本發(fā)明涉及一種光敏劑及其制備方法，具體涉及一種對(duì)微弱光敏感的光敏藥物及其制備方法。

背景技術(shù)：

光動(dòng)力療法是近年來(lái)逐漸興起的一種治療疾病的新型療法，其作用基礎(chǔ)是光動(dòng)力效應(yīng)。這一種冷光化學(xué)反應(yīng)，是一種有氧分子參與的伴隨生物效應(yīng)的光敏化反應(yīng)。使用特定波長(zhǎng)的激發(fā)光(可見光、近紅外光、紫外光或γ射線)照射生物組織，其中的內(nèi)源性或外源性光敏物質(zhì)吸收光子能量，由基態(tài)變成激發(fā)態(tài)。處于激發(fā)態(tài)的光敏劑會(huì)迅速將能量傳遞給周圍的氧分子，生成活性很強(qiáng)的單線態(tài)氧，并與相鄰的生物大分子發(fā)生氧化反應(yīng)，產(chǎn)生細(xì)胞毒性，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞受損乃至死亡。同時(shí)，這一過(guò)程可引發(fā)組織中的毛細(xì)血管內(nèi)皮損傷和血管栓塞，造成局部微循環(huán)障礙，進(jìn)一步導(dǎo)致病變組織的缺血性壞死，產(chǎn)生治療作用?？梢哉f(shuō)光敏劑、分子氧和激發(fā)光均為治療過(guò)程中的廣義藥物，三者缺一不可。

目前，光動(dòng)力療法已在臨床上使用，并取得很好的療效。由于光敏劑具有較低的暗毒性和較高的光毒性，因此其創(chuàng)傷面積小，作用范圍只局限于光照區(qū)域，并不涉及周圍正常組織和器官，也不會(huì)對(duì)人體的造血功能和免疫系統(tǒng)造成損害。此外，單線態(tài)氧通過(guò)對(duì)病灶組織的強(qiáng)氧化作用產(chǎn)生細(xì)胞毒性，其對(duì)不同細(xì)胞類型的病變組織都有效，且治療過(guò)程細(xì)胞不會(huì)產(chǎn)生抗藥性，可以重復(fù)治療并始終保持療效(參見Chem.Soc.Rev.,2011,40,340–362,The role of porphyrin chemistry in tumor imaging and photodynamic therapy)。

然而，光動(dòng)力療法的局限性在很大程度上限制了其使用范圍。由于生物組織對(duì)光線的吸收和散射作用造成了激發(fā)光強(qiáng)度的衰減，使得殺傷深度和殺傷面積受到很大的限制。此外，目前治療過(guò)程中所使用的光敏劑多為脂溶性藥物，這類藥物在水溶液中會(huì)發(fā)生嚴(yán)重的聚集，造成單線態(tài)氧的淬滅，令治療無(wú)法達(dá)到預(yù)期效果(參見Methods Enzymol.,2000,319,376–400,Role of activated oxygen species in photodynamic therapy)。而惡性腫瘤組織所處的乏氧狀態(tài)導(dǎo)致了單線態(tài)氧的產(chǎn)量較低，這些缺陷將光動(dòng)力療法的使用范圍限制于“薄層”結(jié)構(gòu)疾病(包括某些皮膚病、眼底黃斑病變和淺表腫瘤)的治療。

為了將光動(dòng)力療法擴(kuò)大到身體內(nèi)部實(shí)體腫瘤的治療中，現(xiàn)階段有關(guān)于光動(dòng)力療法的研究方向主要集中在改變照射方式，選用功能化的載藥體系和改善藥物性能這幾個(gè)方面。如在病灶區(qū)域引入光纖，將特定波長(zhǎng)的激光引導(dǎo)到腫瘤區(qū)域，并通過(guò)控制光纖密度來(lái)達(dá)到均勻照射的目的；同時(shí)，還可以通過(guò)光纖導(dǎo)入一定濃度的氧氣，以改善腫瘤的乏氧狀態(tài)，該方法對(duì)實(shí)體腫瘤的治療效果比較好，但是腫瘤轉(zhuǎn)移的部分仍無(wú)法得到有效治療。功能化的藥物載體不僅可以負(fù)載藥物，提高藥物的選擇性，還賦予載體熒光特性，使得某一波長(zhǎng)的激發(fā)光能夠激發(fā)不同的光敏劑，從而擴(kuò)大藥物的使用范圍；而具有自發(fā)光性能的載體可在組織內(nèi)部特定環(huán)境下自主發(fā)出一定波長(zhǎng)的激發(fā)光，從而在不引入外部光源的條件下使得載藥與激發(fā)藥物同時(shí)完成，因此其具有治療身體內(nèi)部的實(shí)體腫瘤及轉(zhuǎn)移腫瘤的能力。在改善藥物性能方面，目前的研究重點(diǎn)主要放在增加藥物對(duì)目標(biāo)組織的選擇性，提高單線態(tài)氧的量子產(chǎn)率，開發(fā)具有較長(zhǎng)激發(fā)波長(zhǎng)的藥物等方面，令光動(dòng)力療法能夠被更廣泛的應(yīng)用于多種疾病的治療方面。然而，目前所使用的光敏劑大多需要很強(qiáng)的激發(fā)光照射才能夠生成單線態(tài)氧從而產(chǎn)生細(xì)胞毒性，而生物組織具有對(duì)激發(fā)光反射、吸收和散射等作用，使得到達(dá)目標(biāo)組織的光強(qiáng)度較低，對(duì)光敏劑的激發(fā)能力不足，這一缺陷在很大程度上限制了光動(dòng)力療法的使用范圍。因此，需要合成水溶性好且具有較強(qiáng)的光敏感性并具有攜帶分子氧能力的藥物，使其在微弱光照射下就能夠被激發(fā)，產(chǎn)生大量的單線態(tài)氧，從而擴(kuò)大光動(dòng)力療法的使用范圍，增強(qiáng)治療效果。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明針對(duì)光動(dòng)力治療過(guò)程中到達(dá)靶組織的激發(fā)光強(qiáng)度較弱且分子氧濃度較低的不利條件，選用合適的底物和光敏劑，合成具有攜氧能力且對(duì)激發(fā)光極其敏感的光敏藥物。本發(fā)明所制備的藥物可在微弱光照射的條件下被激活，產(chǎn)生單線態(tài)氧；同時(shí)自身所負(fù)載的分子氧也可以提供給反應(yīng)，增加單線態(tài)氧的產(chǎn)量，達(dá)到擴(kuò)大光動(dòng)力療法的使用范圍并提高療效的目的。

本發(fā)明所提供的對(duì)微弱光敏感的光敏藥物，其由攜氧蛋白和水溶性光敏劑經(jīng)酰胺縮合反應(yīng)形成。

本發(fā)明采用酰胺縮合反應(yīng)，將水溶性光敏劑孟加拉紅(具有羧基)結(jié)合到具有載氧能力的蛋白(具有氨基)上，合成了敏化的光敏藥物，可在攜氧的同時(shí)被微弱光激發(fā)產(chǎn)生單線態(tài)氧，克服了生物組織對(duì)光線穿透能力較弱的缺陷，并在一定程度上改善腫瘤周圍的乏氧環(huán)境，從而將光動(dòng)力療法擴(kuò)展到體內(nèi)腫瘤的治療中。

所述的光敏藥物中，所述攜氧蛋白可為血紅蛋白或肌紅蛋白。

所述的光敏藥物中，所述水溶性光敏劑可為孟加拉紅、光卟啉、亞甲基藍(lán)或葉綠素等。

本發(fā)明所述“微弱光”指的是強(qiáng)度為2～50μW/cm²的白光，其強(qiáng)度遠(yuǎn)小于目前治療過(guò)程中所使用的單色光(強(qiáng)度約為10～90mW/cm²)。

本發(fā)明進(jìn)一步提供了所述光敏藥物的制備方法，包括如下步驟：

1)配制所述水溶性光敏劑的溶液和所述攜氧蛋白的溶液；

2)向所述水溶性光敏劑的溶液中依次加入偶聯(lián)活化劑和穩(wěn)定劑；

3)向步驟2)的體系中加入所述攜氧蛋白的溶液，經(jīng)避光攪拌反應(yīng)即得所述光敏藥物。

上述的制備方法中，步驟1)中，所述水溶性光敏劑的溶液中，所述水溶性光敏劑的濃度可為1～5mg/mL，具體可為2mg/mL；

所述攜氧蛋白的溶液中，所述攜氧蛋白的濃度可為2～10mg/mL，具體可為5mg/mL。

上述的制備方法中，步驟1)中，采用PBS緩沖液配制所述水溶性光敏劑的溶液和所述攜氧蛋白的溶液；

所述PBS緩沖液的pH值為7.4，離子強(qiáng)度為0.01M。

上述的制備方法中，步驟2)中，所述偶聯(lián)活化劑可為1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)；

所述穩(wěn)定劑可為N-羥基硫代琥珀酰亞胺(Sulfo-NHS)；

采用所述偶聯(lián)活化劑進(jìn)行活化的時(shí)間可為5～20min。

上述的制備方法中，步驟3)中，所述避光攪拌反應(yīng)包括如下步驟：

首先在20～25℃的條件下反應(yīng)5～20min，然后轉(zhuǎn)移至2～8℃的條件下繼續(xù)反應(yīng)8～20h。

本發(fā)明提供的光敏藥物可用于制備光動(dòng)力治療劑，用于腫瘤治療中，如可抑制乳腺癌細(xì)胞的活性。

以所述光敏藥物為活性成分的光動(dòng)力治療劑也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

本發(fā)明首次提出利用功能性蛋白對(duì)水溶性光敏劑進(jìn)行改性，得到具有攜氧功能且在微弱光激發(fā)下即可被激活的光敏藥物，是一種新型的藥物。本發(fā)明提供的光敏藥物，具有一定的攜氧功能，且在微弱光照射的條件下即可被激活，與傳統(tǒng)的光敏藥物相比，其激活后產(chǎn)生單線態(tài)氧的速度更快，產(chǎn)量更高，有望用于組織內(nèi)部腫瘤的光動(dòng)力治療。

附圖說(shuō)明

圖1是本發(fā)明光敏藥物在微弱光照射下單線態(tài)氧生成檢測(cè)圖。

圖2是含有相同RB濃度的單純RB和Hb-RB體系中單線態(tài)氧產(chǎn)量比較圖。

圖3是向耗盡氧氣的Hb-RB封閉體系中通入氧氣并采用1.5mW/cm²的白光照射時(shí)單線態(tài)氧的生成圖譜。

圖4為空白對(duì)照、Hb-RB在黑暗條件及在1.5mW/cm²的白光照射條件下促進(jìn)細(xì)胞對(duì)載藥體系內(nèi)吞的流式細(xì)胞檢測(cè)圖(由上至下)。

圖5是包裹Hb-RB的復(fù)合載藥體系對(duì)乳腺癌細(xì)胞的細(xì)胞毒性柱狀分析圖。

圖6是向耗盡氧氣的RB封閉體系中通入氧氣并采用1.5mW/cm²的白光照射時(shí)單線態(tài)氧的生成圖譜。

具體實(shí)施方式

下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。

下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。

本實(shí)施例采用的攜氧蛋白為血紅蛋白(Hb)，Hb是高等生物體內(nèi)負(fù)責(zé)運(yùn)載分子氧的一種蛋白質(zhì)，由兩條α鏈和兩條β鏈構(gòu)成，每條鏈有一個(gè)包含一個(gè)鐵原子的環(huán)狀血紅素。血紅蛋白的特點(diǎn)是在氧含量高的地方容易與氧結(jié)合，而在氧含量低的地方容易與氧分離。

本實(shí)施例采用的模型藥物為孟加拉紅(RB)，RB是一種水溶性光敏劑，其微分量子產(chǎn)率較高，為0.75，在特征激發(fā)波長(zhǎng)照射下會(huì)產(chǎn)生活性很強(qiáng)的單線態(tài)氧，具有殺傷腫瘤細(xì)胞的作用。

本實(shí)施例選用PBS緩沖液(pH值為7.4，離子強(qiáng)度為0.01M)配制溶液，從而最大限度的保持蛋白活性。

按照下述步驟制備對(duì)微弱光敏感的光敏藥物(Hb-RB)：

采用PBS緩沖液配制RB溶液，濃度為2mg/ml，采用PBS緩沖液配制Hb溶液，濃度為5mg/ml，利用酰胺縮合反應(yīng)將RB的羧基與Hb的氨基相結(jié)合。

向RB溶液中加入EDC(10mg)進(jìn)行活化10min，生成活化的中間產(chǎn)物，隨后加入Sulfo-NHS進(jìn)行穩(wěn)定活化中間體，并離心去除已水解部分。向上述體系中緩慢加入Hb溶液，20℃下避光攪拌反應(yīng)15min后，轉(zhuǎn)移至4℃繼續(xù)避光攪拌反應(yīng)15h，透析除去未反應(yīng)的RB，凍干樣品，測(cè)量產(chǎn)物中RB的含量，并低溫保存。

實(shí)施例1、

在避光條件下配置所含RB濃度為0.01mg·mL^-1的Hb-RB溶液3.5mL，與70μL1mg·mL^-1的9,10-Diphenylanthracene(DPA)的DMSO溶液混合均勻后，置于封閉的石英比色皿中。將比色皿置于強(qiáng)度約為50μW/cm²的微弱光照射下，并利用紫外-可見分光光度計(jì)測(cè)量體系在350～410nm范圍內(nèi)的吸光度，每照射5min測(cè)量一次，比較380nm處吸光度的變化情況。

DPA是一種常用的化學(xué)捕獲劑，其與單線態(tài)氧可以快速反應(yīng)生成穩(wěn)定的內(nèi)氧化物，通過(guò)測(cè)定其在380nm處吸光度的減少量即可以測(cè)量單線態(tài)氧的含量。如圖1所示，可以看出，隨著照射時(shí)間的延長(zhǎng)，體系在380nm處的吸光度逐漸減弱，表明單線態(tài)氧的生成量持續(xù)增加；而相同照射條件下，單純的RB溶液中觀測(cè)不到單線態(tài)氧的生成。這一現(xiàn)象表明本發(fā)明成功地合成了微弱光敏感的光敏藥物，在極弱的激發(fā)光照射下即可被激活，產(chǎn)生單線態(tài)氧。

實(shí)施例2、

在避光條件下配置0.01mg·mL^-1RB溶液以及所含RB濃度為0.01mg·mL^-1的Hb-RB溶液各1mL，分別與20μL1mg·mL^-1DPA的DMSO溶液混合均勻后，置于封閉的微量石英比色皿中。使用波長(zhǎng)為550nm，功率為2mW/cm²的激發(fā)光照射比色皿，每分鐘測(cè)量一次體系在350～410nm范圍內(nèi)的吸光度，比較380nm處吸光度的變化情況。如圖2所示，可以看出，隨著照射時(shí)間的延長(zhǎng)，兩個(gè)體系中380nm處吸光度均逐漸降低，且Hb-RB體系降低更為明顯。這一現(xiàn)象說(shuō)明在相同條件下，Hb-RB體系會(huì)生成更多的單線態(tài)氧。

實(shí)施例3、

在避光條件下配置RB濃度為0.01mg·mL^-1的Hb-RB溶液3.5mL，與70μL1mg·mL^-1DPA的DMSO溶液混合均勻后，置于石英比色皿中。先通入氮?dú)?，將體系中的分子氧排除干凈后，將體系暴露在室內(nèi)可見光條件下(光照強(qiáng)度為1.5mW/cm²)，通入氧氣，每5s測(cè)一次體系在350～410nm范圍內(nèi)的吸光度。如圖3所示，可以看出，溶液在380nm處吸光度有明顯的下降，即通入氧氣過(guò)程中體系產(chǎn)生大量的單線態(tài)氧，進(jìn)一步表明Hb-RB對(duì)激發(fā)光的敏感性非常強(qiáng)，在體系中存在分子氧的條件下，可被普通的自然光激發(fā)，避免了高能量激光器的使用。

實(shí)施例4、

在避光條件下配置Hb濃度為2mg·mL^-1的Hb-RB溶液，利用層層組裝法通過(guò)共價(jià)鍵組裝到多孔納米碳酸鈣粒子表面至所需層數(shù)。將其與乳腺癌細(xì)胞(MCF-7)混合后(空白對(duì)照組不加入載藥納米粒子)，避光或使用強(qiáng)度為1.5mW/cm²的白光照射10min，隨后置于黑暗的培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)20min，使用流式細(xì)胞儀測(cè)定腫瘤細(xì)胞對(duì)載藥納米粒子的內(nèi)吞情況。如圖4所示，與空白對(duì)照和無(wú)光照條件相比，光照后細(xì)胞內(nèi)的熒光強(qiáng)度增加明顯，即光照可以促進(jìn)MCF-7細(xì)胞對(duì)載藥納米粒子的內(nèi)吞，證明其良好的PCI效果。

實(shí)施例5、

在避光條件下配置Hb濃度為2mg·mL^-1的Hb-RB溶液，利用層層組裝法通過(guò)共價(jià)鍵組裝到負(fù)載抗腫瘤藥物(阿霉素(DOX))的多孔納米碳酸鈣粒子表面至所需層數(shù)。在強(qiáng)度為1.5mW/cm²的白光照射下測(cè)定其對(duì)MCF-7細(xì)胞的殺傷效果。如圖5中的第2個(gè)、第3個(gè)和第4個(gè)柱狀圖所示，可以看出，本發(fā)明光敏藥物(Hb-RB溶液)對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷效果具有濃度依懶性，隨著所加入藥物濃度增加，細(xì)胞的殺傷率增大。圖5中第1個(gè)柱狀圖為為無(wú)任何外加物質(zhì)時(shí)的細(xì)胞活性柱狀圖。

比較例1、

在避光條件下配置0.01mg·mL^-1RB溶液3.5mL，與70μL 1mg·mL^-1DPA的DMSO溶液混合均勻后，置于石英比色皿中。先通入氮?dú)猓瑢Ⅲw系中的分子氧排除干凈后，測(cè)定體系在350nm～410nm范圍內(nèi)的吸光度；隨后將體系暴露在室內(nèi)可見光條件下(光照強(qiáng)度為1.5mW/cm²)，向體系中通入氧氣30s，并測(cè)定體系在350nm～410nm范圍內(nèi)的吸光度，比較體系中380nm處吸光度的變化情況。由圖6可以看出，通入氧氣后，暴露在室內(nèi)可見光條件下的RB溶液體系不產(chǎn)生單線態(tài)氧，即其對(duì)激發(fā)光的敏感程度較低，不能被低強(qiáng)度的可見光，而只能被具有一定波長(zhǎng)和一定強(qiáng)度的激光激發(fā)。

由上述測(cè)試可以看出，本發(fā)明以血紅蛋白(肌紅蛋白)為底物，利用酰胺縮合反應(yīng)將光敏劑孟加拉紅接枝到血紅蛋白(肌紅蛋白)上，得到了具有微弱光敏感性能且能夠增加單線態(tài)氧產(chǎn)量的新型光敏藥物。所述光敏藥物可以不使用激光照射，僅在微弱的可見光照射下被激活，并產(chǎn)生大量的單線態(tài)氧。

盡管本發(fā)明已經(jīng)參照附圖和優(yōu)選實(shí)施例進(jìn)行了說(shuō)明，但是，對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，本發(fā)明可以有各種更改和變化。本發(fā)明的各種更改、變化、和等同物由所附的權(quán)利要求書的內(nèi)容涵蓋。