本發(fā)明屬于組織工程支架領(lǐng)域，特別涉及一種具有多級孔隙結(jié)構(gòu)的熱固性彈性體組織工程支架的制備方法。
背景技術(shù)：
：組織、器官的損傷是嚴(yán)重威脅人類健康的重大疾病之一，傳統(tǒng)上主要是通過臨床器官移植等手段來進(jìn)行治療。20世紀(jì)80年代生物工程的先驅(qū)者yuan-chengfung教授首先開創(chuàng)了組織工程這一術(shù)語，其目的是體內(nèi)或體外生成可替代性的具有三維結(jié)構(gòu)的組織或器官，以修復(fù)、再生受損害或失去的人體組織、器官，從而突破現(xiàn)有臨床醫(yī)學(xué)手段對受損組織或器官治療的限制，包括捐贈器官的數(shù)量有限、異體排異性反應(yīng)、潛在病毒的傳染、自體“以創(chuàng)傷修復(fù)創(chuàng)傷”的二次傷害等。組織工程技術(shù)由于能成功的地使受損組織修復(fù)再生以達(dá)到治療病患的目的，在過去二十年里得到了更為廣泛的關(guān)注。組織工程支架能夠起到模擬天然細(xì)胞外基質(zhì)的功能，提供適合細(xì)胞生長分化的微觀環(huán)境。理想的組織工程支架應(yīng)該具備以下幾個基本特點：(1)具有合適的物理表面形態(tài)和生物化學(xué)性質(zhì)，以促進(jìn)細(xì)胞的增殖和分化；(2)具有開放性、相互連通的微孔結(jié)構(gòu)，以促進(jìn)細(xì)胞營養(yǎng)物質(zhì)擴散和代謝產(chǎn)物的釋放；(3)具有一定的機械強度，以提供組織生長支撐作用；(4)具有良好的生物相容性，保證對細(xì)胞無毒副作用和對人體無免疫原性；(5)具有可控的生物降解性，要求降解速率和組織再生的速率相匹配，組織再生的同時生物支架逐漸降解最終被代謝排出體外。然而目前能夠真正應(yīng)用于臨床的還非常有限，其中的原因很多，一個重要的因素就是生物材料和人體組織之間的力學(xué)性質(zhì)不匹配，人體的很多組織和器官比如心血管、肺、膀胱等都是具有良好彈性，同時處于持續(xù)的力學(xué)刺激的環(huán)境中。因此具有良好生物相容性和降解性，能在一定程度上模擬上述天然組織的力學(xué)性質(zhì)的生物彈性體應(yīng)運而生，這些生物彈性體能夠?qū)⒅車牧W(xué)刺激傳遞給新生組織，能夠從循環(huán)反復(fù)的形變中恢復(fù)，適用于細(xì)胞的動態(tài)體外培養(yǎng)和植入到人體動態(tài)的力學(xué)環(huán)境中，植入后不會對周圍的組織產(chǎn)生力學(xué)損傷。正是由于這諸多特點，生物彈性體已經(jīng)迅速成為組織工程中一類重要的生物材料，同時在其它相關(guān)的生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域也得到了應(yīng)用。一個理想的生物彈性體要滿足諸多的要求，除了具有優(yōu)良的力學(xué)性能，還要求有良好的生物相容性和生物降解性，同時要能夠較好地結(jié)合生物活性分子，具有良好的加工性。目前滿足這些條件的生物彈性體還較少，真正獲得應(yīng)用的更為有限，主要還是以聚乳酸[poly(lacticacid),pla]，聚乙醇酸[poly(glycolicacid),pga]，和聚己內(nèi)酯[polycaprolactone(pcl)]及其共聚物和衍生物為主。在新發(fā)展起來的生物彈性體中，聚癸二酸甘油酯[poly(glycerolsebacate),pgs]是一個突出的代表。pgs生物彈性體于10多年前，由wang等首先報道，是最早被引入組織工程領(lǐng)域的生物彈性體之一，它的出現(xiàn)帶動了其它熱固性生物彈性體的發(fā)展。而pgs本身也由于其諸多優(yōu)良的特性，例如有良好的體內(nèi)降解性能，由外到內(nèi)逐漸侵蝕，緩慢均勻地降解，使材料在較長時間內(nèi)保持原有的幾何形態(tài)和力學(xué)性能直至被新生組織代替，從而能保證由其制備的組織工程支架等生物醫(yī)用植入體在整個降解過程中，能保持良好的完整性，持續(xù)發(fā)揮應(yīng)有的作用。因此pgs獲得持續(xù)廣泛的研究，并顯示出了良好的應(yīng)用前景。隨著pgs研究的深入，人們也認(rèn)識到其還存在一些缺陷，限制了其進(jìn)一步應(yīng)用，其中一個突出的問題是其需要高溫高真空的劇烈交聯(lián)條件，一般只能通過模具法和刻蝕法成型，使其加工方法和應(yīng)用受到了很大限制。3d打印技術(shù)(又稱3d快速成型技術(shù)或rp)，它是指在計算機控制下，根據(jù)患者受損組織或器官的計算機輔助設(shè)計(cad)模型或計算機斷層掃描(ct)等數(shù)據(jù)，通過材料的精確3d堆積，快速制造任意復(fù)雜立體形狀的新型數(shù)字化成型技術(shù)。技術(shù)不僅能實現(xiàn)材料與患者病變部位的完美匹配，而且能在微觀結(jié)構(gòu)上精確調(diào)控材料的結(jié)構(gòu)。fdm作為3d打印技術(shù)中具有代表性的一種，其原理是采用熱熔噴頭，使得熔融狀態(tài)的材料按計算機控制的路徑擠出、沉積，并凝固成型，經(jīng)過逐層沉積、凝固，最后除去支撐材料，得到所需的三維產(chǎn)品。該技術(shù)特點是成型產(chǎn)品精度高、表面質(zhì)量好、無環(huán)境污染等，但是其缺點是操作溫度較高，也因其這樣的原理和特點一直以來是作為熱塑性材料的加工方法的?？偟膩碚f，材料和支架成型方法是組織工程支架制備的兩個關(guān)鍵要素，生物彈性體材料的應(yīng)運而生一定程度上解決了材料上的困境，pgs由于其優(yōu)良的性能也逐步成為制備組織工程支架的理想材料之一，而fdm技術(shù)作為一種熱塑性材料的打印技術(shù)，長期被用于構(gòu)建復(fù)雜結(jié)構(gòu)的組織工程支架。fdm打印技術(shù)因其熔融成型的原理，一直以來都被作為一種熱塑性材料加工方式被使用和研究，較難應(yīng)用于上述熱固性彈性體材料。以pgs為例，其中主要的困難下：首先預(yù)聚物是熱塑性材料可承受塑性加工即具有可打印性，然后需要進(jìn)一步的高溫、真空環(huán)境進(jìn)行交聯(lián)而固化保型。但在第二個步驟中，由于預(yù)聚物本身對熱敏感，受熱能使其流動性大大增加，在交聯(lián)固化前發(fā)生形變而破壞原有結(jié)構(gòu)，最終無法通過3d打印這種方式加工pgs這種交聯(lián)的彈性體。由于上述熱固性材料性質(zhì)和fdm熱塑性加工原理之間的不兼容性，導(dǎo)致目前未見利用fdm打印熱固性生物支架的報道，更未見fdm打印pgs彈性體支架。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種具有多級孔隙結(jié)構(gòu)的熱固性彈性體組織工程支架的制備方法，該方法解決了熱塑性fdm直接打印熱固性材料根本問題，所制備的組織工程支架在結(jié)構(gòu)上具有精確可控的多級孔隙結(jié)構(gòu)，方法簡單、快捷、適用于多種生物材料，具有良好的應(yīng)用前景。本發(fā)明的一種具有多級孔隙結(jié)構(gòu)的熱固性彈性體組織工程支架的制備方法，包括：(1)將熱固性材料與填充材料按質(zhì)量比1:0.5-3混合，得到混合材料；利用cad軟件構(gòu)建立方體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的模型，然后在3d打印機的加熱腔內(nèi)加入混合材料，通過3d打印得到初始支架；(2)將步驟(1)中的初始支架進(jìn)行熱交聯(lián)或光交聯(lián)，得到熱固性彈性體組織工程支架；最后去除填充材料，即得具有多級孔隙結(jié)構(gòu)的熱固性彈性體組織工程支架；其中，多級孔隙結(jié)構(gòu)包括初級輪廓結(jié)構(gòu)、纖維單元直徑和纖維之間的間隙產(chǎn)生的二級大孔結(jié)構(gòu)以及填充材料作為模板去除后產(chǎn)生的三級微孔結(jié)構(gòu)。所述步驟(1)中的熱固性材料為pgs、聚氨酯或環(huán)氧樹脂等。所述步驟(1)中的填充材料為鹽顆粒、石墨烯、碳納米管(或者其他碳材料)、二氧化硅、羥基磷灰石(或者其他無機材料)、尼龍或聚碳酸酯(或者其他其它熔點較高的聚合物)。所述鹽顆粒的直徑為20～100μm。所述步驟(1)中的混合方式為溶劑混合法或加熱法。所述步驟(1)中的3d打印參數(shù)為：擠壓腔溫度與噴嘴溫度40～100℃。所述步驟(2)中的熱交聯(lián)參數(shù)為：在100℃的真空烘箱中初步交聯(lián)固化12-24h，然后在120℃-150℃的真空烘箱中進(jìn)一步固化交聯(lián)。所述步驟(2)中得到的具有多級孔隙結(jié)構(gòu)的熱固性彈性體組織工程支架通過冷凍干燥進(jìn)行保存。以pgs作為熱固性材料、鹽顆粒作為填充材料為例說明本發(fā)明的原理：用粉碎機打碎鹽顆粒，篩網(wǎng)篩選一定尺寸范圍內(nèi)的鹽顆粒，將鹽顆粒與pgs預(yù)聚物按不同的比例混合，通過實際3d熔融打印實驗中的可打印性，包括擠出性和初始形態(tài)的穩(wěn)定性，以及后續(xù)高溫固化過程中的保形性，綜合考察選擇最合適的混合比例以滿足pgs3d打印的各項要求。將混合物裝在針筒中3d打印，調(diào)節(jié)理想的打印參數(shù)，要求可連續(xù)均勻纖維擠出(良好的擠出性)，打印完成后有良好的初始形態(tài)穩(wěn)定性。對于pgs彈性體組織工程支架，設(shè)計了多級別的孔隙結(jié)構(gòu)。通過對3d打印的模型設(shè)計，利用3d打印的個性化可定制優(yōu)勢，可方便構(gòu)建支架初級輪廓結(jié)構(gòu)。通過選擇針頭尺寸大小以及對打印路徑的設(shè)計，來調(diào)節(jié)纖維單元直徑的粗細(xì)和纖維之間的間隙，從而可以有效的控制支架的二級大孔結(jié)構(gòu)。另一方面，通過調(diào)節(jié)混合鹽粒的用量和尺寸大小，來調(diào)劑鹽粒作為模板去除后分布在纖維單元內(nèi)部多孔結(jié)構(gòu)的孔隙率和空隙尺寸，從而可有效控制支架的三級微孔結(jié)構(gòu)。接著，pgs作為一種代表性的熱固性生物彈性體，必須經(jīng)過高溫固化交聯(lián)才能獲得穩(wěn)定三維形態(tài)和力學(xué)性能。然而，pgs預(yù)聚物自身的結(jié)晶溫度較低，在高溫下黏度會降低容易發(fā)生形變。因此，鹽粒的混入在高溫交聯(lián)的過程中起到了非常重要的物理支撐作用，而pgs預(yù)聚物起到了類似于粘合劑的作用。為了使高溫條件固化后的形態(tài)與打印的pgs預(yù)聚物支架保持一致，支架先在較低的溫度下進(jìn)行一定程度的固化，然后在較高溫度下進(jìn)行進(jìn)一步的固化交聯(lián)。最后，將交聯(lián)完成后的支架，多次浸泡在乙醇蒸餾水混合液中除去未聚合的預(yù)聚物，鹽顆粒等，從而獲得具有多級孔隙結(jié)構(gòu)的3d打印pgs彈性體組織工程支架，然后進(jìn)行冷凍干燥除去支架中的水分，以便于使用和長期保存。有益效果本發(fā)明解決了熱塑性fdm直接打印熱固性材料根本問題，所制備的組織工程支架在結(jié)構(gòu)上具有精確可控的多級孔隙結(jié)構(gòu)，方法簡單、快捷、適用于多種生物材料，可根據(jù)患者的ct等數(shù)據(jù)進(jìn)行個性化定制所需的組織工程支架，可用于制備人耳軟骨支架、心肌補片、以及其他組織工程所需的多級孔支架，具有良好的應(yīng)用前景。附圖說明圖1為實施例的工藝流程圖；圖2為不同混合比例支架的sem圖；其中，a、d分別為比例1：0.5的樣本的截面和表面的50倍電鏡圖；b、e分別為比例1：1的樣本的截面和表面的50倍電鏡圖；c、f分別為比例1：2的樣本的截面和表面的50倍電鏡圖；圖3為pgs500與pgs300的電鏡圖；圖4為支架的固化交聯(lián)；圖5a-d為支架除去鹽顆粒前后對比圖；圖6為支架剪切應(yīng)力與剪切速率的曲線圖；圖7為不同混合比例的樣條高溫保形性對比圖；圖8為pgs300與pgs500的微孔尺寸和直徑尺寸對比；圖9a-d為pgs支架的力學(xué)性能；圖10為pgs支架的生物降解性；圖11a-l為pclu彈性體及其支架的微觀形態(tài)結(jié)構(gòu)；圖12a-d為pclu支架的力學(xué)性能及紅外光譜分析。具體實施方式下面結(jié)合具體實施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。實施例11.打印材料準(zhǔn)備pgs預(yù)聚物(pre-pgs)與鹽顆粒的混合參數(shù)直接決定了支架打印時的擠出性、初始形態(tài)穩(wěn)定性、高溫固化保形性和支架的孔隙結(jié)構(gòu)，從而間接決定了支架的性能，包括力學(xué)性能和生物降解性?；旌线^程所需研究的參數(shù)包括混合方式，混合比例以及鹽顆粒的直徑等。1.1混合方式pre-pgs在常溫下為粘稠狀且黏度較大，隨著混合的鹽比例的增大，混合物的黏度也逐漸增大，很容易產(chǎn)生混合不均勻的問題，因此需要考慮降低混合物的黏度。常用的降低黏度的方法有兩種：溶劑法和加熱法。因此采用兩種方法混合材料，通過預(yù)擠出實驗進(jìn)行對比分析，選擇更適合的方法進(jìn)行后續(xù)實驗。1.1.1溶劑混合法1、將pre-pgs與丙酮以質(zhì)量體積比1:2無加熱攪拌均勻，pre-pgs總量為8g，丙酮為16ml，混合之后得到總體積為20ml的粘稠狀溶液；2、nacl置于粉碎機中粉碎之后，通過200目和400目的篩網(wǎng)篩得直徑在38～75μm之間的鹽粒；3、將鹽粒與pre-pgs按一定比例混合均勻，裝入注射器針筒中:4、靜置待丙酮稍揮發(fā)之后置于真空烘箱中30℃，24h除去丙酮；5、用針筒嘗試性擠出。1.1.2加熱法1、將裝有pre-pgs的燒杯置于60℃油浴中加熱；2、nacl置于粉碎機中粉碎之后，通過200目和400目的篩網(wǎng)篩得直徑在38～75μm之間的鹽粒；3、將pre-pgs與鹽粒按不同比例混合，裝入注射器針筒中：4、用針筒嘗試性擠出。1.2混合比例用分析天平稱量2gpre-pgs置于燒杯中，60℃油浴加熱。用粉碎機打磨鹽粒，用200目和400目的篩網(wǎng)篩選直徑為38μm～75μm的鹽顆粒，用分析天平稱取2g鹽顆粒，待燒杯中的pre-pgs變?yōu)橥该鞯囊后w時加入，用玻璃棒攪拌均勻制備得到pre-pgs：nacl＝1:1的混合物，裝入10ml的一次性針筒中，備用。為了找到合適的打印比例，設(shè)計一系列比例的混合物進(jìn)行打印，混合物的比例如表1：表1pre-pgs與鹽顆粒的混合比例1:0.51:11:21:3pre-pgs2g2g2g2g鹽顆粒1g2g4g6g2.3d打印pre-pgs支架2.13d打印模型利用autocad2014軟件構(gòu)建模型，構(gòu)建立方體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，邊長為20mm，其微觀網(wǎng)格間隙可以通過打印的路徑和參數(shù)進(jìn)行控制。為體現(xiàn)3d打印個性化可定制的優(yōu)勢，可打印各種復(fù)雜的輪廓結(jié)構(gòu)，在其中選取了雪花圖形進(jìn)行打印。2.23d打印參數(shù)控制打開3d打印機的電源，在進(jìn)行3d打印之前，卸下3d打印機的噴嘴與擠壓桿，清洗干凈，裝上噴嘴和針頭，將pgs與nacl的混合物料裝進(jìn)料筒中，然后裝回擠壓桿。打開1號頭的加熱裝置，設(shè)置擠壓腔溫度與噴嘴溫度，雙擊電腦上的3d打印機軟件，使電腦與3d打印機相連接，選擇3d打印所需的cad模型。然后進(jìn)行參數(shù)設(shè)置，設(shè)置擠壓腔溫度與噴嘴溫度分別都為40℃，45℃，50℃，55℃，60℃，65℃時材料擠出狀態(tài)的變化。選擇20g針頭，層高為0.5，網(wǎng)格填充寬度為1.2mm，x位置為90，y位置為90，輪廓填充次數(shù)為0，角度為90°和0°。點擊xy軸速度填寫相應(yīng)的xy軸運動速度和t軸擠料速度，其中xy軸運動速度為2mm/s，t軸擠料速度為0.006mm/s，保存數(shù)據(jù)點擊“確定”并填充路徑。將x,y位置都調(diào)到90，調(diào)整z軸來調(diào)節(jié)針頭離接收板的高度，然后將打印機的xy軸位置回零，等到溫度上升到指定值并穩(wěn)定之后，即可按auto開始打印。2.3針頭尺寸擠出針頭的型號直接決定了擠出纖維單元的直徑尺寸和支架的精細(xì)度，為了提高打印的精細(xì)度，使用了內(nèi)徑更小的針頭(22g)，來降低纖維單元直徑的大小和纖維單元之間的間隙寬度。但是鹽粒尺寸與針頭大小的匹配性直接決定了打印材料的擠出性能，在鹽粒填充物用量不變的前提下，為了使材料更容易擠出，選用了粒徑更小的鹽粒。選用兩種不同直徑的鹽粒進(jìn)行對比試驗，鹽顆粒直徑為38～75μm和26～38μm和分別用20g和22g針頭進(jìn)行打印。其中以20g針頭和直徑為38～75μm鹽粒作為填充物所打印的支架為pgs500；其中以22g針頭和直徑為26～38μm鹽粒作為填充物所打印的支架為pgs300。兩種針頭參數(shù)對比見表2：表221g與22g針頭參數(shù)對比2.4支架的固化交聯(lián)和析出由于支架原材料為pre-pgs和鹽顆粒，還需進(jìn)行第二步的高溫交聯(lián)才能成為pgs支架。雖然鹽顆粒在打印過程中作為定型劑保持了支架的三維結(jié)構(gòu)，但是隨著溫度的升高，pre-pgs黏度逐步下降，支架的結(jié)構(gòu)不可避免會受到破壞。因此要選擇一個合適的較低溫度，在此溫度下，支架既能在一定時間內(nèi)保持其結(jié)構(gòu)，pre-pgs還能開始發(fā)生交聯(lián)。在pre-pgs發(fā)生一定程度的交聯(lián)之后，確保其在高溫下仍具有保型性之后，再高溫快速固化交聯(lián)。根據(jù)參考文獻(xiàn)的查閱和pgs聚合和固化交聯(lián)的條件，將低溫保型溫度設(shè)置為100℃，支架在100℃的真空烘箱中初步交聯(lián)固化12h，然后轉(zhuǎn)移到150℃的真空烘箱中進(jìn)行進(jìn)一步的固化交聯(lián)。為除去支架中的鹽顆粒和未交聯(lián)的聚合物，在室溫條件下將支架浸漬在無水乙醇與蒸餾水按1:3比例混合的溶液中，每4小時換一次混合液，洗滌3次，冷凍12小時后，置于-20℃，50pa的冷凍干燥機中冷凍干燥得到pgs彈性體支架。3.表征與檢測3.1可打印性的表征采用控制應(yīng)力流變儀測定不同比例的混合物的流變性能，設(shè)計模塊分為兩個部分：第一為保溫階段，保溫溫度為45℃，轉(zhuǎn)速為0，保溫時間為300s；第二階段為轉(zhuǎn)速增加階段，溫度為45℃，轉(zhuǎn)速從0增加到100rpm，時間為600s。設(shè)計每個樣品測試三組數(shù)據(jù)，用origin軟件繪制四個比例樣品的剪切應(yīng)力-剪切速率曲線圖。3.2高溫保形性的測定配制pgs和nacl比例分別為1:0.5,1:1,1:2,1:3的混合物，取長1cm，直徑為0.5cm的柱狀模型，用刮刀將混合物填充入模具中，壓實，每個比例的材料制備兩個樣條，置于-20℃的冰箱中冷凍30min，用棒子推出得到柱狀樣條。置于100℃的真空烘箱中保溫10min，觀察其形狀變化，從而幫助選擇合適的混合比例。3.3形態(tài)結(jié)構(gòu)的表征與測試對支架結(jié)構(gòu)的表征通過sem來檢測，觀察支架的形態(tài)，是否發(fā)生變形，坍塌以及粗細(xì)是否均勻等等從而選擇合適的混合比例和固化溫度，定性表征支架的孔隙分布和整體結(jié)構(gòu)。并且采用imagej軟件對支架的sem圖形進(jìn)行統(tǒng)計，每項測量30～40個數(shù)據(jù)求平均值和方差，結(jié)合origin軟件繪制柱狀圖定量分析支架的纖維單元直徑和孔隙尺寸。3.4孔隙率本實驗采用乙醇密度法測量孔隙率。支架經(jīng)冷凍干燥后于干燥器中恒重24h，分析天平稱量其質(zhì)量m0。將支架放入離心管中，完全浸沒在無水乙醇中12h，測量離心管、乙醇與支架的總質(zhì)量為m1。用鑷子小心地將支架從瓶中取出，取出的支架吸滿乙醇液體又不滴落為準(zhǔn)，支架放置在干凈的培養(yǎng)皿上。用天平稱量剩余乙醇和離心管的總質(zhì)量為m2。pgs密度ρpgs，20℃下無水乙醇密度ρ乙醇。支架的孔隙率計算公式如下：3.5力學(xué)性能測試與表征將四層支架裁成10*5mm的長方形樣條，測試其拉伸斷裂強度和拉伸斷裂伸長率然后在稍低于拉伸斷裂伸長率的條件下，進(jìn)行循環(huán)拉伸測試，測試循環(huán)次數(shù)10次。用16層的支架進(jìn)行循環(huán)壓縮測試，形變程度為40％，分別測試循環(huán)次數(shù)為1次，10次，30次，50次。3.6生物降解性將上述pgs支架裁成5mm*5mm的樣品，稱量初始質(zhì)量。將支架分別放入裝有5ml酯酶溶液的離心管中，置于37℃恒溫孵育箱內(nèi)。分別在10min，30min，1h，2h，3h，5h，7h時將樣本取出，使用蒸餾水潤洗后冷凍干燥至恒重，稱量樣本降解后的質(zhì)量。并將樣本利用sem觀測降解后的支架形態(tài)。4.結(jié)果2.1.1材料的混合方式pre-pgs在常溫下為粘稠狀且黏度較大，隨著混合的鹽比例的增大，混合物的黏度也逐漸增大，很容易產(chǎn)生混合不均勻的問題，因此需要考慮降低混合物的黏度。常用的降低黏度的方法有兩種：溶劑法和加熱法，采用這兩種方法進(jìn)行對比性。實驗表明：采用溶劑法混合，從真空烘箱中取出溶液時，雖然丙酮基本上除去，沒有很大的刺鼻性氣味，但是經(jīng)過12h靜置發(fā)現(xiàn)鹽粒大多數(shù)沉積在底部，與pre-pgs混合不均勻，擠出性能較差。另外還有兩個缺陷是：一、無法保證丙酮完全除去；二、實驗操作過程中丙酮在不斷揮發(fā)，pre-pgs丙酮混合液的體積在不斷變化，無法保證pre-pgs與nacl顆粒的真正比例。采用加熱法混合的材料比較均勻，擠出性比較穩(wěn)定，同時不添加其他的有機溶劑，保證了材料的生物相容性。因此采用加熱法進(jìn)行后續(xù)實驗。2.1.2材料的混合比例鹽顆粒在混合物中起到定型劑和致孔劑的作用，因此鹽粒過少，無法起到定型作用，打印的結(jié)構(gòu)容易發(fā)生坍塌；鹽粒過多，黏度過高，可能會導(dǎo)致打印困難，甚至無法打印。因此，需要探索一個合適的混合比例既能持續(xù)完整地打印，又能保持打印支架的結(jié)構(gòu)，在滿足這兩個條件的基礎(chǔ)上，結(jié)合sem電鏡的觀測，分析支架的整體結(jié)構(gòu)與微觀結(jié)構(gòu)，選擇pre-pgs與鹽顆粒的最合適比例。從sem圖中，可以看出比例為1:0.5樣本在打印溫度為35℃可較為容易的被加熱擠出，但由于加熱溫度與室溫接近，使得冷卻后流動性變化小，成型后易變形，支架中的纖維單元縱橫分布不清，不同層之間彼此粘連到一起。比例為1:1樣本，溫度在45～50℃可被擠出，纖維整體分布清晰，但單根纖維在無支撐的區(qū)域出現(xiàn)一定向下塌陷的現(xiàn)象，受重力作用影響較大。比例為1:2樣本，在溫度為55℃時可順利被擠出，室溫冷卻后成型穩(wěn)定，且纖維單元分布清晰，在重力作用下基本不發(fā)生形變，纖維截面成光滑的圓形，保型性好。比例為1:3樣本，加熱擠出溫度上升至90℃，但存在了擠出不暢的缺陷，纖維被斷續(xù)式擠出，這可能是含鹽量增加導(dǎo)致受熱流動性差所引起的。2.1.33d打印參數(shù)2.1.3.1打印溫度從打印過程來看，隨著打印溫度的升高，材料的流動性越來越好，與此同時打印的支架的保型性越來越差，因此要選擇一個合適的溫度，即在此溫度下，材料既能穩(wěn)定連續(xù)地擠出成均勻的纖維狀，又能在接收板上固定下來并且保持打印時的形狀而不發(fā)生變形。從實驗結(jié)果來看，40～50℃時，材料的流動性能很差，纖維擠出不連續(xù)，同時由于溫度較低，針頭部分沒有加熱，材料容易堵塞在針頭。60～65℃時，材料的流動性能太好，以至于打印過程中會因為壓力的一些細(xì)微變化或者氣泡的破裂等而造成纖維直徑突然變大或纖維斷裂，同時纖維到達(dá)接收板之后溫度沒有及時降低，流動性能較好，受重力影響而使纖維坍塌，整個支架結(jié)構(gòu)發(fā)生變形。在55℃左右時，流動性能較為合適，既能連續(xù)地擠出，同時穩(wěn)定達(dá)到接收板之后，溫度下降流動性能降低，能較穩(wěn)定地維持其纖維形狀與支架結(jié)構(gòu)。因此采用55℃為基準(zhǔn)溫度，隨著打印的過程材料狀態(tài)的變化而進(jìn)行不停的微調(diào)，因為在打印過程中，材料在擠壓腔中受到長時間的擠壓和加熱，狀態(tài)都會發(fā)生一定程度的變化。打印過程中還需主要的一個問題是材料中容易產(chǎn)生氣泡，造成纖維的突然斷裂，因此在開始打印之前，需要進(jìn)行預(yù)加壓，使材料在擠壓腔內(nèi)穩(wěn)定一段時間再開始打印。2.1.3.23d打印軟件參數(shù)噴頭擠出的焦糖纖維直徑除了與針頭的尺寸有關(guān)，還與兩個因素有關(guān)，一是原料擠出速率，二是噴頭移動速率。擠出速率恒定情況下，噴頭移動速率越大，纖維直徑越小；噴頭移動速率恒定情況下，擠料速率越大，纖維直徑越大。因此要固定原料的基礎(chǔ)速率，改變噴頭的移動速率探索兩者比較合適的比例，從實驗結(jié)果來看，當(dāng)t軸擠料速度為0.006mm/s時，噴頭移動速率為2mm/時，纖維的直徑與針頭尺寸較為匹配，這說明t軸擠料速率與噴頭移動速率理想之比約為0.003：1，在此基礎(chǔ)上可以改變這兩者的大小改變打印速度。但這兩者的值不能一直增大，因為一旦噴頭移動速率過大，纖維很難很好地和接收板貼合，同時纖維轉(zhuǎn)折時由于速度過快容易發(fā)生卷翹，支架結(jié)構(gòu)變形。層高與針頭尺寸相關(guān)，20g針頭的內(nèi)徑為0.61，但打印過程中會對纖維產(chǎn)生一定程度的拉伸，而且會受到重力的影響，因此選擇0.5mm作為層高。此外，打印開始時一般設(shè)置針頭離接收板的高度比層高稍小一些，以便材料能穩(wěn)定黏貼在接收板上。2.1.4針頭尺寸在本實驗中，nacl顆粒不僅可作為固化時的力學(xué)支撐相，還可以作為致孔劑，通過水溶去除后形成微孔結(jié)構(gòu)。為了進(jìn)一步控制纖維的微觀結(jié)構(gòu)和精細(xì)化鑄造結(jié)構(gòu)，對鹽粒尺寸和擠出噴嘴尺寸進(jìn)行了調(diào)節(jié)與匹配。a,b分別為pgs500的50倍電鏡圖和1000倍電鏡圖；c,d分別為pgs300的50倍電鏡圖和1000倍電鏡圖原先采用20g的針頭，相對應(yīng)的采用的是粒徑在38μm～75μm的nacl顆粒制得的纖維直徑約為500μm左右(pgs500)，纖維內(nèi)部和表面均勻的分布了大量的微孔結(jié)構(gòu)，孔徑大小與顆粒粒徑相匹配。而采用22g針頭打印擠出時，考慮顆粒在噴頭處的擠出順暢性，選擇了粒徑在26～38μm的nacl顆粒(≤38μm)，獲得了纖維單元直徑為300μm左右的支架(pgs300)，同樣纖維中也均勻分布有大量的微孔，形成多級孔隙結(jié)構(gòu)。但是，相較而言22g針頭制得的pgs支架，纖維直徑更小以致纖維排列更加緊密，精細(xì)度更高，同時鹽顆粒較小使得微孔尺寸更小，整個支架比表面積更大，更有利于作為組織工程支架來使用。2.1.5支架的固化交聯(lián)圖4左邊為未固化的支架，右邊為固化之后的支架，可以明顯看出固化前后支架的整體形狀沒有發(fā)生明顯的變化，并且原來的缺陷在固化之后仍然存在，再次說明支架沒有發(fā)生較大程度的變形。說明設(shè)計的100℃低溫初步交聯(lián)，150℃高溫進(jìn)一步交聯(lián)的實驗方案有效地解決熱塑性3d打印技術(shù)打印熱固性的pgs的難題。2.1.6支架的析出從圖5a,c來看，支架不僅有網(wǎng)格之間的大孔隙，通過鹽顆粒的除去在支架的表面就內(nèi)部都產(chǎn)生大量的孔隙，從而組成支架的多級孔隙，有利于細(xì)胞的繁殖與生長。而通過b,d，可以定量分析得到微孔的尺寸與鹽顆粒的尺寸相匹配，從而證明可以通過混入鹽顆粒的直徑尺寸控制支架微孔的尺寸，這有利于支架在組織工程上面向具體臨床的應(yīng)用。2.2支架結(jié)構(gòu)的表征與檢測2.2.1可打印性的表征可打印性包括可擠出性和初始形態(tài)的穩(wěn)定性。左圖是根據(jù)控制應(yīng)力流變儀測試得到的數(shù)據(jù)繪制剪切應(yīng)力與剪切速率的曲線圖，圖中各個曲線的斜率代表著各個比例的樣品在此剪切速率下的黏度，因此從整條曲線和指定的一個剪切速率來看，都可以得到相同的結(jié)論：隨著混合物中鹽顆粒的比例的增加，材料的黏度在不斷的增加。而在3d熔融型擠出實驗中，隨著鹽顆粒地比例的增大，同樣溫度下，混合物的可擠出性越來越差，而初始形態(tài)的穩(wěn)定性越來越好，這個現(xiàn)象就能用上述的黏度來解釋。綜合來看，前三個比例的樣品都通過打印溫度的調(diào)節(jié)來獲得合適的可打印性，但pre-pgs與nacl比例為1：3的樣品即使在90℃下也難以具有很好的可擠出性。因此從可打印性上來看，1:3比例的混合物不適合3d熔融擠出打印制備pgs彈性體支架。2.2.2高溫保形性的測定從圖7可以看出隨著混合物中nacl顆粒的含量增加，支架的高溫保形性逐漸變好，純pre-pgs，pre-pgs與nacl比例為1：0.5和1:1這三個比例的樣品在100℃低溫交聯(lián)的條件下仍然難以保持其形狀，而pre-pgs與nacl比例為1:2和1:3這兩個比例的樣品則能在一定程度上保持其形狀。因此從高溫保形性上來看，1:2和1:3這兩個比例比較適合，再結(jié)合可打印性，1:2這一比例是最理想的。2.2.3直徑及孔隙尺寸統(tǒng)計從圖8可以定量地看出pgs300與pgs500的直徑尺寸存在顯著差異，纖維內(nèi)部和表面的微孔尺寸與所混入的鹽顆粒的尺寸相匹配。纖維截面的微孔尺寸明顯比纖維表面的大，這是因為纖維表面只能看到微孔的一部分以及表面的鹽粒通常被pgs所覆蓋，導(dǎo)致鹽粒析出之后孔隙的直徑較小或者孔隙不明顯。2.2.4支架孔隙率的檢測三維支架的結(jié)構(gòu)對其在組織工程上的應(yīng)用有至關(guān)重要的作用，如果支架具有較高的孔隙率和良好的貫通性，那么將有利于細(xì)胞的吸附與增殖、營養(yǎng)物質(zhì)和代謝廢物的運輸。本實驗設(shè)計的pgs彈性體支架，通過對3d打印的模型設(shè)計產(chǎn)生的初級輪廓結(jié)構(gòu)、纖維單元直徑和纖維之間的間隙產(chǎn)生的二級大孔結(jié)構(gòu)以及鹽粒作為模板去除后產(chǎn)生的三級微孔結(jié)構(gòu)一起組成支架的多級孔隙，作為細(xì)胞生長所需營養(yǎng)物質(zhì)和代謝廢物輸送的通道。因此pgs彈性體支架的孔隙率是至關(guān)重要的一個參數(shù)。本測試?yán)脤嶒灢糠炙竟綔y定3d打印的pgs彈性體支架的孔隙率。如表3所示，本方法制備的三維中空支架的孔隙率均在66％以上，平均孔隙率為72.96％。表3支架的孔隙率測定m0m1m2孔隙率0.05791.81091.56320.73540.02591.90621.78060.76550.03102.03331.87010.78340.04771.78941.63100.66300.06111.82611.54970.74920.05931.55161.34310.68092.2.5力學(xué)性能測試及表征從力學(xué)性能測試結(jié)果圖9(a)可看出，pgs500支架的拉伸斷裂伸長率在35％左右，斷裂強度為80kpa左右，pgs300支架的拉伸斷裂伸長率在40％左右，斷裂強度為60kpa左右。伸長率為25％的條件下循環(huán)拉伸10次，展示出典型的彈性形變曲線和具有良好的形變恢復(fù)性(c，d)，具備一定的體內(nèi)縫合強度與體內(nèi)動態(tài)力學(xué)環(huán)境的順應(yīng)性。通過循環(huán)壓縮測試可看出這種3d打印的彈性體支架具有較強的耐疲勞性，多次形變恢復(fù)的曲線基本重合，仍保持初始良好的彈性(b)，具備在體內(nèi)受到應(yīng)力壓縮而能夠及時恢復(fù)，可與組織保持良好的匹配性。對pgs500和pgs300的循環(huán)壓縮曲線分析可知，pgs300的壓縮強度比pgs500稍大，這與pgs300的纖維單元排列更加質(zhì)密有關(guān)。這兩種支架在形變程度50％以內(nèi)都保持的是彈性形變，即壓縮曲線與釋放恢復(fù)曲線重合，但在超過50％之后，曲線不發(fā)生重合，恢復(fù)過程的力學(xué)曲線要高于壓縮過程，呈現(xiàn)出“力學(xué)增強”的現(xiàn)象(b)。對于這種現(xiàn)象，可能是壓縮形變程度過大時(大于50％)時，整體變得扁平化，受力面積增大所致。2.2.6生物降解性從圖10降解曲線可以看出3d打印的pgs支架具有良好的生物降解性，初期降解較快，后續(xù)降解基本平衡，5小時后降解率可達(dá)90％以上。從降解后樣本的電鏡圖可以看出，支架的降解是從表面向內(nèi)部逐步發(fā)生刻蝕化降解，表面的微孔結(jié)構(gòu)尺寸逐步變大。實施例2制備pclu支架，方法同實施例1。使用聚己內(nèi)酯二醇、hdi三聚體為原料，與鹽顆?；旌洗蛴『蠊袒尚?，省去預(yù)聚物合成步驟，讓原料單元在3d成型的結(jié)構(gòu)上在加熱條件下反應(yīng)固化。如圖11所示，這種方法也可滿足于pclu的打印成型，可制備生物支架和其他不規(guī)則形狀，這種熱固性的pclu也是一種彈性體，經(jīng)過反復(fù)的折疊仍可快速的恢復(fù)(a-d)。對支架進(jìn)行電鏡測試，其纖維單元清晰規(guī)則排列和堆疊，纖維截面呈圓形，未見明顯的纖維塌陷現(xiàn)象，具有良好的固化保型性，同時纖維表面和內(nèi)部分布有大量的微孔，支架整體呈多級別的孔隙結(jié)構(gòu)(e-l)。對pclu支架的力學(xué)測試結(jié)果如圖12所示：其拉伸斷裂強度為386kpa左右，斷裂伸長率為80％，優(yōu)于pgs支架。在10個周期循環(huán)拉伸測試和50個周期的循環(huán)壓縮測試中加載和釋放的曲線擬合程度高，展現(xiàn)出了優(yōu)異的彈性和形變恢復(fù)性；同時多次循環(huán)之后力學(xué)特征曲線基本不發(fā)生變化，具有很好的耐疲勞性。對于這種pclu彈性體，由于原料采用的是聚己內(nèi)酯二元醇這種可降解單元，預(yù)期其具備生物降解性。另外，對于原料中具有的潛在生物毒性的nco基團(tuán)，通過紅外光譜測定分析后可判斷已經(jīng)反應(yīng)完全而不存在，類似于其他醫(yī)用聚氨酯材料而具備良好的生物相容性。當(dāng)前第1頁12