用于穩(wěn)定蛋白質(zhì)和Fc結(jié)構(gòu)域融合的融合蛋白的組合物的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種用于穩(wěn)定生理活性的蛋白質(zhì)和Fe結(jié)構(gòu)域的融合蛋白的組合物， 更具體地說，涉及一種使用含有銨鹽或銨鹽和琥珀酸鹽組合的組合物，穩(wěn)定蛋白質(zhì)和Fe結(jié) 構(gòu)域的融合蛋白的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 用于治療疾病目的的抗體藥物是應(yīng)用了先進(jìn)的生物過程技術(shù)，包括細(xì)胞系開發(fā)技 術(shù)、細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)和純化技術(shù)的生物藥。隨著這些抗體藥物被證明比現(xiàn)有藥物具有優(yōu)異的 療效和安全性，對此的需求日益增多。例如，已將通過將人P75的人腫瘤壞死因子受體融 合到人IgGl的Fe結(jié)構(gòu)域的胞外配體結(jié)合部分而制備的融合蛋白（TNFR:Fe ;依那西普）用 作治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的藥劑。此外，為了提高生理活性物質(zhì)的體內(nèi)的半衰期，試圖使用 GLP-IR 激動劑和 Fe 結(jié)構(gòu)域的融合蛋白（US2004-0558627 ;Chung, H. S. et al.，Regulatory p印tide，170, 2011)開發(fā)糖尿病治療劑。另外，試圖將諸如hGH或EPO的生理活性物質(zhì)融 合到Fe結(jié)構(gòu)域以增加生理活性物質(zhì)的體內(nèi)半衰期（KR10-2008-7018012)。近年來，VEGF受 體和Fe結(jié)構(gòu)域的融合蛋白（afIibercept)已被批準(zhǔn)并用作治療濕性年齡相關(guān)性黃斑變性 (WAMD)的藥劑。
[0003] 然而，如上所述的融合蛋白的問題在于，它們具有大且復(fù)雜的結(jié)構(gòu)并且物理上不 穩(wěn)定，因此導(dǎo)致聚集。各種導(dǎo)致這樣的聚集的因素都存在于生產(chǎn)和存儲蛋白質(zhì)的過程。
[0004] 例如，聚集可以由以下一種或多種因素引起。在純化期間，并非最佳的PH、鹽的種 類、鹽濃度、溫度、與空氣接觸、攪拌速度等都會引起聚集，而在配制過程中，蛋白質(zhì)的濃度 條件會引起聚集。在緩沖液交換期間，通過過濾膜、攪拌等會引起聚集，而在存儲過程中，溫 度變化、PH變化、與空氣接觸、攪拌等會引起聚集。另外，當(dāng)含有蛋白質(zhì)的制劑暴露于光時(shí)， 也會發(fā)生聚集，并且材料封裝也會引起聚集（Hamada，H.et al.，Current Pharmaceutical Biotechnology, 10:400, 2009) 〇
[0005] 當(dāng)抗體蛋白的疏水區(qū)由于其結(jié)構(gòu)變化而被暴露時(shí)，在緩沖液中發(fā)生融合蛋白 的最大聚集。換句話說，蛋白質(zhì)分子的疏水區(qū)被集合在一起形成聚集，并且這種聚集由 于抗體蛋白質(zhì)之間的共價(jià)鍵也可能以不可逆的方式發(fā)生（Hamada，H.et al. ,Current Pharmaceutical Biotechnology, 10:348, 2009)〇
[0006] 因上述原因而聚集的融合蛋白或抗體蛋白隨著時(shí)間的流逝而具有降低的活性或 失去活性。此外，當(dāng)這些蛋白質(zhì)聚集時(shí)，它們具有不會出現(xiàn)在非聚集狀態(tài)下的抗原性，因 此當(dāng)被注入人體時(shí)，會導(dǎo)致抗毒抗體（ADA)的產(chǎn)生。因此，目前迫切需要一種用于減少融 合蛋白的聚集的方法和穩(wěn)定的制劑，其包含展現(xiàn)出降低的聚集水平的融合蛋白（Current Trends in Monoclonal Antibody Development and Manufacturing, Biotechnology:Phar maceutical Aspects Volume XI，2010,pp 271-291)。
[0007] 為了這個(gè)目的，嘗試了加入防止聚集或控制pH的賦形劑或者加入緩沖液組合物 的方法。在抗體蛋白的疏水基團(tuán)暴露于蛋白質(zhì)分子的表面并相互結(jié)合而引起聚集的情況 下，使用能夠穩(wěn)定暴露的疏水基團(tuán)的賦形劑來防止聚集。例如，報(bào)道了使用氨基酸如精氨 酸、賴氨酸、脯氨酸、組氨酸和甘氨酸（US 4362661A和US 7648702)，聚山梨醇酯系表面活 性劑，兩親性聚合物如聚乙二醇（PEG)或聚乙烯吡咯烷酮（PVP)，多糖如葡聚糖，或單糖或 二糖如蔗糖、麥芽糖或海藻糖（US 5945098A)。
[0008] 然而，蛋白質(zhì)和Fc結(jié)構(gòu)域的融合蛋白比通常生產(chǎn)的抗體蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性要差，并 且因此相比其它蛋白質(zhì)或抗體顯示出更強(qiáng)的形成聚集的趨勢。有這樣一個(gè)實(shí)例，其中向蛋 白質(zhì)-Fc結(jié)構(gòu)域融合蛋白中加入表面活性劑如聚山梨醇酯來制備制劑，以防止融合蛋白的 聚集（Steven J. Shire et al.，Biotechnology:Pharmaceutical Aspects, Current Trends in Monoclonal Antibody Development and Manufacturing, XI:115,2010)〇
[0009] 因此，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，含有銨鹽或銨鹽和琥珀酸鹽組合的組合物可以通過抑制融 合蛋白的聚集來增加蛋白質(zhì)和Fc結(jié)構(gòu)域的融合蛋白的穩(wěn)定性，使其能夠很容易地保存很 長的一段時(shí)間，從而完成了本發(fā)明。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種用于穩(wěn)定化的組合物和使用該組合物穩(wěn)定蛋白 質(zhì)-Fc結(jié)構(gòu)域融合蛋白的方法，所述組合物可以通過抑制生理活性的蛋白質(zhì)和Fc結(jié)構(gòu)域的 融合蛋白的聚集，增加該融合蛋白的穩(wěn)定性。
[0011] 本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種用于預(yù)防和治療疾病的組合物，該組合物包含所 述用于穩(wěn)定化的組合物。
[0012] 為了達(dá)到上述目的，在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種用于穩(wěn)定蛋白質(zhì)-Fc結(jié)構(gòu)域 融合蛋白的組合物，其含有銨鹽或銨鹽和琥珀酸鹽的組合，以及一種用于預(yù)防和治療疾病 的組合物，其包括所述用于穩(wěn)定所述融合蛋白的組合物。
[0013] 在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種用于穩(wěn)定蛋白質(zhì)-Fc結(jié)構(gòu)域融合蛋白的方法， 其將銨鹽或銨鹽和琥珀酸鹽的組合添加到含有所述融合蛋白的組合物中。
【附圖說明】
[0014] 圖1示出測量在50°C將依那西普（TNF受體的水溶性部分和Fc結(jié)構(gòu)域的融合蛋 白）在含有各種賦形劑（精氨酸（Arg)、EDTA、甘氨酸（Gly)、組氨酸（His)、羥丙基環(huán)糊精 (HP環(huán)糊精）、氯化銨、聚乙二醇（PEG)、脯氨酸（Pro)、蔗糖、海藻糖和聚山梨醇酯20)的制 劑溶液中存儲1周后，依那西普的聚集度的結(jié)果。
[0015] 圖2示出測量在50°C將依那西普在含有各種賦形劑（精氨酸（Arg)、脯氨酸 (Pro)、50mM氯化銨、IOOmM氯化銨、200mM氯化銨、蔗糖、聚山梨醇酯20和羥丙基環(huán)糊精 (HPcD))的制劑溶液中存儲1周后，依那西普的聚集度的結(jié)果。
[0016] 圖3示出測量在37°C將依那西普在含氯化銨的制劑溶液中存儲4周后，依那西普 的聚集度的結(jié)果。
[0017] Arg :精氨酸；AmCl :氯化按；AmSul :硫酸按；
[0018] Am+Lys :氯化銨 + 賴氨酸；Am+EDTA :氯化銨 +EDTA ;
[0019] Am+Polysorabate 20 :氯化按 + 聚山梨醇醋 20 ;
[0020] Am+Suc :氯化按+鹿糖。
[0021] 圖4和圖5示出測量在45°C將依那西普在含有精氨酸、氯化銨、硫酸銨、氯化銨+ 賴氨酸、氯化銨+EDTA、氯化銨+聚山梨醇酯20、和氯化銨+蔗糖的制劑溶液中存儲14天后， 依那西普的聚集度的結(jié)果。
[0022] Arg :精氨酸；AmCl# :氯化按 ;
[0023] AmSul :硫酸按；Am#+Lys :氯化按#% +賴氨酸；
[0024] Am#+Suc :氯化按 #% + 鹿糖。
[0025] 圖6示出測量在45°C將依那西普在含有氯化銨的各種緩沖液（磷酸鈉、琥珀酸鈉、 檸檬酸鈉和組氨酸）中存儲5天后，依那西普的聚集度的結(jié)果。
[0026] 圖7示出測量在45°C將依那西普在不同pH的含有氯化銨的琥珀酸鈉緩沖液組合 物中存儲5天后，依那西普的聚集度的結(jié)果。
[0027] 圖8示出測量在45°C將依那西普在含有氯化銨和賴氨酸的琥珀酸鈉緩沖液組合 物中存儲14天后，依那西普的聚集度的結(jié)果。Enbrel :市售的依那西普（Enbrel)制劑；
[0028] AmCl :氯化銨；AmCl+Lys :氯化銨+賴氨酸。
【具體實(shí)施方式】
[0029] 除非另有定義，否則本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普 通技術(shù)人員的通常理解相同的含義。通常，本文中使用的命名法和將在下面描述的實(shí)驗(yàn)方 法是本領(lǐng)域公知且通常采用的。
[0030] 如本文所使用，"蛋白質(zhì)和Fc結(jié)構(gòu)域的融合蛋白"、"蛋白質(zhì)-Fc結(jié)構(gòu)域融合蛋白" 是指這樣的融合蛋白，其包含融合至作為抗體恒定區(qū)的Fc結(jié)構(gòu)域的蛋白，其中蛋白質(zhì)意指 由數(shù)個(gè)氨基酸組成的通過肽鍵形成的氨基酸聚合物。另外，多肽與具有低分子量的寡肽和 具有高分子量的蛋白質(zhì)具有相同的含義。因此，如本文所使用，"蛋白質(zhì)和Fc結(jié)構(gòu)域的融合 蛋白"與"多肽和Fc結(jié)構(gòu)域的融合蛋白"具有相同