多價的糖結合疫苗的制作方法
【專利說明】多價的糖結合疫苗
[0001] 本發(fā)明涉及表達內置的多個表位的新型結合抗原和包含其的多價糖結合疫苗和 制劑。此外，本發(fā)明涉及這些疫苗特別地用于保護人類群體和特別地用于保護兒科群體 免受下列感染的用途：因肺炎鏈球菌（s. pneumoniae)、腦膜炎奈瑟菌（N. meningitidis)、 流感嗜血桿菌（H. inf luenzae)、肺炎克雷伯菌（K. pneumoniae)、結核分枝桿菌 (M. tuberculosis)、金黃色葡萄球菌（S. aureus)引起的肺部和全身性感染，或由傷寒沙門 氏菌（S. typhi)、霍亂弧菌（V. cholerae)和大腸桿菌（E. coli)引起的腸道感染。本發(fā)明還 涉及用于保護免受白色念珠菌（C. albicans)和大腸桿菌全身性和泌尿生殖感染或用于保 護免受獸醫(yī)醫(yī)學中的牛分枝桿菌（M.bovis)感染的新型多價糖結合疫苗。
[0002] 結合疫苗是衡量現(xiàn)今臨床免疫學成功的金標準。自九十年代初，用于預防流感嗜 血桿菌、腦膜炎奈瑟菌和肺炎鏈球菌的結合疫苗的問世已經(jīng)大大改善了西方世界中兒科群 體的生活質量。這樣的突出的成就目前因WHO發(fā)起的擴大免疫規(guī)劃和通過幾個國家的預先 市場承諾（AMC)在近期實施的國家免疫規(guī)劃而正擴展至發(fā)展中國家。
[0003] 例如，疫苗如"Prevnar"（其自2000年起出現(xiàn)于西方市場，先前其為7-價制劑，目 前其為13-價制劑，這兩種制劑均含有共價結合至載體蛋白CRM197的肺炎鏈球菌的單一型 特異性多糖（PS))現(xiàn)今由WHO推薦至世界上所有國家用于空前的免疫接種活動以保護兒科 群體免受肺炎鏈球菌的全身性感染（侵襲性肺炎球菌病或IPD)，所述感染可最終誘發(fā)急性 細菌性腦膜炎。事實上，正因為治療的時間間隔被減少到從癥狀開始后的幾個小時，此病理 學被廣泛記錄為具有高死亡率，所以應遵循的合理策略是預防而非治療疾病。
[0004] 由于顯著代表人中肺炎鏈球菌感染的細菌種的量很多（現(xiàn)今已知的超過90個種 中的多至23個細菌種）并且當疫苗制劑包含幾種結合抗原（例如如果包括由WHO鑒定為藥 物抗性的流行病學最重要的血清型時，13或15或更多種，其包括細菌血清型（根據(jù)Danish 命名法）1、2、3、4、5、6A、6B、6C、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、 22F、23F、33F)時使用結合至蛋白載體的單一型特異性Ps的策略需要顯著劑量的載體蛋 白。減少整個結合制劑中載體蛋白的量的可能性正成為一個優(yōu)先的問題。
[0005] 事實上，必須考慮到用流感嗜血桿菌（一種b型Ps的型特異性結合物）、腦膜炎 奈瑟菌（A、C、W135和Y群Ps的4種群特異性結合物）和肺炎鏈球菌（1、3、4、5、6A、6B、7F、 9V、14、18C、19A、19F、23F型PS的多至13種型特異性結合物）的結合疫苗進行免疫接種用 于預防廣譜IPD的兒童將要注射18種結合抗原，其具有載體蛋白的18倍單一型特異性劑 量的相應負荷。此外，考慮到給2歲前的兒童賦予完全保護需要3至4次劑量的疫苗的事 實，該劑量必須乘以3至4倍。將所有考慮在內，注射入兒童的載體蛋白的總量可容易地達 到約0. 20mg的劑量，至少在蛋白CRM197的情況下是如此，這顯然造成了免疫系統(tǒng)的壓力， 然而到目前為止免疫系統(tǒng)似乎良好地耐受這樣量的用于賦予宿主輔助T細胞依賴性的蛋 白載體。然而，通過連續(xù)升級多價疫苗的制劑如用于預防肺炎鏈球菌感染的制劑，血清型Ps 的量因而載體蛋白的量注定會隨時間上升。
[0006] 在這方面，本發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)結合抗原的新類型，其特征在于表達多種糖特異性、預 定和內置的分子構建體，其使用一摩爾（或微摩爾或納摩爾或皮摩爾，均代表其分數(shù)）的蛋 白載體來攜帶至少3種不同的型（或群）特異性糖抗原的每一種的至少一摩爾（或微摩爾 或納摩爾或皮摩爾，均代表其分數(shù)），因此結合物表達至少總共四種不同的抗原相關血清學 特異性。
[0007] 以這種方式，包含多達18種型特異性結合抗原的疫苗制劑（作為例子）將通過僅 使用目前可獲得的單抗原聯(lián)合制劑中所需的載體蛋白的量的三分之一（或33%)來合成， 從而使得宿主的免疫系統(tǒng)上的免疫原性負荷將顯著降低從而更安全。
[0008] 事實上，由于以重復劑量施用的蛋白抗原（例如作為結合實體）的量使得免疫 系統(tǒng)不堪重負而下調，尤其當預先存在的載體蛋白特異性的記憶IgG抗體的顯著血清滴 度存在于治療的宿主中時，存在著免疫學公知的被定義為"載體蛋白依賴性免疫抑制和 免疫干擾"的現(xiàn)象Oagan R.等人，Vaccine 28(34) :5513-5523, 2010)。然而，根據(jù)先 前指出哺乳動物針對糖結合抗原的回憶IgG免疫應答受限于蛋白-糖表位的雜合連接 區(qū)域，其中免疫應答的特異性限于共價連接的糖結構的一些單糖殘基的實驗工作，本發(fā) 明的分子模型導致的蛋白載體劑量的顯著減少保證了輔助T依賴性的完全表達（Arndt and Porro, Immunobiology of Proteins and Peptides, Edited by M. Z. Atassi, Plenum Press，New York and London，Vol. 303, pages 129-148, 1991)〇
[0009] 上文提及的論文研究結合至載體蛋白CRM197的肺炎鏈球菌Ps的不同化學策略和 不同MW，用于在使用單官能活化的糖抗原時獲得最優(yōu)的結合物結構；該論文還通過合成的 結合物的分子圖譜研宄了結合構建體中用于負責哺乳動物中的輔助T依賴性（通過分析 IgG同種型多克隆抗體）的最可能的分子區(qū)域。
[0010] 以相同申請人名義的US 4, 711，779公開了三價糖蛋白的分子模型，其在哺乳動 物中表達針對革蘭氏陽性和革蘭氏陰性細菌的免疫原性。該文獻涉及分子構建體，其使用 通過在低溫度下于化學水解后顯現(xiàn)的末端還原基團上引入的接頭衍生物共價偶聯(lián)至載體 蛋白的低MW寡糖；該結合物的特征在于最多3種不同的特異性（針對蛋白CRM197,針對6A 型Ps，針對C群Ps);其使用單官能性的寡糖；所述分子構建體引發(fā)針對載體蛋白和針對所 攜帶的兩種糖結構的每一種的血清學特異性。
[0011] 同樣以相同申請人名義的US 5, 306, 492公開了寡糖結合疫苗和用于產(chǎn)生所述基 于寡糖的結合疫苗的改進方法。該方法涉及在經(jīng)由接頭分子共價偶聯(lián)至載體蛋白之前在高 溫和在所顯現(xiàn)的末端還原基團上活化寡糖半抗原；表達二價特異性的典型結合物（針對蛋 白CRM 197和針對型（或群）-PS);其使用單官能性的寡糖；所述分子構建體引發(fā)針對載體 蛋白和針對所攜帶的單一糖結構的血清學特異性。
[0012] 以相同申請人名義的EP 1501542公開了以高產(chǎn)率產(chǎn)生HMW多分散的、交聯(lián)的、基 于多糖的結合抗原的新方法；表達針對蛋白質破傷風類毒素和針對所攜帶的型（或群）_PS 的特異性的典型結合物；其使用偶聯(lián)至多官能蛋白載體的多官能多糖；所述分子構建體引 發(fā)針對載體蛋白和針對所攜帶的單一糖結構的血清學特異性。
[0013]此外，Porro M?等人（Medecine Tropicale, 43:129-132, 1983)首次介紹了腦膜 炎球菌B群寡糖（預先在受控的酸性條件下進行了水解）在其末端還原基團上通過氨和 經(jīng)由在低溫（25-37°C )下的還原胺化的活化化學；這樣的具有單官能氨基的寡糖隨后被己 二酸的雙-琥珀酰亞胺酯活化，并隨后結合至載體蛋白CRM197的賴氨酸殘基的氨基?；?化的寡糖抗原在結合過程中是單官能性的并且結合在沒有載體蛋白CRM 197的預先活化 的情況下發(fā)生。此外，Porro M?等人（Molecular Immunology, 22:907-919(1985))首次 公開了肺炎球菌6A型寡糖（預先在受控的酸性條件下進行了水解）在其末端還原基團上 通過氨和經(jīng)由還原胺化的活化化學，其論文題為"Specific antibodies to diphtheria toxin and type 6A pneumococcal capsular polysaccharide induced by a model of semi-synthetic glycoconjugate antigen"。這樣的具有單官能氨基的寡糖隨后被己二酸 的雙-琥珀酰亞胺酯活化，并隨后結合至載體蛋白CRM197的賴氨酸殘基的氨基?；罨墓?糖抗原在結合過程中并且在沒有載體蛋白的預先活化的情況下是單官能性的。
[0014]在之后的一篇文章（Molecular Immunology, 23 :385_391，（I986))中，相同的 作者表征了兩種莢膜寡糖（分別來源于革蘭氏陰性和革蘭氏陽性細菌）與相同蛋白載體 CRM197使用在前述文章中所公開的活化化學和結合化學的兩步結合方法。兩種活化的寡糖 抗原在結合過程中并且在沒有載體蛋白的預先活化的情況下是單官能性的。
[0015] 已觀察到在該文章中公開的結合物牽涉不同的端點活化的低MW莢膜寡糖（即肺 炎鏈球菌6A型Ps和腦膜炎奈瑟菌的C群Ps)。這樣的端點活化的使用提供低的偶聯(lián)產(chǎn)率從 而導致與所攜帶的兩種寡糖結構的最大量不成比例的巨大量的載體蛋白（相對于4.8yg 的6A Ps和3 y g的C型Ps，約31. 2 y g的CRM197,參見上文引用的1986年的文獻的第387 頁左欄）。
[0016]最后，在之后的一篇文獻（Porro M?由 R. Bell 和 G. Torrigiani (World Health Organization)編輯，第 279-306 頁；John Wiley&Sons Publishers, New York 1987)中， 本發(fā)明人概述了上文對于包含蛋白載體和最多兩種不同的糖結構的結合抗原所引用的概 念和技術方法。
[0017] 在上述現(xiàn)有技術的發(fā)展中，本發(fā)明的基本分子構建體的優(yōu)選（非限制性）實施方 案包括多價的、優(yōu)選四價的半合成糖蛋白，其特征在于內置的多個表位并且將其輔助T依 賴性免疫原性特異性"體內"表達至蛋白CRM197以及所攜帶的3種型特異性Ps，例如肺炎鏈 球菌的 Ps。作為例子，肺炎鏈球菌的 1、2、3、4、5、6A、6B、6C、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、 15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F、33F 型 Ps 的任何三元組，例如由 3、6A、7F 型 Ps 組成的 三元組可結合至載體蛋白。作為例子，術語"四價"是指載體蛋白抗原（自身用作抗原而不 是僅僅作為載體）加上三種攜帶的Ps抗原。
[0018] 因此，所述新的新型分子構建體誘導針對載體蛋白和針對所攜帶的三種糖結構的 每一種的血清學特異性。
[0019] 此半合成的四價抗原可以被認為是新一代表達多種特異性的結合抗原的新的新 型前體，其用于獲得具有針對多種細菌病原體的始終廣譜的保護的疫苗同時顯著減少載體 蛋白的量，以獲得在下列方面的合理改善：
[0020] A)生產(chǎn)疫苗的費用；
[0021] B)其在允許合成具有三種（或更多）Ps抗原的糖蛋白（特征還在于高MW)的偶聯(lián) 產(chǎn)率的改善方面上的生產(chǎn)效率；
[0022] C)它們在從血清學觀點上通過使用本申請中記載的特異性抑制-ELISA測定對共 價連接的Ps的量的定量測定方面的生產(chǎn)準確性，用于準確地定量存在于所公開的分子構 建體中的多種糖抗原，其基于免疫化學而非所引用的現(xiàn)有技術的化學定量（參見Porro等 人，1986)，尤其是在其中高度顯著的相似性存在于種特異性糖結構之間的各種情況下；
[0023] D)其與施加于目標群體的免疫系統(tǒng)的蛋白劑量的較低量相關的安全性。事實上， 所述蛋白劑量是存在于Porro等人，1986的文獻的具有兩種Ps的CRM197結合物中的蛋白 劑量的約30 % (前述2 y g蛋白/三元組/劑量的整個15-價制劑的劑量中的約10 y g的蛋 白）?；谖墨I中報道的可用的化學計量的其中免疫接種劑量包括至少31. 2 y g的CRM197 的這樣的量，該蛋白劑量的減少對于本領域技術人員是不可預測的；因此，對于包含13或 15種結合抗原的多價組合物，即使假定制備的可能性，根據(jù)先前的化學過程，本發(fā)明詳述的 多種四價分子模型，制劑中的蛋白CRM197的量會是31. 2x 15/3 = 156. 0 y g，相對于本發(fā)明 的10 y g的多價結合物；以及最后
[0024] E)這樣的結合疫苗的公共實用性。
[0025] 本發(fā)明在臨床免疫學和疫苗學領域中開辟了新的途徑。實際上，所公開的分子構 建體的內置的多種抗原性（特異于不同的細菌抗原）在多藥理學的創(chuàng)新領域中實際上相當 于優(yōu)先設計用于同時到達具有藥理學相關性的多個受體的藥物的合成，因此允許減少以聯(lián) 合形式施用的藥物的數(shù)量（Besnard J.等人，Nature, 492:215-220, 2012) 〇
[0026] 因此，本發(fā)明的一個目的是由基本單元組成的抗原性多價分子構建體，所述基本 單元包括共價連接至最少三種具有不同血清學特異性的糖結構的輔助T依賴性載體蛋白， 其中每個糖結構包含至少一個重復基本抗原表位，所述表位其由最少5至12個單糖殘基， 優(yōu)選最少8至12個單糖殘基組成，如通過分子量測定和NMR光譜所評估的（取決于同源 或異源序列等價于不同數(shù)量的基本重復單元），所述重復基本抗原表位通過測定其各自在 抑制其同源多糖-抗體參照系統(tǒng)中的MIC 5(I值由與型特異性或群特異性多克隆或單克隆抗 體的反應性來評價。根據(jù)本發(fā)明，術語"糖結構"意欲包含寡糖（天然的或合成的）或多糖 (例如莢膜多糖）。
[0027] 根據(jù)本發(fā)明的抗原性多價分子構建體的T輔助依賴性載體蛋白共價連接至最少 三種（例如三或四或五種）具有不同血清學特異性的糖結構直至參與偶聯(lián)反應的載體蛋白 結構中存在的結構氨基酸（主要是Lys但還可為例如具有Arg和Hys的基本結構的氨基 酸）的親核氨基的反應性的限制。
[0028] 根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實施方案，共價連接至最少三種具有不同血清學特異性的不同 糖結構的輔助-T依賴性載體蛋白選自：天然白喉突變蛋白CRM 197(PRF 1007216A)，白喉 類毒素（CAE11230. 1的同源毒素），破傷風類毒素（ID No. AAK72964. 2的同源毒素），來自 流感嗜血桿菌（Haemophilus influenzae)的蛋白質D(AAA24998.1);肺炎球菌表面蛋白 (PSPA EMBL CBW33751. 1 和 PSPC EMBL ACF56456. 1);肺炎球菌毒素（肺炎球菌溶血素 EMBL ACF56060.1)或其變體和衍生物。特別地，當采用破傷風類毒素時，優(yōu)選采用通過己二酸二 酰肼間隔劑化學衍生的類毒素（破傷風類毒素-ADH)。
[0029] 根據(jù)本發(fā)明的最優(yōu)選實施方案，載體蛋白質是天然白喉突變蛋白CRM 197。
[0030]這種蛋白首先由 Uchida 和 Pappenheimer (Uchida T.等人，工13;[01. Chem. 248, 3838-3844, 1973)在七十年代中期報道，其可能用作針對白喉毒素的新型免疫原 (如與白喉類毒素免疫原性相關）的用途已由本申請人報道（Porro M.等人，J. Infect. Dis.，142 (5)，716-724, 1980)。此后，本申請人使用CRM 197作為理想的輔助-T依賴性載 體蛋白用于糖抗原，這在理解了后一組抗原在牽涉免疫系統(tǒng)的成熟的特定年齡（從約2個 月到約2歲的年齡）的人受試者中的特殊免疫原性特征的原因后發(fā)生。
[0031] 蛋白CRM 197包含535個氨基酸的序列，正如白喉毒素（Giannini G.等 人，Nucl. Acid Res.，12,4063-4069, 1984)，但在位置52的氨基酸上顯示點突變，其中 Glu取代Gly。其抗原性已被報道為主要涉及該序列的四個區(qū)域，當使用單克隆抗體時， 即為 AA 序列 1-156,157-193, 293-345 & 465-535(ZuckerD.andMurphyJ.R.，Mol. Immunol. 21，785-793, 1984)。該蛋白質的特征還在于39個賴氨酸殘基和一個氨基末端基 團，從而總共40個反應性氨基，其可目的性地用于牽涉各種結合策略的化學反應。
[0032] 本發(fā)明的結合物的載體蛋白CRM 197通常使用白喉桿菌（C. diphtheriae) C7(M97)t<)X_的克隆來制備，但它也可以通過除其它以外熒光假單胞菌（P. fluorescens) 的克隆獲得。
[0033] 根據(jù)本發(fā)明的抗原性多價分子構建體的優(yōu)選實施方案，所攜帶的糖結構選自但不 限于：肺炎鏈球菌（Streptococcus pneumoniae)的 Ps (1,2