化結(jié)果如圖2所示的204。

在一個(gè)正面承壓的實(shí)施例中，測(cè)得真實(shí)軟骨壓縮力學(xué)強(qiáng)度E＝37MPa，分層1與分層3力學(xué)強(qiáng)度相等，為40MPa，分層2力學(xué)強(qiáng)度為35MPa。故有

又a+b+c＝1，算得

故分層2占復(fù)合支架比例為0.57。再代入剪力的測(cè)試公式，可解出a和c，獲得優(yōu)化的層數(shù)比例。

對(duì)于骨和骨-軟骨復(fù)合組織的優(yōu)化而言，目標(biāo)優(yōu)化數(shù)值需選取骨組織的相應(yīng)模量和強(qiáng)度。

組織學(xué)優(yōu)化工藝路徑如下：

與PLGA相比，dECM的力學(xué)強(qiáng)度較低，同等條件下僅有真實(shí)軟骨的10％左右，但由于為天然軟骨提取物，具有優(yōu)秀的生物活性和可降解性。同時(shí)，由于較弱的力學(xué)強(qiáng)度，對(duì)其單獨(dú)進(jìn)行組織梯度化處理對(duì)整體力學(xué)強(qiáng)度影響不大，卻能夠提供適合細(xì)胞長入的定向微觀纖維結(jié)構(gòu)。

設(shè)計(jì)如圖5所示的定向冷凍匣，其中含有高熱導(dǎo)率(紫銅)部分501，和低熱導(dǎo)率(PLA)部分502，外圍具有用PLA隔開的隔熱空氣層503，冷凍下溫度場(chǎng)分布近似504。

其中，熱導(dǎo)率為紫銅最高386.4w/(m.k)，支架本身次之，參考主體成分水為0.55w/(m.k)，PLA再次，為0.25w/(m.k)，隔熱空氣層最低，為0.023w/(m.k)。

將灌入dECM的網(wǎng)格置入此匣，并整體放于冷環(huán)境中，通過紫銅的高熱導(dǎo)率，可令dECM由銅的表面開始結(jié)凍，生長表層切向、中層過渡、底層法向的定向晶體結(jié)構(gòu)。隔熱空氣層對(duì)側(cè)面PLA的傳熱起到限制，提高了冷凍溫度場(chǎng)的形狀精確度。

優(yōu)選地，所設(shè)計(jì)的溫度場(chǎng)和定向纖維結(jié)構(gòu)通過溫度場(chǎng)的計(jì)算機(jī)仿真進(jìn)行優(yōu)化設(shè)計(jì)，并通過實(shí)際復(fù)合支架的切片SEM觀察驗(yàn)證，如圖6。

之后，通過冷凍干燥，可以除去dECM中的溶劑成分，獲得具有接近正常軟骨定向微觀組織的復(fù)合支架。

通過如上所述的兩條優(yōu)化路徑，可完成梯度結(jié)構(gòu)軟骨的制造與優(yōu)化。所制造的軟骨支架，具有被dECM充填的宏觀孔徑，尺寸為500微米左右；及PLGA與dECM內(nèi)部的微觀孔徑，尺寸在5～50微米。

優(yōu)選地，在dECM和PLGA溶液中加入水溶性致孔劑，典型的如糖、鹽等。在加工完畢后，通過溶解除去致孔劑，以獲得更小的微觀孔徑，實(shí)現(xiàn)連通度高的分級(jí)孔隙結(jié)構(gòu)，便于營養(yǎng)物質(zhì)輸送。

優(yōu)選地，在dECM中加入特定營養(yǎng)物質(zhì)，如誘導(dǎo)軟骨形成的IGF-1蛋白等，以促進(jìn)軟骨組織的形成。

這樣制造的支架具有近似于真實(shí)軟骨的力學(xué)強(qiáng)度和微觀定向組織，在植入人體后能夠較好地維持機(jī)體功能，并促進(jìn)軟骨細(xì)胞長入和軟骨再生，在臨床上具有應(yīng)用價(jià)值。

此外，通過一次性成形支架結(jié)構(gòu)的打印路徑設(shè)計(jì)，實(shí)現(xiàn)了適用于定量優(yōu)化的簡單工藝流程。能夠通過計(jì)算機(jī)仿真或理論計(jì)算對(duì)力學(xué)強(qiáng)度、組織結(jié)構(gòu)進(jìn)行定量優(yōu)化，以在植入后更貼近真實(shí)人體，能夠支持機(jī)體、促進(jìn)組織再生。

以上內(nèi)容是結(jié)合具體/優(yōu)選的實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明所作的進(jìn)一步詳細(xì)說明，不能認(rèn)定本發(fā)明的具體實(shí)施只局限于這些說明。對(duì)于本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，其還可以對(duì)這些已描述的實(shí)施方式做出若干替代或變型，而這些替代或變型方式都應(yīng)當(dāng)視為屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。