聚丙烯酰胺凝膠分散速溶固體組合物及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及聚丙烯酰胺凝膠技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及聚丙烯酰胺凝膠分散速溶固體組合物及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]在研究和診斷領(lǐng)域，聚丙烯酰胺凝膠是一種廣泛運(yùn)用的用于分離生物大分子如脫氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)、多肽、蛋白質(zhì)以及它們的復(fù)合物等的分離介質(zhì)。運(yùn)用此項(xiàng)技術(shù)的基本裝置為一個(gè)兩端開(kāi)口的細(xì)管或一個(gè)三明治型的兩塊平板。細(xì)管和平板用具有一定的支持強(qiáng)度的材質(zhì)制作，如玻璃和塑料等。首先將尚未凝固的聚丙烯酰胺溶液加入到上述形狀的模具中，待聚丙烯酰胺凝固成膠后，可將生物樣品加到凝膠的一端，凝膠的兩端分別加上正負(fù)極電極，使生物樣品分子在凝膠介質(zhì)中移動(dòng)。由于生物樣品分子的移動(dòng)速度不同，因而在一段時(shí)間后，不同移動(dòng)速度的生物分子就能被有效分開(kāi)。一般生物樣品分子或經(jīng)處理以后的生物樣品分子帶有負(fù)電荷，電泳過(guò)程中，它們從負(fù)極向正極移動(dòng)。
[0003]在一定電場(chǎng)下，生物分子在介質(zhì)上的移動(dòng)速率(泳動(dòng)速率)取決于生物分子本身的電荷/質(zhì)量比、生物分子的形狀和大小以及介質(zhì)的孔徑。針對(duì)確定的樣品，前兩者是生物分子本身的特征，一般不會(huì)改變。操作者可以改變電泳介質(zhì)的孔徑來(lái)影響生物分子的泳動(dòng)速率。聚丙烯酰胺凝膠的孔徑首先取決于凝膠體系中丙烯酰胺單體及交聯(lián)劑單體的總質(zhì)量-體積濃度，即所謂的丙烯酰胺單體溶液的總質(zhì)量-體積濃度，用％T表示，即％τ=(丙烯酰胺單體質(zhì)量+交聯(lián)劑單體質(zhì)量)(克)+溶液總體積(毫升)X100%。越高的％τ濃度，使形成的凝膠孔徑越小，適合用于分離小分子量的生物分子。越低的％τ濃度，使形成的凝膠孔徑越大，適合用于分離大分子量的生物分子。常用的分離生物分子的聚丙烯酰胺凝膠濃度為4%-30%不等。影響聚丙烯酰胺凝膠的另一個(gè)因素是交聯(lián)劑單體質(zhì)量占所有單體的質(zhì)量百分比，用％c表示，即％C=交聯(lián)劑單體質(zhì)量+ (丙烯酰胺單體質(zhì)量+交聯(lián)劑單體質(zhì)量)X 100%。在總的單體濃度(％τ)確定的情況下，使用越少的交聯(lián)劑(％c越小)獲得的凝膠孔徑越大，反之亦然。常用的用于核酸分子分離的凝膠的％c為5% ;用于蛋白分子分離的凝膠的％C為3.3%或2.6%或更低。此外還有其他一些原因可能會(huì)帶來(lái)孔徑大小的變化，如不完全的凝結(jié)和凝膠的水解等。
[0004]凝膠介質(zhì)中還含有用于調(diào)節(jié)pH值、離子強(qiáng)度等的緩沖液體系。一般用于核酸電泳，凝膠的緩沖液常為T(mén)AE (40mMTris-乙酸，lOmMEDTA)和TBE (90mM的Tris堿，90mM的硼酸和2mM的EDTA)。在非變性核酸電泳時(shí)，電泳過(guò)程保持在較低的溫度，以維持核酸的結(jié)構(gòu)，特別是用于分離核酸和蛋白質(zhì)復(fù)合物的時(shí)候。如要使得分離的核酸分子變性(雙鏈DNA解鏈；單鏈DNA和RNA 二級(jí)結(jié)構(gòu)解體)，常在緩沖體系中加入足量的變性劑，如尿素和甲酰胺等，并維持較高的電泳溫度。其它用于核酸電泳的緩沖液體系還有Tris/磷酸和Tris/雙甘氨肽等。電泳緩沖液也使用同樣成分的緩沖液，然而在核酸的變性電泳時(shí)，電泳緩沖液中常無(wú)需添加變性劑。
[0005]蛋白分子表面由于沒(méi)有大量的負(fù)電荷，大多數(shù)蛋白電泳都在變性條件下進(jìn)行，在此條件下，蛋白在上樣緩沖液中預(yù)先處理，使蛋白表面結(jié)合上大量帶負(fù)電荷的SDS (十二烷基硫酸鈉)分子基團(tuán)，能夠在電場(chǎng)力的驅(qū)動(dòng)下有效泳動(dòng)，即所謂的SDS-PAGE電泳。SDS-PAGE凝膠灌制的緩沖體系常用的是Laemmli體系(Laemmli, U.Κ.(1970) Nature,227，680-686.)。Laemmli體系包括分離膠和濃縮膠(也稱為積層膠)兩部分:分離膠的緩沖液為0.375M的Tris (用HC1滴定到ρΗ8.8)，濃縮膠的緩沖液為0.125Μ的Tris (用HC1滴定到ρΗ6.8)0正負(fù)極電泳緩沖液為0.024Μ的Tris，0.192M的甘氨酸和0.1%的SDS。另一種常用的緩沖液體系(Schaegger 體系)(Schaegger, H.andvanjagow，G., (1987) Anal.B1chem.166，368-379)為:濃縮膠緩沖液含0.75MTris, HC1滴定到ρΗ8.45 ;分離膠緩沖液含 0.9MTris，HC1 滴定到 ρΗ8.45 ;負(fù)極緩沖液為 0.lMTris 和 0.lMTricine，含 0.1%SDS。正極緩沖液為0.2MTris0其它緩沖液包括磷酸鹽緩沖體系、Bis-Tris緩沖體系、Tris-乙酸體系、雙甘氨酸肽-NaOH體系、PIPES-磷酸鈉體系、HEPES/MOPS/MES/Bicine_NaOH體系、M0PS-K0H體系等。如要在非變性條件下分離蛋白質(zhì)分子，則需在凝膠和緩沖液中忽略SDS。
[0006]傳統(tǒng)制備電泳用聚丙烯酰胺凝膠凝膠方法，都是先將所需試劑成水劑溶液，比如丙烯酰胺/交聯(lián)劑單體的水溶液和調(diào)節(jié)滴定好pH值及離子強(qiáng)度的緩沖水溶液，然后按照一定的比例混合成溶液，再添加氧化還原反應(yīng)催化劑混勻再進(jìn)行灌膠，在灌制后需要凝固才能作為有效的分離介質(zhì)。丙烯酰胺單體在催化劑存在的情況下可以聚合成長(zhǎng)的線性聚丙烯酰胺，如果體系中存在甲叉雙丙烯酰胺、1，4-二丙烯?；哙?、N，N’_雙(丙烯酰)胱胺、酒石酸雙丙烯酰胺或它們的混合物等交聯(lián)劑，則在這些線性聚丙烯酰胺之間，可以通過(guò)交聯(lián)劑形成橋連接體，由此構(gòu)成網(wǎng)狀聚丙烯酰胺。實(shí)驗(yàn)中一般使用過(guò)硫酸銨與N，N，N’，N’ -四甲基乙二胺(TEMED)組成的催化體系。由于上述兩種物質(zhì)均不穩(wěn)定，因此操作者可在凝膠配制前臨時(shí)加入新鮮上述試劑，即可使丙烯酰胺單體快速聚合。聚合后的聚丙烯酰胺即可用于電泳分離生物大分子等實(shí)驗(yàn)。
[0007]眾所周知，丙烯酰胺水溶液以及丙烯酰胺/交聯(lián)劑單體的水溶液不穩(wěn)定會(huì)緩慢水解，所以一般只能在2~8°C存放一周左右。丙烯酰胺的緩慢水解會(huì)使得凝膠電泳的分辨率和分離效果急劇下降。所以，聚丙烯酰胺凝膠一般都是現(xiàn)用現(xiàn)配。但是配制聚丙烯酰胺凝膠需要計(jì)算及稱量多個(gè)組分試劑的質(zhì)量以及體積，操作繁瑣、重復(fù)性差，性質(zhì)性能不穩(wěn)定、保存周期短，無(wú)法批量化操作，存在極大的損耗，使用成本高。由于目前的生命科學(xué)和醫(yī)學(xué)研究中極為常用，自制凝膠需要較多的時(shí)間，在此環(huán)節(jié)，廣大研究人員浪費(fèi)了大量的時(shí)間和精力。因此該應(yīng)用領(lǐng)域很需要一種可以大為縮減凝膠配制時(shí)間，而價(jià)格又相對(duì)低廉的產(chǎn)品。
[0008]可自由基聚合單體尤其是聚丙烯酰胺凝膠使用的丙烯酰胺有一定的毒性，對(duì)于人體有傷害。這些單體化合物對(duì)溫度和濕度的要求較高，在一定的溫度下容易熔化，添加可交聯(lián)單體會(huì)出現(xiàn)共熔聚合現(xiàn)象不利于形成混合物，同時(shí)也易吸潮降解，很難制成固體，所以現(xiàn)有的做法都是將丙烯酰胺制成聚丙烯酰胺凝膠液試劑。
[0009]目前，配制聚丙烯酰胺凝膠的時(shí)候，都是采用預(yù)先使用液體酸來(lái)滴定調(diào)節(jié)達(dá)到需要的膠緩沖區(qū)溶液pH值，廣泛使用的是強(qiáng)酸(如鹽酸、磷酸、乙酸等)滴定調(diào)節(jié)pH值。眾所周知，這些液體酸都是一種強(qiáng)酸，有強(qiáng)烈的腐蝕性，而且在空氣中發(fā)煙易揮發(fā)，需要煙室和其他警示設(shè)施，很難應(yīng)用于粉末、顆粒成型工藝和壓片制備工藝，并且調(diào)節(jié)pH值是一個(gè)繁瑣而且不穩(wěn)定的過(guò)程，操作比較麻煩。。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010]本發(fā)明的目的就是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的不足而提供一種能夠快速灌制聚丙烯酰胺凝膠、同時(shí)容易成型、可長(zhǎng)時(shí)間保存的聚丙烯酰胺凝膠分散速溶固體組合物，其操作簡(jiǎn)單方便、性質(zhì)性能穩(wěn)定、存儲(chǔ)方便、保存周期長(zhǎng)，同時(shí)還分別提供這種聚丙烯酰胺凝膠分散速溶固體組合物粉劑、顆粒劑和片劑的制備方法，制備工藝簡(jiǎn)單、劑量準(zhǔn)確，可以批量規(guī)?；a(chǎn)使得聚丙烯酰胺凝膠更加穩(wěn)定可靠、批間差更小、重復(fù)性更好、成本更低。
[0011 ] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是:
聚丙烯酰胺凝膠分散速溶固體組合物，包括以下組分:含丙烯酰胺的可自由基聚合單體、可交聯(lián)單體、制膠緩沖劑、pH調(diào)節(jié)劑以及固體成型輔料。固體成型輔料選自水溶性填料、崩解劑、粘結(jié)劑中的一種或者多種的組合，優(yōu)先地，固體成型輔料各組分的重量比為:水溶性填料30~99.9%、崩解劑0~70%、粘結(jié)劑0.1-20%0
[0012]優(yōu)選的，聚丙烯酰胺凝膠分散速溶固體組合物包括以下重量份的組分:
含丙烯酰胺的可自由基聚合單體30~80份
可交聯(lián)單體1~20份制膠緩沖劑3~50份 pH調(diào)節(jié)劑0.1-10份固體成型輔料5~40份。
[0013]所述含丙烯酰胺的可自由基聚合單體為非離子型水溶性乙烯基單體，含丙烯酰胺的可自由基聚合單體為單體丙烯酰胺、(甲基)丙烯酰胺、甲基(甲基)丙烯酰胺、羥甲基(甲基)丙烯酰胺、N-乙基(甲基)丙烯酰胺、N-異丙基丙烯酰胺(甲基)、N，N- 二甲基(甲基)丙烯酰胺、N，N-二乙基(甲基)丙烯酰胺、羥甲基(甲基)丙烯酰胺、羥(甲基)丙烯酰胺、丙烯酸(甲基)丙烯酸酯、羥丙基(甲基)丙烯酰胺、乙二醇單(甲基)丙烯酸酯、N-乙烯基咔唑、N-乙烯基丁二酰亞胺、N-乙烯基甲酰胺、N-乙烯基吡咯烷酮、乙酰胺或雙丙酮丙烯酰胺。
[0014]所述可交聯(lián)單體為亞甲基雙丙烯酰胺、(聚)乙二醇二(甲基)丙烯酸酯、哌嗪雙丙烯酰胺或酒石酸酰胺的交聯(lián)單體。
[0015]所述pH調(diào)節(jié)劑為固體酸試劑，pH調(diào)節(jié)劑選自天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、羥基乙酸、?；撬帷幟仕?、抗壞血酸、酒石酸、乳酸、馬來(lái)酸、蘋(píng)果酸、富馬酸、己二酸和琥珀酸中的一種或者多種的組合。
[0016]制膠緩沖劑可以是一種或者是多種化合物的組合，以能夠使得聚丙烯酰胺凝膠能夠進(jìn)行電泳分離為佳。制膠緩沖劑包括一種或者多種生物緩沖液試劑組合，可以進(jìn)一步包括一種或者多種氨基酸的兩性電解質(zhì)，還可以更進(jìn)一步包括表面活性劑和染料。生