本發(fā)明屬于天然藥物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及魯斯可皂苷元異構(gòu)體在治療癌癥及治療急性肺損傷方面的用途。

背景技術(shù)：

魯斯可皂苷元(ruscogenin，rus)，是中藥麥冬中的主要皂苷元和有效成分之一，又名假葉樹苷元。具有顯著的抗炎、抗血栓、抗腫瘤、降低毛細(xì)血管通透性等作用。

前期研究發(fā)現(xiàn)，魯斯可皂苷元異構(gòu)體混合物對多種腫瘤細(xì)胞具有殺傷作用并能顯著減輕脂多糖(lps)誘導(dǎo)的急性肺損傷(ali)，且藥理活性顯著。由于甾體皂苷/皂苷元c-25位的異構(gòu)現(xiàn)象，魯斯可皂苷元存在兩種異構(gòu)體即(25s)-ruscogenin(式ⅰ)和(25r)-ruscogenin(式ⅱ)。

天然來源的魯斯可皂苷元多是25r/s兩種差向異構(gòu)體混合物，且不同產(chǎn)地或不同時期植物源的魯斯可皂苷元其異構(gòu)體的比例也會不同。上述研究的藥理活性均為使用25r/s魯斯可皂苷元的混合物所得，而現(xiàn)代研究表明不同異構(gòu)體其藥理活性可能存在不一致的現(xiàn)象，所以研究并比較魯斯可皂苷元異構(gòu)體的藥理活性差異成為必要。

參考文獻(xiàn)：

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技術(shù)實現(xiàn)要素：

解決的技術(shù)問題：本發(fā)明的目的是提供魯斯可皂苷元異構(gòu)體在制備藥物中的應(yīng)用，包括(25s)-ruscogenin用于制備治療癌癥藥物中的應(yīng)用和(25r)-ruscogenin用于制備治療急性肺損傷藥物中的應(yīng)用。

技術(shù)方案：

魯斯可皂苷元異構(gòu)體(25s)-ruscogenin在制備治療癌癥藥物中的應(yīng)用。

魯斯可皂苷元異構(gòu)體(25s)-ruscogenin在制備治療乳腺癌藥物中的應(yīng)用。

魯斯可皂苷元異構(gòu)體(25s)-ruscogenin在制備治療肺癌藥物中的應(yīng)用。

魯斯可皂苷元異構(gòu)體(25s)-ruscogenin在制備治療肝癌藥物中的應(yīng)用。

魯斯可皂苷元異構(gòu)體(25s)-ruscogenin在制備治療宮頸癌藥物中的應(yīng)用。

魯斯可皂苷元異構(gòu)體(25r)-ruscogenin在制備治療/預(yù)防急性肺損傷藥物中的應(yīng)用。

所述的急性肺損傷為非心源性的多種內(nèi)外致病因素如吸入有害氣體、嚴(yán)重感染、創(chuàng)傷、中毒、休克等導(dǎo)致的急性、進(jìn)行性、缺氧性呼吸功能不全或衰退，嚴(yán)重者引起急性呼吸窘迫綜合征。

有益效果：本發(fā)明公開了魯斯可皂苷元異構(gòu)體的不同藥物用途，(25s)-ruscogenin可用于制備治療癌癥藥物，(25r)-ruscogenin可用于制備治療/預(yù)防急性肺損傷藥物。

附圖說明

圖1為實施例2中魯斯可皂苷元異構(gòu)體對lps致ali模型小鼠肺組織形態(tài)學(xué)切片圖，a為空白組，b為模型組，c為(25s)-rus給藥組，d為(25r)-rus給藥組；

圖2為實施例2中魯斯可皂苷元異構(gòu)體對lps致ali模型小鼠肺組織干濕比的影響，##表示與空白組相比p<0.01，**表示與模型組相比p<0.01，&表示25(s)rus與25(r)rus相比p<0.05；

圖3為實施例2中魯斯可皂苷元異構(gòu)體對lps致ali模型小鼠肺泡灌洗液(balf)中蛋白含量，細(xì)胞數(shù)和mpo含量的影響，a為肺泡灌洗液中蛋白含量，b為肺泡灌洗液中細(xì)胞數(shù)量，c為肺泡灌洗液中mpo含量，d為肺組織中mpo含量，##表示與空白組相比p<0.01，#表示與空白組相比p<0.05，**表示與模型組相比p<0.01，*表示與模型組相比p<0.05，&表示25(s)rus與25(r)rus相比p<0.05，&&表示25(s)rus與25(r)rus相比p<0.01；

圖4為實施例3中魯斯可皂苷元異構(gòu)體對正常huvec細(xì)胞活力的影響，*表示與空白組相比p<0.05，**表示與空白組相比p<0.01；

圖5為實施例3中魯斯可皂苷元異構(gòu)體對lps損傷huvec細(xì)胞通透性的影響，a為(25r)-rus對lps損傷huvec細(xì)胞通透性的影響，b為(25s)-rus對lps損傷huvec細(xì)胞通透性的影響，c為(25r/s)-rus混合物對lps損傷huvec細(xì)胞通透性的影響，d為不同構(gòu)型魯斯可皂苷元對lps誘導(dǎo)huvec細(xì)胞通透性改善程度匯總圖，##表示與空白組相比p<0.01，**表示與模型組相比p<0.01；

圖6為實施例3中魯斯可皂苷元異構(gòu)體對lps損傷huvec細(xì)胞跨內(nèi)皮電阻的影響，a為(25r)-rus:(25s)-rus＝1:0時對lps損傷huvec細(xì)胞跨內(nèi)皮電阻的影響，b為(25r)-rus:(25s)-rus＝0.8:0.2時對lps損傷huvec細(xì)胞跨內(nèi)皮電阻的影響，c為(25r)-rus:(25s)-rus＝0.6:0.4時對lps損傷huvec細(xì)胞跨內(nèi)皮電阻的影響，d為(25r)-rus:(25s)-rus＝0.4:0.6時對lps損傷huvec細(xì)胞跨內(nèi)皮電阻的影響，e為(25r)-rus:(25s)-rus＝0.2:0.8時對lps損傷huvec細(xì)胞跨內(nèi)皮電阻的影響，f為(25r)-rus:(25s)-rus＝0:1時對lps損傷huvec細(xì)胞跨內(nèi)皮電阻的影響，##表示與空白組相比p<0.01，**表示與模型組相比p<0.01。

具體實施方式

下面將結(jié)合本發(fā)明實施例，對本發(fā)明實施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述。顯然，所描述的實施例僅為本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例?；诒景l(fā)明中的實施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。

為了進(jìn)一步理解本發(fā)明，下面結(jié)合實施例對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)闡述，其中，如無特殊說明，實施例中涉及的各種反應(yīng)試劑均可以通過商業(yè)渠道購買得到。

本發(fā)明所述的魯斯可皂苷元兩種異構(gòu)體(25s)-ruscogenin和(25r)-ruscogenin可以從天然產(chǎn)物中分離得到，或通過進(jìn)一步的化學(xué)合成、結(jié)構(gòu)修飾及生物轉(zhuǎn)化所得。

兩種異構(gòu)體可以從百合科植物短葶山麥冬(liriopemuscari(decne.)baily)、湖北麥冬(liriopespicata(thunb.)lour.var.proliferay.t.ma)、禾葉山麥冬(liriopegraminifolia(linn.)baker)、麥冬(ophiopogonjaponicus(l.f)kergawl.)等植物和天門冬科假葉樹屬植物假葉樹(ruscusaculeatus)等植物中分離得到。具體制備方法如下：

短葶山麥冬(liriopemuscari(decne.)baily)藥材5kg粉碎，40l75％乙醇熱回流提取三次，每次2h，合并提取液，濃縮得浸膏，乙酸乙酯萃取，合并萃取液，經(jīng)硅膠柱石油醚：乙酸乙酯，氯仿：甲醇交替梯度洗脫，反復(fù)柱層析可得兩種異構(gòu)體混合物?；旌衔锝?jīng)watersxbridgec-18制備液相色譜柱以70％甲醇制備得到兩種異構(gòu)體，經(jīng)高效液相檢測，兩種異構(gòu)體純度均為98％以上。

實施例1

魯斯可皂苷元異構(gòu)體的抑瘤作用

實驗方法：

a)腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)

mda-mb-435、hepg2、hela及a549腫瘤細(xì)胞株以含10％胎牛血清的dmem培養(yǎng)基培養(yǎng)，95d和mcf-7細(xì)胞含10％胎牛血清的rpmi1640培養(yǎng)基在37℃、5％co2條件下培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到8×10⁵個/ml時，進(jìn)行傳代培養(yǎng)(離心法)，即以1000rpm、離心5分鐘，棄掉上清，以新鮮的10％dmem培養(yǎng)基或rpmi1640培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，以2×10⁵個/ml的密度傳代接種。

b)實驗藥物的配制

稱取適量各魯斯可皂苷元異構(gòu)體分別溶解于dmso中，使之濃度為100mm，儲存液4℃保存。

實驗之前，將儲存液用無血清的dmem高糖培養(yǎng)基或rpmi1640培養(yǎng)基稀釋，使藥物濃度為100μm，并且保證dmso的最終濃度低于1‰。加入不同體積的無血清的培養(yǎng)基稀釋成不同濃度，同時用含有1‰dmso的無血清的dmem或rpmi1640培養(yǎng)基作為陰性對照。

c)mtt法檢測細(xì)胞活力

將各腫瘤細(xì)胞株分別以含10％胎牛血清的dmem培養(yǎng)基培養(yǎng)和rpmi1640培養(yǎng)基懸浮，以1×10⁶cell/ml的細(xì)胞密度接種96孔培養(yǎng)板(150μl/孔)，37℃、5％co2培養(yǎng)24小時。在腫瘤細(xì)胞株的對數(shù)生長期，加入不同濃度的藥物，37℃、5％co2培養(yǎng)48小時。藥物作用48小時后棄去原培養(yǎng)液，按照終濃度0.5mg/ml加入mtt在培養(yǎng)箱中孵育3小時后去除mtt溶液，加入150μldmso，振蕩器震蕩10分鐘使結(jié)晶溶解，酶標(biāo)儀570nm，650nm雙波長檢測。利用ic50計算軟件，計算藥物的ic50(半數(shù)抑制濃度)。

實驗結(jié)果：

表1魯斯可皂苷元異構(gòu)體對人腫瘤細(xì)胞的抑制作用(ic50值)

na:noactivity(ic50>50μm)

上述實驗結(jié)果表明：(25s)-ruscogenin對各腫瘤細(xì)胞均具有一定的抑制作用，具有較好的量效關(guān)系，而(25r)-ruscogenin對各腫瘤細(xì)胞均無抑制作用。

實施例2

魯斯可皂苷元異構(gòu)體對lps誘導(dǎo)ali小鼠肺血管內(nèi)皮屏障損傷的藥效研究

實驗方法：雄性c57小鼠共24只，隨機(jī)分為4組，分別是：空白組(生理鹽水n.s.)、模型組(lps,5mg/kg)、(25s)-ruscogenin組(1mg/kg)和(25r)-ruscogenin組(1mg/kg)。灌胃給藥，1h后氣管滴注lps復(fù)制ali小鼠模型，6h后處死小鼠。取左肺精確測定肺濕重后將肺組織置于120℃的烘箱烘干24h得肺干重，計算肺干濕比來確定肺組織水腫程度。

對魯斯可皂苷元異構(gòu)體對lps致ali模型小鼠肺組織形態(tài)學(xué)進(jìn)行切片觀察，如圖1所示，(25r)-ruscogenin能明顯減輕血管周圍水腫，但(25s)-ruscogenin不能。

對魯斯可皂苷元異構(gòu)體對lps致ali模型小鼠肺組織干濕比進(jìn)行計算，統(tǒng)計結(jié)果如圖2所示，(25r)-ruscogenin干預(yù)能有顯著的改善lps誘導(dǎo)的小鼠肺干濕比增加，(25s)-ruscogenin干預(yù)效果不明顯。

對魯斯可皂苷元異構(gòu)體對lps致ali模型小鼠肺泡灌洗液(balf)中蛋白含量和細(xì)胞數(shù)進(jìn)行計算，統(tǒng)計結(jié)果如圖3所示，(25r)-ruscogenin能顯著改善lps誘導(dǎo)的小鼠肺泡灌洗液中蛋白含量和細(xì)胞數(shù)的升高，但(25s)-ruscogenin的改善效果不明顯。

實施例3

(25r/s)-ruscogenin對lps誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮(huvec)細(xì)胞屏障損傷的藥效研究

實驗方法：huvec細(xì)胞在培養(yǎng)瓶中生長至融合狀態(tài)，采用胰蛋白酶溶液消化，并反復(fù)吹打至細(xì)胞懸液，以含10％fbs的1640培養(yǎng)基稀釋成5×10⁵個/ml，每孔100μl接種于96孔培養(yǎng)板中，在37℃、5％co2條件下培養(yǎng)24h，成融合狀態(tài)，于實驗前換無血清培養(yǎng)基同步化培養(yǎng)1h。分為六組，每組五個復(fù)孔，分別向各組加入終濃度為0、1、10、20、30、40μmol/l不同比例(25r/s)-ruscogenin混合物，作用48h后mtt法檢測藥物對正常huvec細(xì)胞毒作用。

mtt法測定細(xì)胞活力：各組細(xì)胞棄去培養(yǎng)基，pbs洗兩次，每組加入0.5mg/mlmtt，37℃、5％co2條件下孵育3h，除去mtt工作液，每孔加入150μldmso溶解結(jié)晶，振搖10min，測定每孔的od值(測定波長570nm，參比波長650nm)。

細(xì)胞接入millicell懸掛式培養(yǎng)小室，細(xì)胞培養(yǎng)7天后進(jìn)行實驗。預(yù)先加入不同濃度的魯斯可皂苷元，1h后加入終濃度為5μg/mllps刺激細(xì)胞，刺激2天，實驗結(jié)束前1h在小室內(nèi)加入伊文思藍(lán)白蛋白溶液50μl作為示蹤劑，外室加入150μl4％bsa溶液，結(jié)束后收集外室液體，200μl加入96孔板，酶標(biāo)儀620nm下測定吸光度，計算各組伊文思藍(lán)透過率。

細(xì)胞通透性保護(hù)率％＝(給藥組—模型組)/(空白組—模型組)×100％

將細(xì)胞200μl(50000個/孔)接入millicell懸掛式培養(yǎng)小室(0.4μm)內(nèi)，外室24孔板中加入1ml完全培養(yǎng)基，放入co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天換液。在種植細(xì)胞2h貼壁后測定電阻值，以后每天固定時間點測定電阻值一次，連續(xù)測定九天。電阻穩(wěn)定后根據(jù)實驗設(shè)計處理細(xì)胞，加入預(yù)先加入不同濃度的魯斯可皂苷元作用1小時后加入終濃度為5μg/mllps刺激細(xì)胞，刺激2天，測量teer值。

單位面積電阻＝(樣品孔電阻-空白孔電阻)×有效膜面積

測定魯斯可皂苷元對正常huvec細(xì)胞活力的影響，結(jié)果如圖4所示，(25r/s)-ruscogenin不同比例混合物，隨著(25s)-ruscogenin含量增加，藥物對正常huvec細(xì)胞的ic50值不斷降低(如表2)，(25s)-ruscogenin細(xì)胞毒作用較(25r)-ruscogenin明顯。

表2魯斯可皂苷元異構(gòu)體對正常huvec細(xì)胞的抑制作用(ic50值)

測定魯斯可皂苷元對lps損傷huvec細(xì)胞通透性的影響，結(jié)果如圖5所示，(25r)-ruscogenin能顯著改善lps損傷導(dǎo)致的蛋白滲透率，但(25s)-ruscogenin無改善作用。

測定(25r/s)-ruscogenin對lps損傷huvec細(xì)胞跨內(nèi)皮電阻的影響，結(jié)果如圖6所示，不同比例(25r/s)-ruscogenin混合物預(yù)先給藥后，隨著(25r)-ruscogenin含量的增加huvecs細(xì)胞通透性不斷降低，表明對降低細(xì)胞間通透性起主要作用的為(25r)-ruscogenin。

由以上結(jié)果可知，在lps不影響細(xì)胞活力的情況下，(25r/s)-ruscogenin混合物中，隨著(25r)-ruscogenin比例增加，細(xì)胞的通透性不斷降低，提示穩(wěn)定huvec單層細(xì)胞屏障功能的主要為(25r)-ruscogenin。(25r)-ruscogenin在改善小鼠氣管滴注lps誘導(dǎo)的ali方面相較于(25s)-ruscogenin更低毒高效，因此(25r)-ruscogenin具備成為防治ali前體藥物的潛能。