阿司咪唑、其鹽或溶劑合物在制備預(yù)防和/或治療惡性淋巴瘤的藥物中的用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及含有式（I)所示的阿司咪唑化合物（Astemizole)及 其藥物組合物在制備用于預(yù)防和/或治療惡性淋巴瘤的藥物中的用途，以及作為多梳抑制 復(fù)合物2的抑制劑的用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 阿司咪唑系第二代組胺Hl受體拮抗藥，具有吸收快、拮抗組胺受體作用強(qiáng)、持續(xù) 時(shí)間長等特點(diǎn)。息斯敏為該藥商品名之一，1983年率先在英國投入臨床使用，其上市初期的 適應(yīng)癥包括過敏性鼻炎、過敏性結(jié)膜炎、慢性蕁麻疹及其他過敏性疾病，為療效較好的抗過 敏藥物。但是由于其心臟毒性，目前很多國家已經(jīng)將阿司咪唑撤市。近年來，人們發(fā)現(xiàn)阿司 咪唑能夠通過拮抗鉀離子通道蛋白質(zhì)hEAGl抑制腫瘤細(xì)胞的生長。
[0003] 而大量研究表明，多梳抑制復(fù)合物2(PolycombRepressiveComplex2,即PRC2) 是多梳家族蛋白（PolycombGroup)的核心成員之一，具有組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶活性，可特異 性催化組蛋白H3第27位賴氨酸的三甲基化修飾（H3K27me3)，從而抑制特定基因的表達(dá)。 PRC2的甲基轉(zhuǎn)移酶活性來源于其催化成員EZH2,但是，由于其至少需要與PRC2的另外兩個(gè) 成員EED和SUZ12形成復(fù)合物后才能夠催化甲基化修飾，因此在僅EZH2存在時(shí)，PRC2無甲 基轉(zhuǎn)移酶催化活性。因此，EZH2、EED和SUZ12被認(rèn)為是PRC2復(fù)合物的核心組分。大量相 關(guān)研究結(jié)果表明，PRC2介導(dǎo)的H3K27me3修飾在胚胎發(fā)育、細(xì)胞命運(yùn)決定、X-染色體失活及 細(xì)胞增殖等多種重要生物學(xué)進(jìn)程中發(fā)揮者關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用。
[0004] 最近有研究發(fā)現(xiàn)，PRC2核心組分的活性異常與多種疾病，尤其是惡性腫瘤的發(fā)生、 發(fā)展及侵襲密切相關(guān)。具體而言，核心組分EZH2,EED以及SUZ12在多種惡性腫瘤如乳腺 癌、前列腺癌、肝癌、大腸癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、淋巴瘤等組織中表達(dá)水平顯著升高，而且，其過表 達(dá)水平與腫瘤的惡化程度及不良預(yù)后呈正相關(guān)性，由此被認(rèn)為是一種新型腫瘤標(biāo)志物。此 外，通過遺傳學(xué)方法如siRNA下調(diào)EZH2或其輔因子EED的表達(dá)水平，可以顯著抑制腫瘤細(xì) 胞的增殖和侵襲。因此，PRC2是導(dǎo)致多種惡性腫瘤發(fā)生及發(fā)展的關(guān)鍵驅(qū)動(dòng)因子。但是，相 關(guān)研究中尚無阿司咪唑針對(duì)PRC2或EZH2-EED蛋白-蛋白相互作用，以及用于腫瘤治療方 面的報(bào)道。
[0005] 彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤是一種最常見的成人非霍奇金惡性淋巴瘤，其發(fā)病率分布 情況如下，在歐美國家其發(fā)病率占全部非霍奇金惡性淋巴瘤約30%，在亞洲國家其發(fā)病率 通常在40%以上。該病多發(fā)于老年人，在中國以40-50歲患者居多。臨床主要表現(xiàn)為皮下 淋巴結(jié)迅速增大，并伴有骨髓轉(zhuǎn)移或淋巴結(jié)外病變，患者常出現(xiàn)發(fā)熱、盜汗、進(jìn)行性消瘦等 全身癥狀。彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤病程進(jìn)展迅速，如未能積極治療，中位生存期小于一年。 目前，根據(jù)其基因表達(dá)譜的差異，彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤主要分為生發(fā)中心B細(xì)胞淋巴瘤和 活化B細(xì)胞淋巴瘤兩大類，其中發(fā)病率較高的是生發(fā)中心B細(xì)胞淋巴瘤。
[0006] 研究發(fā)現(xiàn)，EZH2在成熟B細(xì)胞被抗原激活形成生發(fā)中心及抗體親和力成熟過程中 發(fā)揮重要作用。生發(fā)中心B細(xì)胞通過EZH2抑制DNA損傷修復(fù)系統(tǒng)和促進(jìn)分化基因的表達(dá)， 在細(xì)胞的快速分裂的同時(shí)進(jìn)行體細(xì)胞高頻突變，加速抗體親和力的成熟。同時(shí)，這種快速分 裂伴隨高頻突變的增殖方式也為生發(fā)中心B細(xì)胞淋巴瘤的發(fā)生發(fā)展提供有利條件。實(shí)驗(yàn)結(jié) 果表明，幾乎所有的彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤的細(xì)胞中均檢測(cè)到EZH2的過表達(dá)以及H3K27Me3 修飾水平增高。而H3K27的過度甲基化在加速生發(fā)中心B細(xì)胞的增殖的同時(shí)，抑制活化B 細(xì)胞向漿細(xì)胞的分化及凋亡。同時(shí)，對(duì)取自于彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤病人的標(biāo)本進(jìn)行RNA 測(cè)序，結(jié)果表明，約30%的生發(fā)中心B細(xì)胞淋巴瘤病人標(biāo)本中存在EZH2催化位點(diǎn)的致癌突 變，該突變改變了EZH2催化底物特異性，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞中H3K27的過度三甲基化。而通過 siRNA下調(diào)EZH2的表達(dá)水平，可以顯著抑制生發(fā)中心B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞的增殖。綜上所述， 由于過表達(dá)或突變導(dǎo)致EZH2活性異常是導(dǎo)致生發(fā)中心B細(xì)胞淋巴瘤發(fā)生的關(guān)鍵因素，EZH2 可以作為惡性淋巴瘤治療的新靶標(biāo)。
[0007] 當(dāng)前，臨床上對(duì)生發(fā)中心B細(xì)胞淋巴瘤病人的治療方法主要是聯(lián)合應(yīng)用多種細(xì)胞 毒性藥物（如聯(lián)合利妥昔單抗、環(huán)磷酰胺、多柔比星、長春新堿和潑尼松的R-CHOP療法）進(jìn) 行高密度化療。一方面，由于病人的平均發(fā)病年齡在50歲以上，對(duì)高強(qiáng)度化療藥物的耐受 性差，5年平均生存率不足50%。另一方面，由于針對(duì)特定疾病的高選擇性分子靶向藥物具 有副作用低、抗腫瘤活性好及病人耐受性高等特點(diǎn)，因此，分子靶向藥物已成為近幾十年來 藥物研究中比較熱衷的方向和領(lǐng)域。所以，發(fā)展選擇性EZH2小分子抑制劑，將為惡性淋巴 瘤的治療提供新策略。
[0008] 關(guān)于EZH2抑制劑的研究和開發(fā)已成為科研機(jī)構(gòu)和醫(yī)藥制造領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。在 2012年，多家制藥公司幾乎同時(shí)發(fā)現(xiàn)一類吡啶酮類EZH2高選擇性抑制劑，該類化合物直接 作用于EZH2催化位點(diǎn)，抑制其催化活性，并對(duì)其他甲基轉(zhuǎn)移酶有高度的選擇性。并通過進(jìn) 一步的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證明，該類化合物可以同時(shí)抑制含有野生型EZH2和突變型EZH2的生發(fā)中 心B細(xì)胞淋巴瘤的增殖，并對(duì)突變型細(xì)胞有一定的選擇性。該研究進(jìn)一步證實(shí)了，由于過表 達(dá)或突變而導(dǎo)致的EZH2活性異常是生發(fā)中心B細(xì)胞淋巴瘤發(fā)生的重要驅(qū)動(dòng)因素，同時(shí)也表 明靶向EZH2的小分子抑制劑在生發(fā)中心B細(xì)胞淋巴瘤治療中的積極作用。
[0009] 然而，一方面，由于EZH2抑制劑直接作用于其天然底物S-腺苷甲硫氨酸（SAM)的 結(jié)合位點(diǎn)，而人體內(nèi)超過50種的甲基轉(zhuǎn)移酶中都有類似的SAM結(jié)合口袋，因而，需要花費(fèi)大 量的實(shí)驗(yàn)資源去檢測(cè)化合物對(duì)其他同源蛋白的選擇性。另一方面，EZH2需要與EED和SUZ12 形成復(fù)合物后才能發(fā)揮催化活性，因而，通過抑制EZH2與其輔助蛋白（如EED)的相互作用 也可以抑制EZH2的催化活性。同時(shí)，由于EZH2蛋白-輔助蛋白相互作用位點(diǎn)的特異性遠(yuǎn) 高于其與SAM結(jié)合位點(diǎn)的特異性，故靶向蛋白-蛋白相互作用的位點(diǎn)抑制劑可以解決該化 合物的選擇性難題。2013年，哈佛醫(yī)學(xué)院的WoojinKim等人根據(jù)EZH2與EED的復(fù)合物晶體 結(jié)構(gòu)，設(shè)計(jì)合成了一種EZH2環(huán)肽類化合物（stapledpeptide)，選擇性抑制EZH2與EED的 結(jié)合，促進(jìn)PRC2多個(gè)組分的降解，進(jìn)而抑制其甲基轉(zhuǎn)移酶活性。相比EZH2抑制劑，該環(huán)肽 類化合物不僅對(duì)依賴EZH2催化活性的腫瘤細(xì)胞有殺傷作用，更重要的是，對(duì)一些雖然依賴 EZH2但是不依賴其甲基轉(zhuǎn)移酶活性的腫瘤細(xì)胞（如基底樣惡性乳腺癌、雄激素抵抗性惡性 前列腺癌等）具有明顯的增殖抑制作用，因而，極大地?cái)U(kuò)大了PRC2復(fù)合物抑制劑的應(yīng)用范 圍。然而，由于多肽類化合物通常存在細(xì)胞滲透能力低、代謝穩(wěn)定性差、制備昂貴等缺點(diǎn)，嚴(yán) 重制約了其在臨床上的使用。與此相反，小分子化合物具有通透性好、代謝穩(wěn)定性高、制備 難度低等特點(diǎn)，有效彌補(bǔ)了多肽類化合物的不足。因此，特異性靶向EZH2-EED相互作用的 高活性、高成藥性小分子抑制劑具有更廣闊的臨床應(yīng)用前景，可以為多種依賴于EZH2的惡 性腫瘤的治療提供有力的理論支撐。
[0010] 然而，目前存在的難題在于，該類藥物開發(fā)的難點(diǎn)是蛋白相互作用的界面表面積 大、溶劑化程度高且無明顯的配體結(jié)合腔。并且，通過與其他已有小分子抑制劑的PPI界面 比較，本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)EZH2-EED的結(jié)合界面具有更大的包埋面積和更強(qiáng)的親和力的 特點(diǎn)，其中，包埋面積為3000A2,解離常數(shù)約為100nM。上述特點(diǎn)增大了發(fā)現(xiàn)小分子抑制劑 的難度。目前，尚無針對(duì)EZH2-EED蛋白-蛋白相互作用的抑制劑的報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0011] 本發(fā)明的發(fā)明人為解決上述難題，針對(duì)EZH2-EED蛋白-蛋白相互作用界面，建立 多種化合物活性評(píng)價(jià)及確認(rèn)方法，對(duì)大量已上市的藥物進(jìn)行篩選，從中發(fā)現(xiàn)化合物阿司咪 唑可以特異性阻斷EZH2-EED之間的相互作用，破壞復(fù)合物形成，并加速PRC2核心組分的降 解，從而抑制PRC2甲基轉(zhuǎn)移酶活性。由此本發(fā)明的一個(gè)目的在于提供式（I)所示的阿司 咪唑、其藥學(xué)上可以接受的鹽或溶劑合物在制備預(yù)防和/或治療惡性淋巴瘤的藥物中的用 途：
[0012]
[0013] 優(yōu)選地，所述惡性淋巴瘤為生發(fā)中心B細(xì)胞淋巴瘤相關(guān)的疾病。
[0014] 另優(yōu)選地，所述惡性淋淋巴瘤包括霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤。
[0015] 本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供式（I)所示的阿司咪唑、其藥學(xué)上可以接受的鹽 或溶劑合物作為多梳抑制復(fù)合物2的抑制劑的用途。
[0016] 本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供式（I)所示的阿司咪唑、其藥學(xué)上可以接受的鹽 或溶劑合物作為EZH2-EED相互作用的抑制劑的用途。
[0017] 有益效果
[0018] 化合物阿司咪唑作為多梳抑制復(fù)合物2的抑制劑和EZH2-EED相互作用的抑制劑 能夠有效地抑制EZH2與其輔助蛋白（如EED)的相互作用，從而抑制PRC2的催化活性。進(jìn) 而有效地預(yù)防和治療與生發(fā)中心B細(xì)胞淋巴瘤相關(guān)的惡性淋巴瘤疾病。
【附圖說明】
[0019] 圖1.表示阿司咪唑抑制EZH2-EED相互作用的抑制曲線圖及抑制常數(shù)K1 ;
[0020] 圖2.表示不同形式的阿司咪唑鹽及非鹽形式化合物對(duì)EZH2-EED相互作用的抑制 線圖；
[0021] 圖3.表示阿司咪唑在提高EED蛋白熱穩(wěn)定性方面呈現(xiàn)出劑量依賴性關(guān)系；
[0022] 圖4?表示阿司咪唑與EED蛋白的親和力曲線和解離常數(shù)Kd ;
[0023] 圖5.表示在飽和轉(zhuǎn)移差