一種小牛血清去蛋白注射液及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種小牛血清去蛋白注射液及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 小牛血清中含有很多生物活性物質(zhì)，對(duì)缺血缺氧性疾病具有治療作用。將小牛 血清經(jīng)過(guò)去除大分子物質(zhì)而得到的小分子混合物在臨床上用于疾病的治療已經(jīng)有多年的 歷史了，目前仍然是臨床常用藥物之一；而且對(duì)于該領(lǐng)域的研宄也從未間斷。本品為混 合物，其作用機(jī)制甚為復(fù)雜，現(xiàn)有的研宄結(jié)果證明其中的小分子多肽和多糖以及某些小分 子生物素都具有生物活性。有研宄表明，其中的活性小分子多肽為2肽到9肽，分子量為 300D-1000D(虞維俊，小牛血及血清去蛋白提取物注射液的質(zhì)量控制方法研宄，碩士學(xué)位論 文）；亦有研宄表明，多肽含量不同的產(chǎn)品，其生物活性亦有差別（任淑萍，小牛血清去蛋白 注射液與小牛血去蛋白注射液有效成分含量和生物活性的比較；中華神經(jīng)醫(yī)學(xué)雜志2006 年8月第5卷第8期，767-769)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明的目的是提供一種小牛血清去蛋白注射液及其制備方法，該小牛血清去蛋 白注射液富含小分子多肽的，具有更高的生物活性和穩(wěn)定性。
[0004] 本發(fā)明所提供的小牛血清去蛋白注射液的制備方法，包括如下步驟：
[0005] 1)向小牛血清中加入活性炭，進(jìn)行活性炭吸附，以除去小牛血清中的小分子有害 物質(zhì)（例如：組胺、尿酸、肌酐等），得到除雜后的混合液；
[0006] 2)將所述混合液和乙醇混合進(jìn)行醇沉除雜，收集回收液；
[0007] 3)將所述回收液和復(fù)合蛋白酶混合進(jìn)行酶解，得到酶解液；
[0008] 4)將所述酶解液和氧化劑混合進(jìn)行氧化反應(yīng)，即可得到所述小牛血清去蛋白注射 液。
[0009] 上述制備方法中，步驟1)中，所述小牛血清為出生1-6個(gè)月的新生小牛采血分離 得到的。
[0010] 所述活性炭的加入量為所述小牛血清質(zhì)量的1. 8% -2. 2%，優(yōu)選為2%。
[0011] 所述活性炭吸附的時(shí)間為20-30min，優(yōu)選為20min。
[0012] 上述制備方法中，步驟2)中，所述混合液和所述乙醇的體積比為I :(3. 4-3.6)，優(yōu) 選為I :3. 5。
[0013] 所述醇沉除雜的時(shí)間為I. 8-2. 2h，優(yōu)選為2h。
[0014] 所述乙醇是以乙醇水溶液的形式存在，所述乙醇水溶液的體積分?jǐn)?shù)具體可為 96%〇
[0015] 上述制備方法中，步驟2)中，還包括對(duì)醇沉除雜后所得液進(jìn)行離心，棄去沉淀物， 收集上清液，并對(duì)所述上清液減壓蒸餾除去乙醇的步驟，所述離心具體可在3000r/min離 心20分鐘，所述加壓蒸餾具體可在55°C和0. 2Mpa條件下加壓蒸餾。
[0016] 上述制備方法中，步驟3)中，所述復(fù)合蛋白酶的加入量為所述回收液質(zhì)量的 1. 8% -2. 2%，優(yōu)選為 2%。
[0017] 所述復(fù)合蛋白酶是由木瓜蛋白酶、胰蛋白酶和枯草蛋白酶組成，所述木瓜蛋白酶、 胰蛋白酶和枯草蛋白酶的質(zhì)量比為I :(0.9-1. I) :(0.55-0. 65)，優(yōu)選為1:1:0. 6。
[0018] 所述木瓜蛋白酶的活力為3500U/mg ;所述胰蛋白酶的活力為3000U/mg ;所述枯草 蛋白酶的活力為4000U/mg。
[0019] 所述酶解的酶解溫度為38-42°C，優(yōu)選為40°C。
[0020] 所述酶解的酶解時(shí)間為22-26h，優(yōu)選為24h。
[0021] 所述酶解時(shí)的體系的pH值為7. 8-8. 2,優(yōu)選為8。
[0022] 上述制備方法中，步驟3)中，還包括對(duì)所述酶解液進(jìn)行超濾截留的步驟，具體可 用5K中空纖維柱進(jìn)行超濾截留。
[0023] 上述制備方法中，步驟4)中，所述氧化劑具體可為!1202。
[0024] 所述氧化劑的加入量為所述酶解液質(zhì)量的0. 18% -0. 22%，優(yōu)選為0. 2%。
[0025] 所述氧化反應(yīng)的反應(yīng)溫度為36. 5-37. 5°C，反應(yīng)時(shí)間為0. 9-1. lh，優(yōu)選為lh。
[0026] 所述氧化反應(yīng)時(shí)的反應(yīng)體系的pH值為5. 1-5. 3,優(yōu)選為5. 2。
[0027] 上述制備方法中，步驟4)中，還包括向所述氧化反應(yīng)后所得物中加入MnO2除去多 余H 2O2，并且過(guò)濾除去過(guò)量MnO2的步驟，具體可按如下步驟：向所述氧化反應(yīng)后所得物中加 入過(guò)量的MnO 2，在60°C下保溫10h，并且用0. 22 μ m微孔濾膜過(guò)濾除去過(guò)量MnO2即可。
[0028] 上述制備方法中，步驟4)中，還包括對(duì)所述氧化反應(yīng)后所得物進(jìn)行病毒滅活和灌 封的步驟，具體可灌注至安瓿中，沖入氮?dú)夂蠓饪凇?br>[0029] 本發(fā)明由上述制備方法制備得到的小牛血清去蛋白注射液也屬于本發(fā)明的保護(hù) 范圍。
[0030] 所述小牛血清去蛋白注射液中小分子多肽的含量為7. 0-8. Omg/ml，分子量 <5000D〇
[0031] 小牛血清去蛋白注射液是小牛血清經(jīng)過(guò)去除大分子物質(zhì)（如蛋白質(zhì)、核酸、脂多 糖等）得到的小分子活性物質(zhì)的混合物。
[0032] 本發(fā)明通過(guò)復(fù)合蛋白酶水解增加多肽的含量，使微量呼吸活性刺激指數(shù)達(dá)到11. 5 以上，技術(shù)指標(biāo)提升效果顯著。既往的傳統(tǒng)的純化方法（例如醇沉、超濾）等只能除掉小分 子物質(zhì)，而血清中的小分子有害物質(zhì)（例如：組胺、尿酸、肌酐等）無(wú)法通過(guò)過(guò)濾的方法去 除，層析雖然可以，但是層析損耗太大。本發(fā)明在醇沉離心前加入活性炭，活性炭會(huì)選擇性 優(yōu)先吸附高極性的小分子有害物，后吸附極性相對(duì)低的蛋白和多肽，這樣適量的活性炭可 以有效去除上述小分子有害物質(zhì)而保留活性物質(zhì)。在經(jīng)過(guò)除蛋白得到的小分子多肽中，含 有大量的胱氨酸和半胱氨酸，有大量的游離巰基，多肽的巰基會(huì)通過(guò)形成二硫鍵而發(fā)生聚 合，進(jìn)而重新生成蛋白，降低穩(wěn)定性，增加過(guò)敏反應(yīng)的幾率。本發(fā)明中通過(guò)在酸性條件下加 入H 2O2而將游離巰基氧化成磺酸基，磺酸基可以保留一定的生物活性，又可以避免多肽聚 合，再通過(guò)MnO 2催化使過(guò)量的H 202分解，最后通過(guò)微孔膜濾過(guò)除去MnO 2。本發(fā)明顯著提升 了產(chǎn)品的生物活性，又進(jìn)一步提高了產(chǎn)品的穩(wěn)定性，具有顯著的進(jìn)步意義，對(duì)于缺血缺氧性 疾病具有一定的療效。
【附圖說(shuō)明】
[0033] 圖1為實(shí)施例2中酶解溫度對(duì)3種蛋白