本發(fā)明屬于高分子化學(xué)與生物醫(yī)學(xué)工程領(lǐng)域，更具體地，涉及一種輸送抗體用于腫瘤免疫治療的mr成像聚合物膠束及其制備方法。

背景技術(shù)：

惡性腫瘤嚴(yán)重危害人類健康，目前治療癌癥的常用的方法有手術(shù)、放療、化療和免疫治療。而腫瘤免疫治療現(xiàn)已成為繼手術(shù)治療、放射治療和化學(xué)藥物治療之后的另一種控制腫瘤的有效療法，并廣泛應(yīng)用于臨床。其中，免疫檢查點(diǎn)抑制劑抗體療法因其在多種腫瘤中均表現(xiàn)出了很好的抗腫瘤活性并顯著延長(zhǎng)臨床生存期而得到廣泛關(guān)注。但免疫檢查點(diǎn)抑制劑抗體療法容易引發(fā)免疫相關(guān)的不良反應(yīng)，比如心肌炎、肝炎、肺炎、皮炎等，這些都被認(rèn)為是由于自身反應(yīng)性t細(xì)胞的異?；罨鸬?。因此，有必要對(duì)其治療方法進(jìn)行改進(jìn)。因此需要制備一種特殊功能的免疫檢查點(diǎn)抑制劑抗體輸送載體：“在生理環(huán)境中時(shí)抗體被屏蔽起來(lái)，從而阻止抗體與免疫細(xì)胞的結(jié)合，當(dāng)抗體到達(dá)腫瘤微環(huán)境后，抗體重新被釋放出來(lái)，恢復(fù)抗體與免疫細(xì)胞的結(jié)合功能?！笔沟媚[瘤免疫被激活的同時(shí)降低自身反應(yīng)性t細(xì)胞的異?；罨?，從而降低腫瘤免疫療法的毒副作用。

磁共振(mr)成像因具有空間分辨率高、軟硬組織成像好、無(wú)創(chuàng)性觀測(cè)等優(yōu)點(diǎn)，在醫(yī)療診斷特別是分子影像研究方面發(fā)揮著重要作用。隨著納米技術(shù)和mr分子影像的發(fā)展與結(jié)合，以超順磁性氧化鐵(spio)納米晶體構(gòu)建的mr納米探針得到了極大的關(guān)注。由于spio具有低毒性、良好的生物相容性和磁共振信號(hào)敏感性等特點(diǎn)，已經(jīng)應(yīng)用于臨床mr成像。因此，研發(fā)具有抗體輸送與磁學(xué)性能兼?zhèn)涞亩喙δ艽殴舱穹肿犹结?，可以?duì)抗體傳輸效率進(jìn)行實(shí)時(shí)有效的評(píng)估。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的上述缺陷，提供一種抗體輸送與磁學(xué)性能兼?zhèn)涞亩喙δ茌d體，即一種輸送抗體用于腫瘤免疫治療的mr成像聚合物膠束。

本發(fā)明的另一目的是提供上述輸送抗體用于腫瘤免疫治療的mr成像聚合物膠束的制備方法。

本發(fā)明目的通過(guò)如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

一種輸送抗體用于腫瘤免疫治療的mr成像聚合物膠束，所述聚合物膠束為核殼結(jié)構(gòu)：核負(fù)載超順磁性四氧化三鐵納米顆粒、膠束表面用基質(zhì)金屬蛋白酶敏感的多肽偶聯(lián)抗體形成殼層，用酸敏鍵偶聯(lián)的單甲基醚聚乙二醇mpeg20k，作為抗體的屏蔽層；所述單甲基醚聚乙二醇mpeg20k分子量為20kda。

本發(fā)明一種輸送抗體用于腫瘤免疫治療的mr成像聚合物膠束，其表面的屏蔽層對(duì)ph敏感，在體內(nèi)生理環(huán)境ph為7.4條件下，可以屏蔽血液中的免疫細(xì)胞與抗體結(jié)合，而在ph為6.5的腫瘤微環(huán)境中，該屏蔽層脫去，繼而在腫瘤微環(huán)境高表達(dá)的基質(zhì)金屬蛋白酶(mmps)的作用下，釋放抗體，與免疫細(xì)胞結(jié)合，發(fā)揮免疫治療的作用；另一方面，聚合物膠束負(fù)載的超順磁性四氧化三鐵納米顆粒(spions)，可實(shí)現(xiàn)非侵入式的mr成像，從而實(shí)現(xiàn)診療一體化。

所述抗體可以是免疫治療抗體，例如pd-1抗體，也可以是本領(lǐng)域其他常用的抗體。

優(yōu)選地，所述聚合物膠束平均粒徑為140nm～190nm。

優(yōu)選地，所述超順磁性四氧化三鐵納米顆粒為油溶性。

所述聚合物膠束在腫瘤微環(huán)境，即ph小于或等于6.5時(shí)，屏蔽層脫落，在基質(zhì)金屬蛋白酶的作用下，釋放抗體。

所述抗體質(zhì)量占聚合物膠束質(zhì)量的1.0％～2.0％，超順磁性四氧化三鐵納米顆粒質(zhì)量占聚合物膠束質(zhì)量的15％～25％。

所述輸送抗體用于腫瘤免疫治療的mr成像聚合物膠束的制備方法，包括以下步驟：

s1.以l-苯丙氨酸為原料，加入三光氣，制得l-苯丙氨酸-環(huán)碳酸酐，表述為l-phe-nca；

s2.以l-phe-nca為原料經(jīng)聚合反應(yīng)獲得α-疊氮基-聚乙二醇-聚苯丙氨酸，表述為n3-peg-plphe；

s3.以乙酰丙酮鐵、1,2-十六烷二醇為原料，制得超順磁性四氧化三鐵納米顆粒(spions)；

s4.以n3-peg-plphe和spions為原料，經(jīng)過(guò)超聲自組裝獲得負(fù)載spions的膠束，表述為n3-peg-plphe@spions；

s5.以pd-1單克隆抗體mab和基質(zhì)金屬蛋白酶底物多肽peptide為原料，經(jīng)過(guò)一系列反應(yīng)，將抗體偶聯(lián)在s4所制備的膠束表面，表述為mab-peptide-peg-plphe@spions；

s6.以mpeg20k-oh為原料，經(jīng)過(guò)一系列反應(yīng)，在s5所制備的膠束表面構(gòu)建酸敏感屏蔽層，表述為mpeg20k-(mab-peptide)-peg-plphe@spions。

所述輸送抗體用于腫瘤免疫治療的mr成像聚合物膠束在腫瘤免疫治療和mr成像中的應(yīng)用。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：

本發(fā)明一種輸送抗體用于腫瘤免疫治療的mr成像聚合物膠束可以在體內(nèi)穩(wěn)定循環(huán)，并富集在腫瘤部位，阻止攜帶的抗體藥物在生理環(huán)境下與免疫細(xì)胞結(jié)合；同時(shí)該載體含有spions內(nèi)核，可以實(shí)現(xiàn)mr成像造影功能；所述聚合物膠束還具有ph和mmps敏感性，當(dāng)聚合物膠束到達(dá)腫瘤部位時(shí)，可以脫去屏蔽層，并斷裂mmps敏感多肽，釋放抗體藥物，恢復(fù)抗體與免疫細(xì)胞的結(jié)合功能，實(shí)現(xiàn)抗體藥物在腫瘤微環(huán)境的響應(yīng)性釋放，從而增加腫瘤免疫的組織特異性并降低自身反應(yīng)性t細(xì)胞的異常活化率。

附圖說(shuō)明

圖1為n3-peg-nh2、l-phe-nca和n3-peg-plphe的核磁譜圖。

圖2為酸敏mpeg20k-cdm和mpeg20k-phe-alkyne的核磁譜圖。

圖3為聚合物膠束在ph7.4、ph6.5和ph6.5&mmp-2條件下的粒徑分布圖。

圖4為聚合物膠束的tem圖，(a)負(fù)載spions，未用染色劑染色，(b)負(fù)載spions，3％醋酸鈾染色1min。

圖5為聚合物膠束在ph7.4、ph6.5和ph6.5&mmp-2條件下與t淋巴細(xì)胞的結(jié)合效率圖。

圖6為聚合物膠束標(biāo)記腫瘤細(xì)胞后的mr成像圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合說(shuō)明書(shū)附圖和具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步解釋說(shuō)明，其描述較為具體和詳細(xì)，但并不能因此而理解為對(duì)本發(fā)明范圍的限制，但凡采用等同替換或等效變換的形式所獲得的技術(shù)方案，均應(yīng)包括在本發(fā)明權(quán)利要求的保護(hù)范圍之內(nèi)。

以下實(shí)施例和對(duì)比例中，所用原料均為市售商品。

實(shí)施例1

一種輸送抗體用于腫瘤免疫治療的mr成像聚合物膠束的制備方法，包括如下步驟：

s1.l-phe-nca(l-苯丙氨酸-環(huán)碳酸酐)聚合物的合成：具體合成步驟如下：稱取10gl-苯丙氨酸于500ml的三口瓶中，加入新蒸的100ml乙酸乙酯，90℃加熱回流后，滴入溶有10g三光氣的50ml乙酸乙酯，攪拌，加熱回流約5h至溶液呈黃色澄清溶液?；謴?fù)到室溫后，-40℃冷凍0.5h。乙酸乙酯層分別用4℃預(yù)冷飽和nahco3溶液(100ml×2)、飽和nacl溶液(50ml×2)洗滌，分液。乙酸乙酯層再用mgso4干燥，過(guò)濾，旋蒸濃縮后在新蒸的石油醚中沉淀，抽濾，所得固體用乙酸乙酯/石油醚重結(jié)晶，抽濾，真空干燥得白色粉末l-phe-nca6.0g，產(chǎn)率52％。

s2.n3-peg-plphe聚合物的合成：稱取1.0gn3-peg-nh2(α-疊氮基-ω-氨基聚乙二醇，mw為1.8k)于100ml的史萊克反應(yīng)茄瓶中，70℃真空干燥1h，通n2后恢復(fù)至室溫，加入30ml新蒸的ch2cl2溶解。將3.2gl-phe-nca溶于3ml無(wú)水dmf后，加入到上述史萊克反應(yīng)茄瓶中，密封，35℃反應(yīng)48h后在乙醚中沉淀，離心得白色產(chǎn)物n3-peg-plphe。¹hnmr測(cè)得phe的單元為25，聚合物數(shù)均分子量為5525。

s3.超順磁性fe3o4納米粒子的合成：將乙酰丙酮鐵(2mmol)、油胺(6mmol)、油酸(6mmol)、1,2-十六烷二醇(10mmol)和芐醚(18ml)混合均勻，氬氣保護(hù)下迅速加熱到200℃，保持2h后，繼續(xù)升溫到300℃，回流1h。自然冷卻至室溫，在乙醇(200ml)中沉淀，離心分離后，再分散在35ml正己烷中，過(guò)濾干燥即得fe3o4納米粒子。

s4.制備負(fù)載spions的膠束：將3mgspions、30mgn3-peg-plphe溶于8mlthf，超聲下滴加到30ml的去離子水中，用水透析以除去thf(透析袋mwco14k)，用220nm水相濾頭過(guò)濾，50krpm超高速離心去除未包裹spions的膠束，用5mmpbs(ph為7.4)復(fù)溶至約2.5mg/ml。該制備方法采用本技術(shù)領(lǐng)域常規(guī)技術(shù)。

s5.mab-peptide-peg-plphe@spions的合成：

首先，使pd-1抗體(goinvivo^tmanti-mousecd279，biolegend)巰基化，簡(jiǎn)要操作步驟如下：取1ml1mg/ml的抗體溶液(ph為7.4)，加入10μl100mmpbs和30mmedta(ph為7.4)，加入0.7mg2-亞氨基硫烷鹽酸鹽(2-it，mw為137.6，5mm)，20℃反應(yīng)45min。使用hitrap^tm柱進(jìn)行快速脫鹽純化(puresystem)，洗脫液組成:10mmpbs+3mmedta(ph為7.4)，檢測(cè)波長(zhǎng)：280nm，按照1ml/管收集樣品。合并含有蛋白的溶液，超濾(mwco:10k)濃縮，定量至2.5ml。用紫外分光光度法或者elisa法測(cè)定抗體濃度，回收率約80％。使用dtnb測(cè)定巰基的含量，測(cè)的平均每個(gè)抗體分子引入3.2個(gè)巰基。

其次，pd-1抗體上的巰基與mal-peptide-alkyne的馬來(lái)酰亞胺基加成，從而引入炔基(alkyne)，簡(jiǎn)要操作步驟如下：稱取2.5mgmal-peptide-alkyne(mw為1013.5，1mm)溶于30μldmso，加入到上述巰基化的抗體溶液中，4℃攪拌過(guò)夜。使用hitrap^tm柱進(jìn)行脫鹽純化(puresystem)，洗脫液組成:10mmpbs，ph7.4，檢測(cè)波長(zhǎng)：280nm，按照1ml/管收集樣品。合并含有蛋白的溶液，超濾(mwco:10k)濃縮，定量至2ml。用紫外分光光度法或者elisa法測(cè)定抗體濃度，回收率約81％。最后，pd-1抗體上的炔基與膠束表面的疊氮基進(jìn)行點(diǎn)擊反應(yīng)，具體操作步驟如下：取上述制備得到的2mln3-peg-plphe@spions的膠束溶液(疊氮基約為0.72μmol)，加入10μlcu(ii)bsc(1mg/ml)后，凍融除氧，重復(fù)2次。加入上述制備的炔基化的抗體溶液(抗體約0.64mg，炔基約0.0085μmol)和2mg維生素c，室溫下反應(yīng)過(guò)夜。

s6.mpeg20k-(mab-peptide)-peg-plphe@spions的合成：

mpeg20k-phe-alkyne合成反應(yīng)路線如下：

首先，將2-丙酸-3-甲基馬來(lái)酸酐(cdm)用草酰氯活化成酰氯。簡(jiǎn)要描述如下：稱取0.37gcdm(mw184.1,2.0mmol)溶于新蒸的5mlch2cl2，加入催化劑量的50μldmf，n2氣保護(hù)下，冰水浴下滴入1.27ml草酰氯(20mmol)。滴加完后，室溫下反應(yīng)3h，真空旋蒸除去溶劑及多余的草酰氯得到淺黃色粘稠液體。

第二步，合成mpeg20k-cdm。將1.0gmpeg20k-oh(0.05mmol)溶于無(wú)水的4mlch2cl2，加入到上述粘稠液體中，加入催化劑12mgdmap(mw122.17,0.1mmol)，冰水浴下逐滴滴入含有0.35ml三乙胺(mw101.2,2.5mmol)的12ml甲苯溶液，溶液呈棕灰色，反應(yīng)24h。反應(yīng)完后抽濾，濃縮濾液，在冷乙醚中沉淀，抽濾，濾餅用50mlch2cl2溶解。ch2cl2層分別用15ml0.5mhcl、15ml飽和nacl溶液洗滌，分層，之后用mgso4干燥，過(guò)濾，濃縮，在冷乙醚沉淀得微黃色產(chǎn)物。¹hnmr測(cè)得轉(zhuǎn)化率約80％。

第三步，合成mpeg20k-phe-alkyne。將0.6gmpeg20k-cdm(0.03mmol)溶于4mlch2cl2和0.2mldmf后，加入33μg丙炔胺(mw55.1，0.6mmol)，室溫下反應(yīng)12h，在冷乙醚中沉淀，離心得產(chǎn)物，產(chǎn)物用ch2cl2溶解后再在乙醚中沉淀得產(chǎn)物，mpeg20k-phe-alkyne的結(jié)構(gòu)式如上述反應(yīng)路線所示。

第四步，往s5所述反應(yīng)過(guò)夜后的mab-peptide-peg-plphe@spions溶液中加入29.0mgmpeg20k-phe-alkyne(1.44μmol)和2mg維生素c，繼續(xù)反應(yīng)8h。反應(yīng)完后，加入1ml10mmedta，50krpm超高速離心分離，所得固體用pbs(ph7.4)洗滌一次，復(fù)溶至2ml生理鹽水中，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

將該溶液調(diào)至ph6.5，使peg20k從表面脫落后再用elisa法測(cè)定抗體濃度，約100ug/ml，抗體的反應(yīng)效率約31％?？贵w占總質(zhì)量的1.25％。mpeg20k的屏蔽層密度可以通過(guò)調(diào)整反應(yīng)時(shí)間進(jìn)行調(diào)控。

聚合物的結(jié)構(gòu)分析和聚合物膠束的形貌表征：取各步產(chǎn)物約9mg溶于適量氘代溶劑，用¹h-nmr400mhz核磁共振波譜儀進(jìn)行測(cè)試，檢測(cè)反應(yīng)前后聚合物結(jié)構(gòu)上¹h化學(xué)位移的變化，如圖1和圖2。制備了不同聚合物膠束樣品，包括：n3-peg-plphe、n3-peg-plphe@spions，mpeg20k-(mab-peptide)-peg-plphe，mpeg20k-(mab-peptide)-peg-plphe@spions，用zeta電位及粒度測(cè)定儀(dls)檢測(cè)聚合物膠束的粒徑，如圖3，入射激光波長(zhǎng)λ＝532nm，入射角θ＝175°，溫度為25℃；粒徑值取三次測(cè)量值的平均值。

用透射電鏡(tem)觀察聚合物膠束的形貌如圖4，圖4(a)為負(fù)載spions的膠束，未染色，圖4(b)為負(fù)載spions的膠束，染色。從圖4(b)中可以看出整個(gè)聚合物膠束載體粒徑大約在170nm。簡(jiǎn)要操作如下：取2μl樣品(0.2mg/ml)滴在純碳膜銅網(wǎng)上，在室溫下晾干，用3％的醋酸鈾染色1min。用透射電鏡在120kv下觀察(所述操作采用本領(lǐng)域常規(guī)技術(shù)進(jìn)行檢測(cè))。

用于腫瘤免疫治療的mr成像聚合物膠束的ph和mmps雙響應(yīng)性檢測(cè)：為證明實(shí)施例1制備的聚合物膠束具有ph和mmps雙響應(yīng)性，分別將聚合物膠束置于ph6.5和10nmmmp-2的環(huán)境中處理4h和6h后，再與t淋巴細(xì)胞進(jìn)行共孵育，使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)處理前后抗體與t淋巴細(xì)胞的結(jié)合效率，結(jié)果如圖5所示。結(jié)果表明，游離的pd-1抗體與t淋巴細(xì)胞的結(jié)合效率可達(dá)82.85％(freeapd1)，而經(jīng)聚合物膠束載體屏蔽后抗體與t淋巴細(xì)胞的結(jié)合效率降至32.00％(shielded)，說(shuō)明載體在ph7.4的生理環(huán)境下可以很好地屏蔽抗體，阻止pd-1抗體與t淋巴細(xì)胞的結(jié)合。當(dāng)聚合物膠束經(jīng)ph6.5的弱酸性環(huán)境處理后，抗體與t淋巴細(xì)胞的結(jié)合效率可恢復(fù)至65.65％(ph6.5)，當(dāng)進(jìn)一步使用mmp-2酶切處理后，抗體與t淋巴細(xì)胞的結(jié)合效率可恢復(fù)到75.49％(ph6.5&mmp-2)，說(shuō)明載體具有很好的ph和mmps酶響應(yīng)性。

體外mri成像效果：為更進(jìn)一步證明實(shí)施例1制備的聚合物膠束具有mr成像能力，以5×10⁵/孔的b16-f10接種于96孔板中，培養(yǎng)24h后加入實(shí)施例1制備的聚合物膠束，使得各孔的最終鐵濃度分別為5μg/ml、10μg/ml、15μg/ml、20μg/ml、25μg/ml、30μg/ml、35μg/ml、40μg/ml，并進(jìn)一步檢測(cè)孵育時(shí)間為30min、60min、90min、120min、150min、180min、210min、240min后各孔的mr成像能力。由圖6可以看到，各濃度梯度標(biāo)記b16-f10在t1wi、t/2wi、ffe及t2-mapping上信號(hào)均逐漸降低，其信號(hào)的減低程度具有一定的聚合物膠束濃度的依賴性，隨著聚合物膠束含量的增高，細(xì)胞mr信號(hào)逐漸減低。說(shuō)明該聚合物膠束具有很強(qiáng)的磁敏感性，可用于mr成像，結(jié)合孵育時(shí)間和鐵濃度結(jié)果可知，當(dāng)鐵濃度為30μg/ml、孵育時(shí)間為210min時(shí)，即可達(dá)到最佳的mr成像效果。

實(shí)施例2

一種輸送抗體用于腫瘤免疫治療的mr成像聚合物膠束的制備方法，包括如下步驟：

步驟s1至s3，及s5至s6同實(shí)施例1

s4.制備負(fù)載spions的膠束：將8mgspion、30mgn3-peg-plphe溶于10mlthf，超聲下滴加到30ml的去離子水中，用水透析以除去thf(透析袋mwco14k)，用450nm水相濾頭過(guò)濾，50krpm超高速離心去除未包裹spions的膠束，用5mmpbs(ph為7.4)復(fù)溶至約2.5mg/ml。超順磁性四氧化三鐵納米顆粒(spions)質(zhì)量占聚合物膠束質(zhì)量的25％。該制備方法采用本技術(shù)領(lǐng)域常規(guī)技術(shù)。

實(shí)施例3

一種輸送抗體用于腫瘤免疫治療的mr成像聚合物膠束的制備方法，包括如下步驟：步驟s1至s3，及s5至s6同實(shí)施例1

s4.制備負(fù)載spions的膠束：將4mgspion、32mgn3-peg-plphe溶于5mlthf，超聲下滴加到25ml的去離子水中，用水透析以除去thf(透析袋mwco14k)，用450nm水相濾頭過(guò)濾，60krpm超高速離心去除未包裹spions的膠束，用5mmpbs(ph為7.4)復(fù)溶至約2.5mg/ml。超順磁性四氧化三鐵納米顆粒(spions)質(zhì)量占聚合物膠束質(zhì)量的15％。該制備方法采用本技術(shù)領(lǐng)域常規(guī)技術(shù)。

實(shí)施例4

一種輸送抗體用于腫瘤免疫治療的mr成像聚合物膠束的制備方法，包括如下步驟：

步驟s1至s4，及s6同實(shí)施例1

s4mab-peptide-peg-plphe@spions的合成：

首先，使pd-1抗體(goinvivo^tmanti-mousecd279，biolegend)巰基化，簡(jiǎn)要操作步驟如下：取1ml1mg/ml的抗體溶液(ph為7.4)，加入10μl100mmpbs和30mmedta(ph為7.4)，加入0.7mg2-亞氨基硫烷鹽酸鹽(2-it，mw為137.6，5mm)，20℃反應(yīng)45min。使用hitrap^tm柱進(jìn)行快速脫鹽純化(puresystem)，洗脫液組成:10mmpbs+3mmedta(ph為7.4)，檢測(cè)波長(zhǎng)：280nm，按照1ml/管收集樣品。合并含有蛋白的溶液，超濾(mwco:10k)濃縮，定量至2.5ml。用紫外分光光度法或者elisa法測(cè)定抗體濃度，回收率約80％。使用dtnb測(cè)定巰基的含量，測(cè)的平均每個(gè)抗體分子引入3.2個(gè)巰基。

其次，pd-1抗體上的巰基與mal-peptide-alkyne的馬來(lái)酰亞胺基加成，從而引入炔基(alkyne)，簡(jiǎn)要操作步驟如下：稱取2.5mgmal-peptide-alkyne(mw為1013.5，1mm)溶于30μldmso，加入到上述巰基化的抗體溶液中，4℃攪拌過(guò)夜。使用hitrap^tm柱進(jìn)行脫鹽純化(puresystem)，洗脫液組成:10mmpbs，ph7.4，檢測(cè)波長(zhǎng)：280nm，按照1ml/管收集樣品。合并含有蛋白的溶液，超濾(mwco:10k)濃縮，定量至2ml。用紫外分光光度法或者elisa法測(cè)定抗體濃度，回收率約81％。

最后，pd-1抗體上的炔基與膠束表面的疊氮基進(jìn)行點(diǎn)擊反應(yīng)，具體操作步驟如下：取上述制備得到的0.5mln3-peg-plphe@spions的膠束溶液(疊氮基約為0.18μmol)，加入5μlcu(ii)bsc(1mg/ml)后，凍融除氧，重復(fù)2次。加入上述制備的炔基化的抗體溶液(抗體約0.64mg，炔基約0.0085μmol)和2mg維生素c，室溫下反應(yīng)過(guò)夜。得到的載體抗體負(fù)載量大于實(shí)施例1。并且通過(guò)與實(shí)施例1的相同的步驟s6后，得到抗體占載體質(zhì)量的2.0％。