慢性乙型肝炎的免疫基因治療藥物及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物制藥領(lǐng)域中的基因治療藥物，特別是涉及一種慢性乙型肝炎的免 疫基因治療藥物及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 慢性乙型肝炎是一種由乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV)引起的嚴(yán)重傳染 疾病。全球目前有20億人感染過乙肝病毒，其中約4億人為乙肝病毒慢性感染者，HBV的 持續(xù)感染會(huì)導(dǎo)致其中部分患者惡化為肝硬化甚至肝細(xì)胞癌，每年死于HBV引起的肝臟相關(guān) 疾病的人數(shù)達(dá)到一百萬人。
[0003]目前，抗病毒治療是臨床上最有效的慢性乙型肝炎治療手段，常用的乙肝抗病毒 治療藥物有干擾素和核苷類似物等，核苷類似物和干擾素通過抑制乙肝病毒的復(fù)制和合成 常被用于臨床治療，其中干擾素還具有一定的免疫調(diào)節(jié)作用。盡管這些抗病毒藥物能夠有 效降低患者體內(nèi)的病毒數(shù)量，甚至有時(shí)可降至檢測不到的水平，但停藥后很快會(huì)出現(xiàn)病情 反復(fù)。核苷類似物（如拉米夫定、阿德福韋、恩替卡韋等）可通過抑制DNA逆轉(zhuǎn)錄酶活性 而抑制乙肝病毒的復(fù)制，盡管其能夠有效降低患者血清中病毒DNA拷貝數(shù)，甚至達(dá)到檢測 不到的程度，但是不能抑制抗藥病毒的產(chǎn)生，而且核苷類似物很少能夠通過有效消除受感 染肝細(xì)胞中的殘余病毒達(dá)到對HBV感染的長期免疫控制的目的，很難實(shí)現(xiàn)乙肝表面抗原 (HBsAg)和HBeAg的血清轉(zhuǎn)陰或完全清除，因此，長期使用核苷類似物容易產(chǎn)生耐藥性，停 藥后易出現(xiàn)反彈。干擾素（interferon，IFN)具有直接抗病毒作用和免疫調(diào)節(jié)作用，可有效 提高機(jī)體免疫力，但只能注射給藥，具有持續(xù)應(yīng)答率低、副作用多、治療療程長、價(jià)格昂貴等 缺點(diǎn)。因此，探尋有效的新型治療藥物及方案是治療慢性乙肝的當(dāng)務(wù)之急。
[0004] 基因治療（gene therapy)是一種通過向患者祀細(xì)胞導(dǎo)入正?；蚧蛘咧委熜曰?因片段以替代患者體內(nèi)致病基因可改變?nèi)梭w內(nèi)遺傳物質(zhì)的新型治療手段。將外源性抗病 毒因子導(dǎo)入靶細(xì)胞內(nèi)，通過在不同水平細(xì)胞因子基因和共刺激分子基因的表達(dá)抑制病毒的 復(fù)制，有效誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答，同時(shí)還能避免長期給藥引發(fā)的耐藥性和副作用?；蛑?療（gene therapy)作為一種結(jié)合了基因重組技術(shù)、靶向免疫治療等多種技術(shù)的生物治療方 法，逐漸被人們應(yīng)用于治療嚴(yán)重威脅人類健康的多種疾病，如乙型肝炎、惡性腫瘤、單基因 遺傳病、心腦血管疾病和艾滋病等。
[0005] 抗乙肝病毒免疫基因治療是將外源性的抗乙肝病毒因子導(dǎo)入靶細(xì)胞內(nèi)，在不同水 平上通過細(xì)胞因子基因和共刺激分子基因的表達(dá)抑制乙肝病毒的復(fù)制，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫 應(yīng)答，同時(shí)還可避免由于長期給藥引發(fā)的耐藥性和副作用。作為一種能有效避免引發(fā)耐藥 性和副作用的全新治療手段，基因治療的應(yīng)用前景顯得尤為廣闊。
[0006] 基因治療導(dǎo)入機(jī)體的途徑有兩種，一種是體外基因治療（ex vivo)途徑，即取出患 者體內(nèi)將要導(dǎo)入目的基因的靶細(xì)胞，在體外培養(yǎng)后將治療基因轉(zhuǎn)入靶細(xì)胞，再將攜帶有外 源基因的靶細(xì)胞回輸?shù)饺梭w內(nèi)，通過靶細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)產(chǎn)物達(dá)到對機(jī)體進(jìn)行免疫治療的目 的。另一種是體內(nèi)基因治療（in vivo)，即將承載有治療性基因片段的載體直接導(dǎo)入機(jī)體靶 細(xì)胞，使其在體內(nèi)獲得表達(dá)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的是提供一種免疫及治療效果較好的且能夠適應(yīng)臨床上對生物治療 藥物的實(shí)際需求，提高臨床應(yīng)用安全性的治療慢性乙型肝炎的免疫基因治療藥物。
[0008] 本發(fā)明所提供的慢性乙型肝炎免疫基因治療藥物，其活性成分是以pSVK載 體為出發(fā)載體構(gòu)建的攜帶融合基因dSFVa-IRES_hIL12的可復(fù)制型重組載體，命名為 pSVK-dSFV a -IRES-hIL-12 (簡稱 pSVK-HBVE)，所述融合基因 dSFV a -IRES_hIL12 是由融合 基因dSFV a和人白介素-12基因通過IRES序列相連，所述融合基因dSFV a包括人源化抗 HBsAg dsFv抗體基因和人干擾素a基因。
[0009] 所述可復(fù)制型重組載體pSVK-HBVE的核苷酸序列如序列表中序列3所示。
[0010] 所述PSVK載體核苷酸序列如序列表中序列2所示。
[0011] 所述融合基因 dSFVa-IRES_hIL12 由命名為 pVAX-dSFVa-IRES-hIL_12(簡稱 pVAX-HBVE)的重組質(zhì)粒雙酶切得到，pVAX-HBVE核苷酸序列如序列表中序列1所示。
[0012] 其中pVAX-HBVE通過以下方法構(gòu)建得到：
[0013]1)、構(gòu)建pEE14. 1-dSFV a載體：將人源化抗HBsAgdsFv抗體基因與人干擾素a 基因?qū)胼d體PEE14. 1，獲得攜帶有人源化抗HBsAgdsFv抗體基因與人干擾素a基因的重 組載體，命名為pEE14.1_dSFVa ;
[0014]2)、獲得融合基因dSFV a:雙酶切PEE14. 1-dSFV a載體得到人源化抗HBsAg dsFv 抗體和人干擾素a融合基因，命名為dSFVa ;
[0015]3)、構(gòu)建pVAX-IRES-hIL-12載體：將人白介素12(IL-12)基因?qū)胼d 體pVAX-IRES，獲得攜帶IRES序列與人白介素12(IL-12)基因的重組載體，命名為 pVAX-IRES-hIL-12 ；
[0016] 4)、獲得 pVAX-IRES-hIL-12 載體片段：雙酶切 pVAX-IRES-hIL-12 載體得到 pVAX-IRES-hIL-12載體的Nhe I和EcoR I雙酶切片段；
[0017] 5)、dSFVa融合基因與pVAX-IRES-hIL-12載體片段的連接：將步驟2)獲得的 dSFVa融合基因與步驟4)獲得的pVAX-IRES-hIL-12載體片段進(jìn)行連接得到連接物；
[0018] 6)、連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化：將連接產(chǎn)物向感受態(tài)大腸桿菌E.coli.trans5a中轉(zhuǎn) 化，陽性克隆質(zhì)粒即為攜帶dSFVa融合基因和人白介素-12基因的重組質(zhì)粒，命名為 pVAX-dSFV a -IRES-hIL-12 (簡稱 pVAX-HBVE)。
[0019] 本發(fā)明還提供一種構(gòu)建如上所述pSVK-HBVE的方法，包括以下步驟：
[0020] 1)構(gòu)建攜帶dSFVa-IRES_hIL12融合基因的重組質(zhì)粒 pVAX-dSFV a -IRES-hIL-12 (簡稱pVAX-HBVE)，其核苷酸序列如序列表中序列1所示；
[0021] 2)雙酶切重組質(zhì)粒pVAX-HBVE，獲得融合基因dSFV a -IRES_hIL12;
[0022] 3)單酶切可復(fù)制型載體pSVK，使其線性化得到pSVK載體片段；
[0023] 4)將dSFVa -IRES_hIL12融合基因與pSVK載體片段進(jìn)行連接，得到可復(fù)制型重組 載體 pSVK-dSFV a -IRES-hIL-12 (簡稱 pSVK-HBVE)。
[0024] 步驟1)所述pVAX-HBVE核苷酸序列如序列表中序列1所示。
[0025] 可復(fù)制型載體pSVK核苷酸序列如序列表中序列2所示。
[0026] 步驟1)所述重組質(zhì)粒pVAX-HBVE的構(gòu)建過程為：
[0027] 1)、構(gòu)建pEE14. 1-dSFV a載體：將人源化抗HBsAg dsFv抗體基因與人干擾素a 基因?qū)胼d體PEE14. 1，獲得攜帶有人源化抗HBsAg dsFv抗體基因與人干擾素a基因的重 組載體，命名為pEE14.1_dSFVa ;
[0028]2)、獲得融合基因dSFV a :雙酶切PEE14. 1-dSFV a載體得到人源化抗HBsAg dsFv 抗體和人干擾素a融合基因，命名為dSFV a ;
[0029] 3)、構(gòu)建pVAX-IRES-hIL-12載體：將人白介素12(IL-12)基因?qū)胼d 體pVAX-IRES，獲得攜帶IRES序列與人白介素12(IL-12)基因的重組載體，命名為 pVAX-IRES-hIL-12 ；
[0030] 4)、獲得 pVAX-IRES-hIL-12 載體片段：雙酶切 pVAX-IRES-hIL-12 載體得到 pVAX-IRES-hIL-12載體的Nhe I和EcoR I雙酶切片段；
[0031] 5)、dSFVa融合基因與pVAX-IRES-hIL-12載體片段的連接：將步驟2)獲得的 dSFVa融合基因與步驟4)獲得的pVAX-IRES-hIL-12載體片段進(jìn)行連接得到連接物；
[0032] 6)、連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化：將連接產(chǎn)物向感受態(tài)大腸桿菌E.coli.trans5a中轉(zhuǎn) 化，陽性克隆質(zhì)粒即為攜帶dSFVa融合基因和人白介素-12基因的重組質(zhì)粒，命名為 pVAX-dSFV a -IRES-hIL-12(簡稱pVAX-HBVE)。
[0033] 本發(fā)明還提供所述可復(fù)制型重組載體pSVK-HBVE在制備慢性乙型肝炎免疫基因 治療藥物中的應(yīng)用。所述免疫基因治療可為電穿孔肌肉內(nèi)注射免疫，其過程為：肌內(nèi)注射 藥物進(jìn)行免疫，免疫后均接受60V電壓的電穿孔刺激，電穿孔其它條件：電容：8F，頻率： 0. 75Hz，脈沖次數(shù)：6次，脈沖時(shí)間：50ms。
[0034] 本發(fā)明將抗體靶向干擾素a和人IL-12共同表達(dá)于可復(fù)制型載體pSVK 中，構(gòu)建出人源化抗HBsAg dsFv抗體與人干擾素a和白介素-12的融合表達(dá)質(zhì)粒 pSVK-dSFV a -IRES-hIL-12,并在真核細(xì)胞及體外均獲得高效表達(dá)，人IL-12與人IFN- a的 聯(lián)合應(yīng)用將在腫瘤控制過程中起到重要的協(xié)同作用，本發(fā)明為慢性乙型肝炎的基因治療提 供了一種安全高效的免疫基因治療藥物。
[0035] 本發(fā)明的實(shí)施例構(gòu)建了可融合表達(dá)人干擾素a和人白細(xì)胞介素12的pVAX載體 免疫基因治療質(zhì)粒pVAX-HBVE和可復(fù)制型免疫基因治療質(zhì)粒pSVK-HBVE，并利用轉(zhuǎn)基因小 鼠模型對可復(fù)制型免疫基因治療質(zhì)粒pSVK-HBVE進(jìn)行了初步免疫功能驗(yàn)證，并對其免疫機(jī) 制進(jìn)行深入探討，為pSVK-HBVE免疫功能的全面驗(yàn)證奠定了基礎(chǔ)，結(jié)果匯總?cè)缦拢?br>[0036] 1.實(shí)施例1構(gòu)建了可融合表達(dá)人干擾素a和人白細(xì)胞介素12的免疫基因治療 質(zhì)粒pVAX-HBVE，酶切和測序鑒定顯示質(zhì)粒成功構(gòu)建，在相應(yīng)細(xì)胞系中獲得分泌表達(dá)，通過 ELISA檢測質(zhì)粒的表達(dá)效率，結(jié)果pVAX-HBVE可大量表達(dá)免疫有關(guān)的細(xì)胞因子人IFN- a和 hIL-12,參與調(diào)節(jié)機(jī)體對乙肝病毒的免疫應(yīng)答。
[0037] 2.實(shí)施例2構(gòu)建了可在體內(nèi)高效復(fù)制的免疫基因治療質(zhì)粒pSVK-HBVE，酶切和測 序鑒定顯示質(zhì)粒成功構(gòu)建，在相應(yīng)細(xì)胞系中獲得分泌表達(dá)，通過ELISA檢測質(zhì)粒的表達(dá)效 率，結(jié)果pSVK-HBVE可大量表達(dá)免疫有關(guān)的細(xì)胞因子人IFN- a和hIL-12,參與調(diào)節(jié)機(jī)體對 乙肝病毒的免疫應(yīng)答。pSVK-HBVE是以實(shí)施例1構(gòu)建的含有IRES序列可使其上游和下游基 因同時(shí)表達(dá)的pVAX-HBVE載體為基礎(chǔ)，通過將目的基因HBVE導(dǎo)入到可進(jìn)行自主復(fù)制的修飾 后的塞姆利基森林病毒（semLiki forest virus，SFV)載體pSVK所構(gòu)建的。這種可復(fù)制型 載體具有RNA復(fù)制酶編碼基因和啟動(dòng)子元件，可同時(shí)表達(dá)上游和下游的不同目的基因，并 且在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行自我復(fù)制，從而高效表達(dá)外源目的基因。因此，復(fù)制型質(zhì)粒PSVK-HBVE可在 宿主細(xì)胞內(nèi)高效表達(dá)天然形式的外源蛋白，并可能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生強(qiáng)烈的細(xì)胞免疫反應(yīng)和宿 主細(xì)胞的凋亡。此外，復(fù)制型質(zhì)粒PSVK-HBVE在宿主細(xì)胞核外完成復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯等過程， 降低了將外源基因整合到宿主的基因組中的風(fēng)險(xiǎn)，具有較好的安全性。
[0038] 3.轉(zhuǎn)基因小鼠模型動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示：可復(fù)制型免疫基因治療質(zhì)粒pSVK-HBVE配合高 效的活體電穿孔遞送技術(shù)使得較少的質(zhì)粒用量即可發(fā)揮強(qiáng)有力的抗病毒效果，具體表現(xiàn)為 質(zhì)粒免疫治療的小鼠血