本發(fā)明屬于農(nóng)產(chǎn)品殺菌方法，具體地涉及一種用于獼猴桃花粉采后殺滅潰瘍病致病菌psa的方法，尤其適用于感染psa獼猴桃花粉的采后殺菌。

背景技術(shù)：

由于近年來(lái)世界各國(guó)獼猴桃產(chǎn)業(yè)飛速發(fā)展，隨著規(guī)模的飛速上升和農(nóng)村、農(nóng)業(yè)勞動(dòng)力缺乏矛盾的日益凸顯，使用獼猴桃商品花粉的趨勢(shì)已成必然。

獼猴桃花粉大多產(chǎn)自人工種植雄株，而獼猴桃潰瘍病的傳播性和潛伏性極強(qiáng)，雄株難以避免感染獼猴桃潰瘍病致病菌—丁香假單胞桿菌(pseudomonassyingaepv.actinidiae,psa)。雖有部分采自自然野花，但在加工過(guò)程中也存在交叉污染問(wèn)題。因此，商品花粉導(dǎo)致獼猴桃潰瘍病的快速、大面積、跨區(qū)域傳播可能性極大^[1]。

獼猴桃潰瘍病是一種低溫、高濕性病害，是一種嚴(yán)重威脅獼猴桃生產(chǎn)的毀滅性細(xì)菌性病害^[2]，該病1973年于新西蘭首次報(bào)道，1980年在美國(guó)加利福尼亞和日本靜岡縣發(fā)現(xiàn)，隨后迅速傳播到全球各大獼猴桃產(chǎn)區(qū)。我國(guó)1988年在湖南省石門縣東山峰林場(chǎng)首次報(bào)道人工栽培獼猴桃爆發(fā)獼猴桃潰瘍病^[3]，目前隨著我國(guó)獼猴桃人工栽培規(guī)模不斷擴(kuò)大，獼猴桃潰瘍病病情也日趨嚴(yán)重，已被列為全國(guó)森林植物檢疫對(duì)象^[4]。而商品花粉存在跨區(qū)域、大面積傳播psa的隱患。因此，開(kāi)發(fā)出一種能有效殺滅獼猴桃花粉所攜帶潰瘍病致病菌(psa)，保持其活性確保生產(chǎn)的方法。對(duì)于確保獼猴桃產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展意義重大。

傳統(tǒng)的物理滅菌和化學(xué)滅菌方法由于其殺滅致病菌的同時(shí)，難以保持花粉活力故不適用于花粉滅菌。

輻照技術(shù)(微波、超聲波、射線)已廣泛用于殺滅醫(yī)療保健用品、動(dòng)物飼料、食品、藥品和農(nóng)產(chǎn)品中各種微生物，提高衛(wèi)生質(zhì)量、延長(zhǎng)保質(zhì)期^[5]。殺菌輻照技術(shù)中，微波輻照產(chǎn)生大量熱，只適用于對(duì)溫度不敏感的物品；紫外輻照穿透力較弱，適用于表面殺菌；而γ射線輻照，射線穿透力強(qiáng)，能有效殺滅腐敗性微生物及致病菌，可在不破壞外包裝同時(shí)滅菌，避免了二次污染，并且輻照滅菌在常溫下進(jìn)行，不產(chǎn)生熱效應(yīng)，不改變加工物質(zhì)的溫度(又稱為冷加工)，尤其對(duì)熱敏物品是最佳的滅菌方法^[5][6]。大量研究表明，在適宜的輻照劑量下，農(nóng)作物中的蛋白質(zhì)、脂類和碳水化合物在輻照過(guò)程中只發(fā)生微小的變化^[7,8]。

本發(fā)明通過(guò)對(duì)比加熱滅菌、紫外輻照滅菌、微波滅菌、單一超聲輻照滅菌以及單一⁶⁰co-γ射線輻照滅菌參照文獻(xiàn)報(bào)道花粉萌發(fā)法^[10]和pcr法^[1]檢定花粉，發(fā)現(xiàn)：先將樣品經(jīng)超聲波輻照后，再經(jīng)⁶⁰co-γ射線輻照，可有效降低⁶⁰co-γ射線輻照劑量，徹底殺滅psa，并保持花粉活力。

參考文獻(xiàn)

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技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種用于獼猴桃花粉采后殺滅潰瘍病致病菌psa的方法，該方法先將樣品經(jīng)超聲波輻照后，再經(jīng)⁶⁰co-γ射線輻照，可有效降低⁶⁰co-γ射線輻照劑量，徹底殺滅psa，并保持花粉活力。該方法成本低、效果好，且可操作性高，且未見(jiàn)過(guò)此類技術(shù)在植物花粉采后滅菌?；铑I(lǐng)域應(yīng)用。

本發(fā)明目的及解決的主要技術(shù)問(wèn)題是采用以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的：一種用于獼猴桃花粉采后殺滅潰瘍病致病菌psa的方法，包括以下步驟：

1)將采后獼猴桃花粉分裝、密閉于塑料瓶中，置于超聲波清洗器內(nèi)，冰水浴，超聲波輻射功率為30～60w，輻射處理時(shí)間3～15分鐘；

2)將超聲波處理完畢的花粉，立即送入⁶⁰co-γ射線輻照倉(cāng)輻照，輻照劑量為400～1000gry，溫度為：25±5℃；

3)將經(jīng)過(guò)輻照后花粉放置于-20℃儲(chǔ)藏；

4)授粉前將花粉取出，置于室溫3小時(shí)；

5)將花粉與石松子粉按照質(zhì)量比1:1～1:0.4比例充分混合后對(duì)雌花授粉。

所述步驟1)超聲波輻射環(huán)境為：花粉密閉于塑料瓶?jī)?nèi)，沉浸在冰水混合物中，溫度為0～3℃，進(jìn)行超聲輻射處理。

所述步驟1)的塑料瓶高度為3cm，厚度為3mm。

最后采用pcr測(cè)定滅菌后獼猴桃花粉是否psa陽(yáng)性，花粉萌發(fā)測(cè)定法測(cè)定滅菌后花粉活力。

本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有明顯的優(yōu)點(diǎn)和優(yōu)異效果。由以上技術(shù)方案可知，本發(fā)明將獼猴桃花粉采收、富集和低溫冷凍，授粉前取出后控制在一定溫度下，將花粉分裝于塑料瓶?jī)?nèi)，先使用超聲波輻照，然后再經(jīng)一定劑量⁶⁰co-γ射線進(jìn)行輻照，以達(dá)到殺滅獼猴桃花粉所帶psa的目的。輻照滅菌后花粉按照質(zhì)量比與石松子粉進(jìn)行充分混合后對(duì)雌花進(jìn)行授粉。在合理工藝條件下，相對(duì)于未經(jīng)處理花粉，輻照處理樣品花粉活力降低。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合實(shí)驗(yàn)和較佳實(shí)施例，對(duì)依據(jù)本發(fā)明提出的一種用于獼猴桃花粉采后殺滅潰瘍病致病菌psa的方法具體實(shí)施方式、特征及其功效，詳細(xì)說(shuō)明如后。

獼猴桃商品花粉在大規(guī)模生產(chǎn)過(guò)程中難以避免psa的侵染。為了杜絕商品花粉在使用過(guò)程中大面積、跨區(qū)域使用時(shí)傳播psa的隱患，本發(fā)明首先對(duì)比了加熱滅菌、超聲波、微波和⁶⁰co-γ射線輻照四種方式對(duì)獼猴桃花粉進(jìn)行處理(詳見(jiàn)表1)，結(jié)果表明，超聲波存在滅菌不徹底，推測(cè)原因?yàn)榇┩改芰^弱；微波雖能短時(shí)間滅菌，但對(duì)花粉活力殺滅能力極強(qiáng)，推測(cè)為熱效應(yīng)原因；⁶⁰co-γ射線輻照效果雖十分明顯，但也存在大劑量輻照導(dǎo)致花粉活力劇減弊端，推測(cè)原因?yàn)榇┩改芰?qiáng)，能量大，難以把控。通過(guò)大量對(duì)照試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：先將樣品經(jīng)超聲波輻照后，再經(jīng)⁶⁰co-γ射線輻照，在達(dá)到滅菌效果的前提下，可有效降低⁶⁰co-γ射線輻照劑量。

表1不同滅菌技術(shù)對(duì)獼猴桃花粉psa殺滅及活粉活力影響表(n＝3)

注：實(shí)驗(yàn)規(guī)模：花粉50g/次，花粉滅菌前活力：47.9％。

本發(fā)明在系統(tǒng)對(duì)比加熱滅菌、單一超聲波、微波和⁶⁰co-γ射線輻照滅菌效果后，以滅菌能力和花粉活力為滅菌工藝可行性指標(biāo)，篩選出超聲波處理聯(lián)合⁶⁰co-γ射線輻照滅菌技術(shù)，其效果極為明顯，即可達(dá)到有效殺滅psa效果，又可最大限度抑制花粉活力的降低。所得工藝的可規(guī)模操作性強(qiáng)，且可將染獼猴桃花粉感染的psa徹底殺滅，花粉活力降低≦40％。

一種用于獼猴桃花粉采后殺滅潰瘍病致病菌psa的方法，包括以下步驟：

1)將采后獼猴桃花粉分裝、密閉于塑料瓶中，置于超聲波清洗器內(nèi)，冰水浴，超聲波輻射功率為30～60w，輻射處理時(shí)間3～15分鐘；

2)將超聲波處理完畢的花粉，立即送入⁶⁰co-γ射線輻照倉(cāng)輻照，輻照劑量為400～1000gry，溫度為：25±5℃；

3)將經(jīng)過(guò)輻照后花粉放置于-20℃儲(chǔ)藏；

4)授粉前將花粉取出，置于室溫3小時(shí)；

5)將花粉與石松子粉按照質(zhì)量比1:1～1:0.4比例充分混合后對(duì)雌花授粉。

所述步驟1)超聲波輻射環(huán)境為：花粉密閉于塑料瓶?jī)?nèi)，沉浸在冰水混合物中，溫度為0～3℃，進(jìn)行超聲輻射處理。

所述步驟1)的塑料瓶高度為3cm，厚度為3mm。

最后采用pcr測(cè)定滅菌后獼猴桃花粉是否psa陽(yáng)性，花粉萌發(fā)測(cè)定法測(cè)定滅菌后花粉活力。

實(shí)施例1(花粉樣品一)：

1)將采后獼猴桃花粉分裝、密閉于高度為3cm，厚度為3mm的塑料瓶，10g/瓶，共計(jì)200瓶，置于超聲波清洗器內(nèi)，冰水浴，功率為30w，處理15分鐘；

2)將超聲波處理完畢的花粉，立即送入⁶⁰co-γ射線輻照倉(cāng)輻照，輻照劑量為1000gry，溫度為25℃；

3)將經(jīng)過(guò)輻照后花粉放置于-20℃儲(chǔ)藏；

4)授粉前將花粉取出，置于室溫3小時(shí)；

5)將花粉與石松子粉按照質(zhì)量比1:0.4比例充分混合后對(duì)50株獼猴桃樹(shù)上的13,881朵雌花進(jìn)行授粉；

6)通過(guò)花粉萌發(fā)法測(cè)定花粉活力，對(duì)照花粉樣品活力為43.7％，輻照花粉樣品活力為19.8％，psa檢測(cè)為陰性。

7)授粉20天后觀察，座果率為92.3％。

實(shí)施例2(花粉樣品二)：

1)將采后獼猴桃花粉分裝、密閉于高度為3cm，厚度為3mm的塑料瓶，10g/瓶，共計(jì)200瓶，置于超聲波清洗器內(nèi)，冰水浴，功率為40w，處理10分鐘；

2)將超聲波處理完畢的花粉，立即送入⁶⁰co-γ射線輻照倉(cāng)輻照，輻照劑量為600gry，溫度為28℃；

3)將經(jīng)過(guò)輻照后花粉放置于-20℃儲(chǔ)藏；

4)授粉前將花粉取出，置于室溫3小時(shí)；

5)將花粉與石松子粉按照質(zhì)量比1:0.7比例充分混合后對(duì)50株獼猴桃樹(shù)上的12,734朵雌花進(jìn)行授粉；

6)通過(guò)花粉萌發(fā)法測(cè)定花粉活力，對(duì)照花粉樣品活力為57.2％，輻照樣品活力為27.3％，psa檢測(cè)為陰性。

7)授粉20天后觀察，座果率為94.6％。

實(shí)施例3(花粉樣品三)：

1)將采后獼猴桃花粉分裝、密閉于高度為3cm，厚度為3mm的塑料瓶中，10g/瓶，共計(jì)200瓶，置于超聲波清洗器內(nèi)，冰水浴，功率為60w，處理3分鐘；

2)將超聲波處理完畢的花粉，立即送入⁶⁰co-γ射線輻照倉(cāng)輻照，輻照劑量為400gry，溫度為20℃；

3)將經(jīng)過(guò)輻照后花粉放置于-20℃儲(chǔ)藏；

4)授粉前將花粉取出，置于室溫3小時(shí)；

5)將花粉與石松子粉按照質(zhì)量比1:0.7比例充分混合后對(duì)50株獼猴桃樹(shù)上的14,121朵雌花進(jìn)行授粉；

6)通過(guò)花粉萌發(fā)法測(cè)定花粉活力，對(duì)照花粉樣品活力為47.9％，輻照花粉樣品活力為39.4％，psa檢測(cè)為陰性。

7)授粉20天后觀察，座果率為96.3％。

目前，用于獼猴桃花粉保活、殺psa的相關(guān)技術(shù)未見(jiàn)報(bào)道。

以上所述，僅是本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并非對(duì)發(fā)明型作任何形式上的限制，任何未脫離本發(fā)明技術(shù)方案內(nèi)容，依據(jù)本發(fā)明的技術(shù)實(shí)質(zhì)對(duì)以上實(shí)施例所作的任何簡(jiǎn)單修改、等同變化與修飾，均仍屬于本發(fā)明技術(shù)方案的范圍內(nèi)。