用于產(chǎn)生脫唾液酸化免疫球蛋白的方法和載體的制作方法
【專利說(shuō)明】用于產(chǎn)生脫唾液酸化免疫球蛋白的方法和載體
[0001] 本申請(qǐng)是申請(qǐng)日為2007年12月26日，申請(qǐng)?zhí)枮?00780051802. 3 (國(guó)際申請(qǐng)?zhí)枮?PCT/US2007/088809)，發(fā)明名稱為"用于產(chǎn)生脫唾液酸化免疫球蛋白的方法和載體"的發(fā)明 專利申請(qǐng)的分案申請(qǐng)。
[0002] 發(fā)明背景 發(fā)明領(lǐng)域
[0003] 本發(fā)明涉及產(chǎn)生與Fc受體相互作用的治療蛋白質(zhì)例如抗體的方法，其中寡糖鏈 的組成就抗體與其靶的抗體親抗原性以及Fc受體結(jié)合親和力進(jìn)行最優(yōu)化，從而與產(chǎn)生糖 基化抗體的非最優(yōu)化方法相比較，最優(yōu)化所述抗體的效應(yīng)子功能活性。
[0004] 相關(guān)技術(shù)的描述
[0005] 抗體是在先天免疫中發(fā)揮顯著作用的可溶性血清糖蛋白。在重鏈恒定區(qū)中的保 守位置處所有天然產(chǎn)生的抗體的碳水化合物結(jié)構(gòu)都隨同種型而變化。每種同種型都具有N 聯(lián)寡糖結(jié)構(gòu)的不同陣列，這反復(fù)不定地地影響蛋白質(zhì)裝配、分泌或功能活性（Wright，A.和 Morrison，S. L.，Trends Biotech. 15 :26-32 (1997))。參考圖 1 和 2,依賴于加工程度，附著 的N聯(lián)寡糖結(jié)構(gòu)相當(dāng)不同，并且可以包括高甘露糖，以及含或不含二等分GlcNAc和核心巖 藻糖殘基的復(fù)雜雙觸角寡糖（Wright，A.和Morrison，S. L.，同上）。一般地，存在在特定糖 基化位點(diǎn)處附著的核心寡糖結(jié)構(gòu)的異質(zhì)加工，從而使得甚至單克隆抗體也作為多重糖形存 在。類似地，已顯示抗體糖基化中的主要差異在抗體產(chǎn)生細(xì)胞系之間發(fā)生，并且甚至對(duì)于在 不同培養(yǎng)條件下生長(zhǎng)的給定細(xì)胞系可見(jiàn)微小差異。
[0006] 在聚糖上的唾液酸（靜止基團(tuán)）已知在延長(zhǎng)除抗體外的糖蛋白的血清半衰期中是 重要的（Stockert，R.J. (1995) Physiol. Rev. 75, 591-609)。迄今為止，唾液酸對(duì)單克隆抗 體（Mabs)的作用仍未完全了解。Mabs的血清半衰期特別長(zhǎng)壽，并且Fc-融合蛋白的構(gòu)建已 證明是在開(kāi)發(fā)治療蛋白質(zhì)例如蛋白質(zhì)enteracept中有用的策略。
[0007] 抗體和T細(xì)胞受體分子具有負(fù)責(zé)特異性細(xì)胞表面受體結(jié)合的區(qū)域，所述結(jié)合調(diào)節(jié) 細(xì)胞應(yīng)答。在免疫系統(tǒng)中，這些功能分類為體液和細(xì)胞的?？贵w通常稱為連接體液和細(xì)胞 免疫機(jī)制的銜接分子：體液應(yīng)答主要?dú)w因于能夠與靶抗原高親和力結(jié)合的成熟的、分泌的、 循環(huán)抗體。細(xì)胞應(yīng)答歸因于通過(guò)ab-ag復(fù)合物的結(jié)合和通過(guò)下游結(jié)局的細(xì)胞激活結(jié)果，所 述下游結(jié)局通過(guò)由于ab-ag復(fù)合物與效應(yīng)細(xì)胞結(jié)合釋放的細(xì)胞介質(zhì)引起。這些細(xì)胞應(yīng)答包 括靶的中和、調(diào)理作用和致敏作用（如果抗原展示于細(xì)胞表面上）、肥大細(xì)胞的致敏作用和 補(bǔ)體激活。對(duì)于細(xì)胞靶，即，細(xì)胞表面抗原，這些效應(yīng)子功能導(dǎo)致通常所謂的抗體依賴性細(xì) 胞毒作用（ADCC)和依賴補(bǔ)體的細(xì)胞毒性（CDC)。
[0008] 在抗體同種型（例如，IgE、IgD、IgA、IgM和IgG)中，IgGs是最豐富的，其中IgGl 亞類顯示出最顯著程度和大量的效應(yīng)子功能。IgGl類型的抗體是癌癥免疫治療中最常用 的抗體，在所述癌癥免疫治療中ADCC和CDC活性通常視為重要的。在結(jié)構(gòu)上，IgG鉸鏈區(qū) 和CH2結(jié)構(gòu)域在抗體效應(yīng)子功能中起重要作用。Fc區(qū)（由鉸鏈、CH2和CH3結(jié)構(gòu)域的二聚 化形成）中存在的N聯(lián)寡糖影響效應(yīng)子功能。共價(jià)結(jié)合的寡糖是復(fù)雜雙觸角類型結(jié)構(gòu)，并 且是高度異質(zhì)的（參見(jiàn)圖1和2)。在Asn297處的保守N聯(lián)糖基化位點(diǎn)位于每個(gè)CH2結(jié) 構(gòu)域中。在成熟抗體中，與Asn297附著的2個(gè)復(fù)雜雙觸角寡糖包埋在CH2結(jié)構(gòu)域之間，與 多肽主鏈形成廣泛接觸。已發(fā)現(xiàn)它們的存在對(duì)于抗體介導(dǎo)效應(yīng)子功能例如ADCC是必需 的（Lifely，M. R.，等人，Glycobiology 5 :813_822 (1995) ; Jefferis，R.，等人，Immunol Rev. 163 :59-76 (1998) ;Wright，A?和 Morrison，S. L.，同上）〇
[0009]由各種宿主細(xì)胞產(chǎn)生的裝飾Fc部分抗體或抗體衍生結(jié)構(gòu)包含的異質(zhì)寡糖占優(yōu)勢(shì) 地包含唾液酸、巖藻糖、半乳糖和GlcNAc殘基作為末端糖（Raju，T. S.，等人Glycobiology 2000. 10(5) :477-86)。已顯示這些末端糖中的一些，特別是暴露的半乳糖、核心巖藻糖和 二等分GlcNAc殘基，影響分子的Fc部分的結(jié)構(gòu)且由此改變抗體效應(yīng)子功能。效應(yīng)子功能 例如ADCC活性和CDC活性可以通過(guò)附加聚糖的組成加以改變，所述效應(yīng)子功能依賴于與稱 為Fc受體的細(xì)胞表面受體的結(jié)合，以及與各種配體包括Clq補(bǔ)體蛋白質(zhì)的結(jié)合（Presta L. 2003.Curr Opin Struct Biol.l3(4) :519-25)。在Fc處附著的大多數(shù)N聯(lián)聚糖未唾液酸 化至顯著程度（Idusogie EE，等人 2000. J Immunol. 15:164(8) :4178_84)。
[0010] 在人IgG和其他重組產(chǎn)生的IgGs中發(fā)現(xiàn)的大多數(shù)結(jié)構(gòu)是含或不含暴露的Gal殘 基的復(fù)雜雙觸角結(jié)構(gòu)（圖1)。存在許多哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞，其目前用于表達(dá)重組抗體用于 研究目的以及生物制藥生產(chǎn)。宿主細(xì)胞起源物種以及培養(yǎng)條件可以引起與重組表達(dá)分子附 加的聚糖程度和結(jié)構(gòu)改變。用于抗體的重組表達(dá)的2種常用宿主細(xì)胞系是中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì) 胞（CH0)和小鼠骨髓瘤細(xì)胞（sp2/0、653、NS0)。盡管CH0細(xì)胞表達(dá)幾乎缺乏唾液酸聚糖的 重組抗體，但聚糖是99%巖藻糖基化的。巖藻糖的存在已顯示是減少的Fc-y III受體和因 此ADCC的主要貢獻(xiàn)者。小鼠骨髓瘤細(xì)胞表達(dá)具有最高達(dá)50%唾液酸但具有一般較少的巖 藻糖的重組抗體。如上所述，這些差異可以對(duì)體內(nèi)抗體活性具有顯著影響。
[0011] 因此，希望能夠以這樣的方式減少與治療抗體相關(guān)的聚糖唾液酸化，所述方式消 除關(guān)于收獲后加工的需要，且同時(shí)提供就唾液酸含量而言合理地同質(zhì)結(jié)構(gòu)。
[0012] 發(fā)明概述
[0013] 本發(fā)明包含用于生產(chǎn)具有減少的唾液酸含量的含F(xiàn)c分子特別是抗體治療劑的方 法、宿主細(xì)胞系、以及表達(dá)載體和質(zhì)粒。更具體而言，本發(fā)明包含編碼工程改造的唾液酸酶 編碼序列的表達(dá)質(zhì)粒，所述質(zhì)粒一旦整合入抗體分泌宿主細(xì)胞系內(nèi)，就使得宿主細(xì)胞能夠 分泌具有唾液酸酶活性的多肽。在一個(gè)實(shí)施方案中，在質(zhì)粒內(nèi)的編碼序列編碼產(chǎn)脲節(jié)桿菌 (Arthrobacter ureafaciens)唾液酸酶的催化結(jié)構(gòu)域。在本發(fā)明的進(jìn)一步方面，包含產(chǎn)脲 節(jié)桿菌唾液酸酶的催化結(jié)構(gòu)域的宿主細(xì)胞將翻譯的催化結(jié)構(gòu)域分泌到培養(yǎng)基內(nèi)。
[0014] 本發(fā)明包含用于控制含F(xiàn)c分子的性質(zhì)的方法，其包括使與Fc區(qū)附著的寡糖的唾 液酸化降到最低，由此最優(yōu)化分子對(duì)于多種定位的靶蛋白質(zhì)的抗體親抗原性和對(duì)于一種或 多種Fey受體例如？〇丫1?1、？〇丫1?114和？〇丫1?1114受體的親和力他(1：活性；巨噬細(xì)胞或 單核細(xì)胞活化；和血清半衰期。
[0015] 本發(fā)明還涉及在Fc結(jié)構(gòu)域中包含最大限度的唾液酸化N聯(lián)寡糖的含F(xiàn)c分子例如 抗體的高度同質(zhì)批次的制備。它進(jìn)一步涉及就在Fc寡糖中包含唾液酸的抗體以及在Fc寡 糖中不包含唾液酸的抗體富集的抗體批次的純化。
[0016] 附圖的幾個(gè)視圖的簡(jiǎn)述
[0017]圖1是在人IgG中發(fā)現(xiàn)的最大寡糖結(jié)構(gòu)的示意描述。
[0018] 圖2描述了在中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢（CH0)細(xì)胞中產(chǎn)生的重組IgG中發(fā)現(xiàn)的主要寡糖結(jié) 構(gòu)。
[0019] 圖3顯示Fc寡糖的HPLC分析結(jié)果。N聯(lián)寡糖首先通過(guò)用PNGase F酶處理從抗體 中釋放。所釋放的寡糖用鄰氨基苯甲酸進(jìn)行標(biāo)記，并且標(biāo)記的寡糖通過(guò)凝膠過(guò)濾層析進(jìn)行 純化。純化的標(biāo)記寡糖通過(guò)HPLC進(jìn)行分析，導(dǎo)致顯示的層析譜。
[0020] 圖4A和4B是顯示通過(guò)2種不同形式的不同Abl :TNF免疫復(fù)合物與K562細(xì)胞上 的人FcyRII結(jié)合的曲線圖。（A)在與Ab6復(fù)合的固定量1251標(biāo)記的人IgGl Ab5的存在 下，通過(guò)向細(xì)胞中加入各種量Abl和TNF的未標(biāo)記復(fù)合物測(cè)量的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合，所述Ab6是對(duì)于 Ab5特異的小鼠單克隆Ab。（B)通過(guò)向K562細(xì)胞中加入與 1251標(biāo)記的TNF復(fù)合的各種量 Abl測(cè)量的直接結(jié)合。
[0021] 圖5A-D是用各種測(cè)試Ab制劑的Fc y Rllla結(jié)合研究曲線圖，所述制劑用于與固 定濃度的放射性標(biāo)記的抗Fc y Rllla mAb 3G8競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合NK細(xì)胞Fc y Rllla :Abl天然糖基 化變體（A) ;Ab5天然糖基化變體（B) ;Abl凝集素柱級(jí)分（C);和Ab2凝集素柱級(jí)分（D)。
[0022] 圖6A-D是顯示使用在唾液酸含量中不同的Abl、在其細(xì)胞表面上超表達(dá)TNF的K2 靶細(xì)胞、和表達(dá)Fc y Rs的人PBMC效應(yīng)細(xì)胞執(zhí)行的體外ADCC測(cè)定結(jié)果的曲線圖。（A) Ab 1天 然糖基化變體，（B)Ab2天然糖基化變體，（C)在基于WGA凝集素親和力的分級(jí)分離后，在唾 液酸含量中不同的Abl的3個(gè)小批（sublot)與酶促去糖基化（Gno) Abl的比較，（D)未處 理的Ab 1樣品與完全唾液酸化的Ab 1 G2S2樣品、或Ab7同種型匹配的陰性對(duì)照Ab的比較。 樣品一式三份地進(jìn)行分析（誤差條表示標(biāo)準(zhǔn)差），并且所顯示的結(jié)果代表關(guān)于每個(gè)變體對(duì) 的3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。如通過(guò)額外平方和（extra sum of square)F檢驗(yàn)測(cè)定的，這些測(cè)試樣品 之間在活性中的差異是顯著的（對(duì)于圖A、C和DP < 0. 0001 ;對(duì)于圖BP = 0. 0016)。
[0023] 圖7A和B是顯示各種IgG抗體樣品與U-937細(xì)胞上的人Fc y RI (⑶64)受體的競(jìng) 爭(zhēng)性結(jié)合的曲線圖，（A) Abl G2(完全半乳糖基化和未唾液酸化的）和Abl G2S2 (hi)(完全 半乳糖基化和完全唾液酸化的）僅相差唾液酸的不存在和存在，（B)Ab3的2個(gè)不同批次在 荷電寡糖種類（含唾液酸種類）量方面不同，為總寡糖的2%或42%。
[0024] 圖8是顯示施用后時(shí)間和融合蛋白（FcPl)的Fc部分的血清濃度之間的關(guān)聯(lián)的曲 線圖，所述融合蛋白已完全唾液酸化（G2S2)或未修飾。
[0025] 圖9是顯示施用后時(shí)間和完全唾液酸化Ab2 G2S2、或完全脫唾液酸化的Ab2 G2的 Fc部分的血清濃度之間的關(guān)聯(lián)的曲線圖，通過(guò)如所述的酶促方法。
[0026] 圖10A-D是顯示Ab制劑中的唾液酸對(duì)細(xì)胞表面上的靶配體親和力的作用的曲線 圖，通過(guò)用放射性標(biāo)記的Ab的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合：(A) Abl天然變體，（b)Ab5天然變體，（C) Abl凝集 素柱級(jí)分變體，和（D)Ab2凝集素柱級(jí)分變體。樣品一式兩份或一式四份地進(jìn)行測(cè)試，并且 所顯示的結(jié)果代表3或4次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。如通過(guò)額外平方和F檢驗(yàn)測(cè)定的，在這些測(cè)試樣品 之間的結(jié)合中的差異是顯著的（對(duì)于圖A、C和DP < 0. 0001)。
[0027] 圖11A-B是顯示Ab制劑中的唾液酸對(duì)EIA板上包被的靶配體親和力的作用的曲 線圖：(A)與TNF結(jié)合的Abl天然變體，（B)與抗Id抗體結(jié)合的Ab2。
[0028] 圖12A-C是顯示Ab制劑中的唾液酸對(duì)靶配體親和力的作用的曲線圖，所述靶配體 作為對(duì)表面結(jié)合的Ab的放射性標(biāo)記的可溶性抗原存在：(A) Abl天然變體，（B) Abl 1凝集素 柱級(jí)分變體，和（C)Ab2凝集素柱級(jí)分變體。進(jìn)行與放射性標(biāo)記的Ag和100倍過(guò)量的未標(biāo) 記Ag的平行溫育，以測(cè)定非特異性結(jié)合。樣品一式三份地進(jìn)行測(cè)試。
[0029] 圖13是構(gòu)建為表達(dá)與hGH(人生長(zhǎng)激素）信號(hào)序列連接的產(chǎn)脲節(jié)桿菌唾液酸酶A 的催化結(jié)構(gòu)域的表達(dá)質(zhì)粒P3629的示意圖示，其中示出了用于克隆到親本載體p2815內(nèi)的 限制酶位點(diǎn)。
[0030] 圖14是呈現(xiàn)從表達(dá)分泌的唾液酸酶催化結(jié)構(gòu)域的細(xì)胞系純化的抗體的抗體依賴 性細(xì)胞毒作用（ADCC)活性的曲線；克隆3、5、12、13和17。
[0031] 發(fā)明詳述
[0032] 縮寫(xiě)
[0033] a 1，3GT，a-l，3_ 半乳糖基轉(zhuǎn)移酶；a2,3ST，〇-2,3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶；0 1，461'， 0-1，4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶；ADCC，抗體依賴性細(xì)胞毒作用；ATCC，美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心； BATDA，二（乙酰氧甲基）2,2':6'，2"-三聯(lián)吡啶1, 7"-二羧酸郵六，牛血清清蛋白；0)培 養(yǎng)基，化學(xué)成分確知培養(yǎng)基；⑶C，補(bǔ)體指導(dǎo)的細(xì)胞毒性；CMP-Sia，胞苷一磷酸N-乙酰神經(jīng) 氨酸；DMEM，Dulbecco氏改良的Eagle氏培養(yǎng)基；E : T，效應(yīng)細(xì)胞與靶細(xì)胞比：FBS，胎牛血 清；ESI-MS，電噴射離子化質(zhì)譜分析法。NK細(xì)胞，天然殺傷細(xì)胞；IgG，免疫球蛋白G ;頂DM， Iscove氏改良的Dulbecco氏培養(yǎng)基；MALDI-T0F-MS，基質(zhì)輔助激光/解吸離子化飛行時(shí)間 質(zhì)譜分析法;MHX，霉酚酸、次黃嘌呤、黃嘌呤；NANA，唾液酸的N-乙酰神經(jīng)氨酸同分異構(gòu)體； NGNA，唾液酸的N-羥乙酰神經(jīng)氨酸同分異構(gòu)體；PBMC，外周血單核細(xì)胞；PBMC，外周血單核 細(xì)胞；PBS，磷酸緩沖鹽水；PNGase F，肽N糖苷酶F ;RP-HPLC，反相高效液相層析；RT，室溫； Sia，唾液酸；UDP-Gal，尿苷二磷酸半乳糖；UDP-GlcNAc，尿苷二磷酸N-乙酰葡糖胺。
[0034] 定義
[0035] 術(shù)語(yǔ)"ADCC活性"表示依賴抗體的細(xì)胞毒性，且意指通過(guò)非致敏效應(yīng)細(xì)胞的抗體介 導(dǎo)的靶細(xì)胞破壞現(xiàn)象。靶細(xì)胞的特性可變，但它必須有具有能夠活化Fc受體的Fc結(jié)構(gòu)域 或Fc結(jié)構(gòu)域部分的已結(jié)合的表面免疫球蛋白G。效應(yīng)細(xì)胞是具有Fc受體的"殺傷"細(xì)胞。 它可以是例如缺乏常規(guī)B或T細(xì)胞標(biāo)記的淋巴細(xì)胞，或單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、或多核白細(xì)胞， 依賴于靶細(xì)胞的特性。反應(yīng)是不依賴補(bǔ)體的。本發(fā)明的抗體或其他含F(xiàn)c蛋白質(zhì)的ADCC活 性得到"增強(qiáng)"，如果它顯示ADCC介導(dǎo)的細(xì)胞殺傷能力超過(guò)由可替代宿主細(xì)胞產(chǎn)生的基本 上相似序列的抗體或蛋白質(zhì)和Fc結(jié)構(gòu)域的能力的話。ADCC活性可以在體內(nèi)或體外細(xì)胞殺 傷標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定中進(jìn)行測(cè)定，例如本文討論的測(cè)定。優(yōu)選地，具有增強(qiáng)的ADCC活性的本發(fā)明的 抗體在比可替代宿主細(xì)胞中產(chǎn)生的參考抗體更低的劑量下和/或更短的時(shí)間中達(dá)到相同 作用（預(yù)防或抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)）。優(yōu)選地，在本發(fā)明范圍內(nèi)的抗體和參考抗體效能之間的 差異是至少約1. 5倍、更優(yōu)選至少約2倍、甚至更加優(yōu)選至少約3倍、最優(yōu)選至少約5倍，如 例如通過(guò)在所選擇的標(biāo)準(zhǔn)鉻釋放ADCC測(cè)定中并行比較測(cè)定的。
[0036] 如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)"親和力"意指單個(gè)單價(jià)配體對(duì)于其關(guān)聯(lián)結(jié)合配偶體的結(jié)合 常數(shù)的量度，例如，F(xiàn)ab'對(duì)于抗原或表位的結(jié)合。親和力可以以幾種方法進(jìn)行測(cè)量，包括通 過(guò)例如等離振子共振（BiaCore)測(cè)量結(jié)合和解離速率（分別為MPk#)，并且表示為總體 結(jié)合（K ass)或解離常數(shù)（KD)，其中Kass是k。，。"，和KD是k。"九。K D也可以通過(guò)例如測(cè)量 在其下配體與結(jié)合配偶體的結(jié)合是半飽和的濃度憑經(jīng)驗(yàn)進(jìn)行測(cè)量。測(cè)量KD的另一種方法 是通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)測(cè)定，其中一種粘合劑或配體進(jìn)行標(biāo)記或加上標(biāo)簽，并且保持在恒定濃度下，而 測(cè)試粘合劑或配體以各種濃度加入，以從其關(guān)聯(lián)結(jié)合配偶體中競(jìng)爭(zhēng)走標(biāo)記的物質(zhì)，且測(cè)定 在其下標(biāo)記減少一半的濃度。
[0037] 如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)"抗體親抗原性"意指在配體和結(jié)合配偶體可以是多價(jià)的， 并且關(guān)于多個(gè)結(jié)合和解離事件的趨勢(shì)可以對(duì)于特定配體同時(shí)發(fā)生的范圍內(nèi)，配體保持與結(jié) 合配偶體結(jié)合的趨勢(shì)的量度。因此，抗體親抗原性可以通過(guò)具有已知親和力的結(jié)合配偶體 的多價(jià)構(gòu)象的表觀親和力中的增加進(jìn)行測(cè)量。
[0038] 如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)"含F(xiàn)c蛋白質(zhì)"或"含F(xiàn)c分子"指具有配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域以 及至少免疫球蛋白CH2和CH3結(jié)構(gòu)域的單體、二聚或異二聚蛋白質(zhì)。CH2和CH3結(jié)構(gòu)域可以 形成蛋白質(zhì)/分子（例如，抗體）的二聚區(qū)域的至少部分。
[0039] 術(shù)語(yǔ)"抗體"意欲包含抗體、其消化片段、特定部分及變體，包括但不限于，抗 體模擬物，或包含模擬抗體或其指定片段或部分的結(jié)構(gòu)和/或功能，并且保留Fc介導(dǎo) 的功能的抗體部分，包括但不限于：與Fc受體（例如Fc y RI (CD64) Fc y RIIA (CD32A)、 Fc y RIIIA(CD16A)和 FcRn)結(jié)合、結(jié)合補(bǔ)體（例如 Clq)、ADCC 和 CDC。
[0040] 如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)"單克隆抗體"是特定形式的含F(xiàn)c融合蛋白，其中配體結(jié)合 結(jié)構(gòu)域保留與至少一個(gè)動(dòng)物抗體種類的重或輕鏈抗體可變結(jié)構(gòu)域至少之一的相當(dāng)大同源 性。
[0041] 如本文所使用的，抗體或抗體類似物的"效應(yīng)子功能"是通過(guò)其病原體或異常細(xì)胞 例如腫瘤細(xì)胞被破壞且從體內(nèi)去除的過(guò)程。先天性和適應(yīng)性免疫應(yīng)答使用大部分相同的效 應(yīng)機(jī)理以消除病原體，包括ADCC、CA (補(bǔ)體激活）、Clq結(jié)合和調(diào)理作用。
[0042] 如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)"宿主細(xì)胞"指任何種類的細(xì)胞系統(tǒng)，其可以進(jìn)行工程改造 以產(chǎn)生目的蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)片段或肽，包括抗體和抗體片段。宿主細(xì)胞包括但不限于，培養(yǎng) 的細(xì)胞，例如哺乳動(dòng)物培養(yǎng)的細(xì)胞，例如CH0細(xì)胞、BHK細(xì)胞、NS0細(xì)胞、SP2/0細(xì)胞或雜交瘤 細(xì)胞，酵母細(xì)胞，和昆蟲(chóng)細(xì)胞，但也包含在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物或培養(yǎng)的組織內(nèi)的細(xì)胞。
[0043] 術(shù)語(yǔ)"唾液酸"指9-碳羧化糖家族的任何成員。唾液酸家族的最常見(jiàn)成員是N-乙 酰神經(jīng)氨酸（2-酮-5-乙酰氨基-3, 5-雙脫氧-D-甘油基-D-半乳糖吡喃型尤羅索-1-尼克 I 酸（galactononulopyranos-1-onic I acid)(通?？s寫(xiě)為 Neu5Ac、NeuAc 或 NANA)。該家 族的第二個(gè)成員是N-羥乙酰-神經(jīng)氨酸（NGNA、Neu5Gc或NeuGc)，其中NeuAc的N-乙?；?是羥基化的。這種形式在來(lái)自嚙齒類動(dòng)物和微生物來(lái)源的糖蛋白中是普遍的。第三個(gè)唾液 酸家族成員是2-酮-3-脫氧-尤羅索尼克酸（KDN) (Nadano等人（1986)J.Bi〇l.Chem. 261 : 11550-11557 ;Kanamori 等人，J. Biol. Chem. 265 :21811-21819 (1990))。還包括 9-取代的 唾液酸，例如9-0-C-C6?；鵑eu5Ac，如9-0-乳?；?Neu5Ac或9-0-乙?；?Neu5Ac、9-脫 氧 _9_氟-Neu5Ac和9疊氮基-9-脫氧-Neu5Ac。關(guān)于唾液酸家族的綜述，參見(jiàn)例如，Varki， Glycobiology 2:25-40(1992) ；Sialic Acids ：Chemistry, Metabolism and Function， R.Schauer，編輯（Springer Verlag，New York (1992))。
[0044] 描述
[0045] 鑒于本發(fā)明人已意外地發(fā)現(xiàn)Fc寡糖的唾液酸化水平改變重組產(chǎn)生的治療抗體對(duì) 于Fey受體的親和力，從而導(dǎo)致所述抗體生物作用的各個(gè)方面的調(diào)節(jié)。更具體而言，發(fā)現(xiàn) 高度唾液酸化的Abs已顯著減少對(duì)于低親和力受體Fc y RIIA(CD32A)和Fc y RIIIA(CD16A) 的親和力，并且在其中Fc y RIIIA被認(rèn)為是相關(guān)受體的體外ADCC測(cè)定中具有顯著減少的活 性。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)與脫唾液酸化或部分唾液酸化的含F(xiàn)c蛋白質(zhì)相比較，高度唾液酸化的Abs 對(duì)于高親和力Fc y受體Fc y RI (⑶64)具有增加的親和力，并且完全唾液酸化的含F(xiàn)c蛋白 質(zhì)具有減少的血清半衰期。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)唾液酸從Fc寡糖中的去除（或不存在或減少水平） 增強(qiáng)重組產(chǎn)生的治療抗體對(duì)于其靶分子的抗體親抗原性。這些發(fā)現(xiàn)和支持信息已在共同未 決的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?0/695, 769、60/809, 106、60/841，153中得到描述。
[0046] 盡管不希望受任何一種理論束縛，從寡糖中去除荷電靜止基團(tuán)可以解釋為允許總 體抗體結(jié)構(gòu)中更多的靈活度，所述靈活度對(duì)于在彼此關(guān)系中的2個(gè)結(jié)合結(jié)構(gòu)域賦予擴(kuò)大范 圍的潛在相互作用。