轉(zhuǎn)移抑制劑的制作方法
【專利說明】轉(zhuǎn)移抑制劑
[0001] 相關(guān)申請的交叉引用
[0002] 本專利要求申請日為2013年4月5日的美國臨時(shí)申請?zhí)?1/808,966的優(yōu)先權(quán)，其在 此通過提述W其整體并入。 發(fā)明領(lǐng)域
[0003] 本專利設(shè)及包含抗體、核酸分子、多核巧酸和膚的組合物和制劑，W及它們用于預(yù) 防和治療轉(zhuǎn)移性癌癥，特別是用于降低、阻遏、或抑制癌細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移和/或血管生成的方 法。
[0004] 對電子提交文本的說明
[000引隨此一道電子提交的文本文件內(nèi)容再次通過提述W其整體并入:序列表的計(jì)算機(jī) 可讀形式拷貝（文件名:BMRK_006_0 lW0_SubSeqLi St_ST25. txt，數(shù)據(jù)記錄于2014年4月4日， 文件大小:58千字節(jié)）。
[0006] 發(fā)明背景
[0007] MARCKS蛋白（肉豆違酷化的富丙氨酸C激酶底物)是蛋白激酶C(PKC)的普遍存在的 憐酸化祀標(biāo)化i等，Journal Of Biological Chemistry 276;40982(2002))eMARCKS具有S 個(gè)進(jìn)化保守區(qū)（Aderem等，化ture 1988; 332: 362-364; Ilielen等，化ture 1991; 351: 320-322;化rtwig等，化ture 1992;356:618-622;Seykora等J Biol ^eml996;271:18797-18802):N末端、憐酸化位點(diǎn)域(或PSD，也稱為效應(yīng)器域）、和多同源性2(MH2)域。N末端是包 含24個(gè)氨基酸具有經(jīng)酷胺鍵連接至N末端甘氨酸殘基的肉豆違酸部分的a-氨基酸序列，其 設(shè)及MARCKS對細(xì)胞中的膜的結(jié)合（S巧kora等J Biol化em 1996;271:18797-18802)并且 可能與巧調(diào)蛋白結(jié)合(Matsubara等J Biol Chem 2003;278:48898-48902)。此24個(gè)氨基酸 的序列稱為MANS膚。MANS膚和相關(guān)膚公開于美國專利號(hào)7，265，088; 7，529，926; 7，544，772; 8,492,518;8,501，911;7,918,293,870;和8,563,689中，各文件的全部內(nèi)容通過提述^其 整體并入。
[0008] 本領(lǐng)域中需要新的安全的療法來預(yù)防、治療和抑制癌癥，包括抑制癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移、癌 細(xì)胞增殖、腫瘤生長、和/或血管生成。本發(fā)明解決了運(yùn)些和其他的需求。
[0009] 發(fā)明概述
[0010] 本發(fā)明設(shè)及對于預(yù)防或治療癌癥有用的方法和組合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，提供 了用于抑制癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移、癌細(xì)胞增殖、腫瘤生長、或血管生成的方法和組合物。在一個(gè)實(shí)施 方案中，提供了用于抑制癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移、癌細(xì)胞增殖、腫瘤生長、或血管生成的方法和組合物， 包括對肉豆違酷化的富丙氨酸C激酶底物(MARCKS)的抑制。在一個(gè)實(shí)施方案中，組合物包含 MARCKS-抑制性化合物，包括膚、多膚、抗體或其片段、W及核酸分子如反義多核巧酸、適配 體(aptamer)、小干擾RNA(SiRNA)、微小RNA(miRNA)、和短發(fā)夾RNA(ShRNA)。本申請所用的 "MARCKS-抑制性核酸分子"指的是降低MARCKS的表達(dá)和/或功能的多核巧酸或核酸分子如 siRNA、miRNA、shRNA、或反義多核巧酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述組合物包含一個(gè)或多個(gè) MARCKS相關(guān)的膚。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述MARCKS相關(guān)的膚對應(yīng)于MARCKS的MH2域。在另 一個(gè)實(shí)施方案中，所述膚是肉豆違酷化的N末端序列(MANS膚，其是MARCKS的24個(gè)氨基酸的 片段)相關(guān)的膚（即"MANS相關(guān)的膚"）。在又一個(gè)實(shí)施方案中，MANS相關(guān)的膚選自下組:MANS 膚;未取代的MANS片段，其含有四個(gè)或更多氨基酸且包含與MANS膚中N末端氨基酸序列中所 發(fā)現(xiàn)的相同的序列；包含與MANS膚或MANS膚片段中所發(fā)現(xiàn)的序列基本上相同的序列的膚； MANS膚或MANS膚的片段，其具有與MANS膚完全相同或基本上相同的氨基酸序列，其進(jìn)行了N 末端肉豆違酷化或例如W乙酷基進(jìn)行了 N末端乙酷化;和MANS膚或MANS膚的片段，其具有與 MANS膚完全相同或基本上相同的氨基酸序列，其C末端經(jīng)化學(xué)修飾。在一個(gè)實(shí)施方案中， MANS相關(guān)的膚是N末端和C末端都被化學(xué)修飾的。在一個(gè)實(shí)施方案中，本申請?zhí)峁┑腗ARCKS-抑制性化合物是抗體或其片段。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗體或其片段抑制MARCKS蛋白的 功能。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗體或其片段結(jié)合至MARCKS蛋白的N末端或MARCKS蛋白的 MH2序列。我們令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，使用不同類型的MARCKS-抑制性化合物顯示出對癌細(xì)胞體 外遷移的抑制效果，并抑制體內(nèi)轉(zhuǎn)移。在一個(gè)實(shí)施方案中，MARCKS-抑制性化合物展示出對 侵襲性癌細(xì)胞系的遷移的抑制效果。在一個(gè)實(shí)施方案中，本申請?zhí)峁┑腗ARCKS-抑制化合物 抑制哺乳動(dòng)物的腫瘤中癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。在又一個(gè)實(shí)施方案中，所述腫瘤是實(shí)體瘤。在另一個(gè) 實(shí)施方案中，所述腫瘤是非實(shí)體瘤。在一個(gè)實(shí)施方案中，本申請?zhí)峁┑腗ARCKS-抑制化合物 抑制與淋己瘤或白血病相關(guān)的癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。
[OOU] 在一個(gè)實(shí)施方案中，MARCKS-抑制性化合物包括MARCKS-抑制性多核巧酸或 MARCKS-抑制性核酸分子。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，所述MARCKS-抑制性化合物是抑制 MARCKS表達(dá)和/或功能的反義1?酷、311?酷、3111?酷、或微小1?酷多核巧酸。在一個(gè)實(shí)施方案中， MARCKS-抑制性化合物是調(diào)節(jié)MARCKS表達(dá)的蛋白或多核巧酸的模擬物，例如miR21的模擬 物。
[0012] 在一個(gè)實(shí)施方案中，MRCKS-抑制性化合物是MRCKS相關(guān)的或MANS相關(guān)的膚。在另 一個(gè)實(shí)施方案中，MARCKS相關(guān)的膚對應(yīng)于MARCKS的N末端肉豆違酷化的域。因此，在一個(gè)實(shí) 施方案中，MARCKS相關(guān)的膚是MANS相關(guān)的膚。在一個(gè)實(shí)施方案中，MANS相關(guān)的膚和一些經(jīng)化 學(xué)修飾的MANS相關(guān)的膚阻遏侵襲性癌細(xì)胞系的遷移。在一個(gè)實(shí)施方案中，MANS相關(guān)的膚用 于對癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移發(fā)揮抑制性效果。在一個(gè)實(shí)施方案中，MRCKS-抑制性化合物展現(xiàn)出對癌 細(xì)胞體內(nèi)轉(zhuǎn)移的阻遏效果。抑制轉(zhuǎn)移性疾病的體內(nèi)位點(diǎn)包括至少肺組織、屯、臟組織、脾組 織、腸組織、和隔膜組織。在一個(gè)實(shí)施方案中，MANS相關(guān)的膚用于治療或預(yù)防癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移、癌 細(xì)胞增殖、腫瘤細(xì)胞生長、或血管生成。
[0013] 在一個(gè)方面，提供了用于治療或預(yù)防癌癥的組合物和方法，包括將MARCKS-抑制性 化合物施用于癌細(xì)胞或在癌細(xì)胞的發(fā)育、維持、增殖或轉(zhuǎn)移中起作用的細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方 案中，提供了用于抑制癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的方法，包括對癌細(xì)胞施用轉(zhuǎn)移抑制量的MARCKS-抑制性 化合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，提供了用于抑制癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的方法，包括對癌細(xì)胞施用轉(zhuǎn)移抑 制量的MANS相關(guān)的膚。在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了用于在腫瘤中抑制癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的方法， 包括對癌細(xì)胞施用轉(zhuǎn)移抑制量的膚，所述膚具有選自下組的氨基酸序列：SEQ ID N0:1至 沈Q ID NO:231(含）、沈Q ID NO:234、和沈Q ID NO:235;其中所述膚序列的N末端和/或C末 端氨基酸任選地經(jīng)化學(xué)修飾。在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了用于在對其有需要的受試者中 治療癌癥的方法，所述方法包括對所述受試者施用治療有效量的MANS相關(guān)的膚。在另一個(gè) 實(shí)施方案中，提供了用于在對其有需要的受試者中治療癌癥的方法，所述方法包括對所述 受試者施用治療有效量的膚，所述膚具有選自下組的氨基酸序列：SEQ ID N0:1至SEQ ID NO :231(含）、SEQ ID NO :234、和SEQ ID NO :235;其中所述膚序列的N末端和/或C末端氨基 酸任選地經(jīng)化學(xué)修飾。
[0014] 在一個(gè)實(shí)施方案中，所述膚的N末端氨基酸通過膚的N末端氨基酸酷化而被化學(xué)修 飾，所述酷化呈選自下組的酷胺的形式：
[0015] -C2(乙酷基)至C24脂肪族簇酸的酷胺，所述脂肪族簇酸可W是線性的、分枝的、飽 和的、或不飽和的，
[0016] -S氣乙酸的酷胺，
[0017] ?苯甲酸的酷胺，和
[0018] ? Cl至C24脂肪族烷基橫酸的酷胺;或者
[0019] ?所述膚的N末端氨基酸的N末端胺基可用選自下組的基團(tuán)烷基化：
[0020] ? Cl至C24脂肪族烷基基團(tuán)，
[0021 ].線性2-(打至C24脂肪族烷基)氧乙基基團(tuán)，
[002引 ? CO-甲氧基-聚化締氧基)n-乙基基團(tuán)，其中n為0至10。
[0023] 在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，所述N末端酷胺選自乙酷基和肉豆違酷基。
[0024] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述膚的C末端氨基酸是經(jīng)化學(xué)修飾的，所述化學(xué)修飾通過 在膚的C末端氨基酸的C末端簇酸基團(tuán)處形成酷胺而進(jìn)行，所述酷胺呈選自下組的酷胺形 式：
[00巧]?氨的酷胺，
[0026] ? Cl至C24脂肪族烷基胺的酷胺，
[0027] ?徑基取代的C2至C24脂肪族烷基胺的酷胺，
[002引 ?線性2-(打至C24脂肪族烷基)氧乙基胺基團(tuán)的酷胺，和
[0029] ? CO-甲氧基-聚化締氧基)n-乙胺基團(tuán)的酷胺，其中n為0至10。
[0030] 在一個(gè)實(shí)施方案中，分別提供了用于抑制癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的方法，或用于治療癌癥的 方法，包括對癌細(xì)胞或受試者施用MANS相關(guān)的膚。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述膚選自下組:N-肉豆違酷-GAQFSKTAAKGEAAAERPGEAAVA ( SEQ ID N 0 : 1 ) ; N - 肉豆違酷-GAQFSKTAAKGEAAAERPGEAAパ沈QIDNo:2);N-肉豆違酷-GAQFSKTAAKGEAAAERPGEAA(SEQID No:4);N-肉豆違酷-GAQFSKTAAKGEAAAERPGEA(SEQ ID No:7);N-肉豆違酷-GAQFSKTAAKGEAAAERPGE(SEQ ID No:ll);N-肉豆違酷-GAQFSKTAAKGEAAAERPG(SEQ ID No: 16) ;N-肉豆違酷-GAQFSKTAAKGEAAAERP(SEQ ID No:22) ;N-肉豆違酷-GAQFSKTAAKGEAAAER (SEQ ID No:29);N-肉豆違酷-GAQFSKTAAKGEAAAE(SEQ ID No:37);N-肉豆違酷-GAQFSKTAAKGEAAA(SEQ ID No:46);N-肉豆違酷-GAQFSKTAAKGEAA(SEQ ID No:56);N-肉豆 違酷-GAQFSKTAAKGEA(沈Q ID No:67);N-肉豆違酷-GAQFSKTAAKGE(SEQ ID No:79);N-肉豆 違酷-GAQFSKTAAKG(SEQIDNo:92);N-肉豆違酷-GAQFSKTAAK(SEQIDNo:106);N-肉豆違 酷-GAQFSKTAA(SEQIDNo:121);N-肉豆違酷-GAQFSKTA(沈QIDNo:137);N-肉豆違酷-GAQFSKT(SEQIDNo:154);N-肉豆違酷-GAQFSK(SEQIDNo:172)，N-肉豆違酷-GAQFS(沈Q IDNo:191)，N-肉豆違酷-GAQF(SEQIDNo:211)，N-乙酷-RGAQFSKTAAK(SEQIDNo:2：M)， N-乙酷-RGAQFSKTAAK-N肥（沈Q ID No:2：M)，N-乙酷-RAKGE(沈Q ID N0:235)，及其組合。 [0031 ] 在一個(gè)實(shí)施方案中，所述膚選自下組:N-乙酷-GAQFSKTAAK(SEQ ID No:106;BI0- 11006);N-肉豆違酷-AKGE(沈Q ID No:219;BI0-91200);N-肉豆違酷-GAQFSKTAAK-N肥（沈Q ID No:106;BI0-11002);N-肉豆違酷-GAQFSKTAAK(沈Q ID No:106;BI0-11000);N-乙酷-GAQFSKTAA(SEQIDNo:121;BI0-10901);N-肉豆違酷-GAQFSKTAAK(SEQIDNo:121;BI0-10900);和N-乙酷-GAQFSKTAAK-N肥（沈Q ID No:106)。在一個(gè)實(shí)施方案中，一些氨基酸Wd-構(gòu)象存在。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，所述膚是N-乙酷-GAQFS(c〇KTAA(c〇K(SEQ ID N0:106; BIO-11037)，其中在所述膚的位置6和10處的賴氨酸化)是d-構(gòu)象的。
[0032] 在一些實(shí)施方案中，MANS相關(guān)的膚展示出能使其適于在治療應(yīng)用中，例如在癌癥 的治療中使用的特性。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，本申請公開的一些MANS相關(guān)的膚展示出相 對于(除MANS相關(guān)的膚W外的）一種或多種MANS膚增強(qiáng)的溶解性。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本 申請?zhí)峁┑囊恍㎝ANS相關(guān)的膚在血漿中展現(xiàn)出比（除MANS相關(guān)的膚W外的）一種或多種 MANS膚更長的半衰期。
[0033] 在一個(gè)實(shí)施方案中，MARCKS相關(guān)的膚展現(xiàn)出降低的癌細(xì)胞遷移。例如，在一個(gè)實(shí)施 方案中，用mans相關(guān)的膚（例如BI0-11006、BI011002、BI010901、BI010900、BI011000、或 BI0-91200)預(yù)處理癌細(xì)胞，在W約IOwii膚至約200WI1膚預(yù)處理細(xì)胞;或W約20皿至約200皿 預(yù)處理細(xì)胞;或W約25WI1膚至約75WI1膚預(yù)處理細(xì)胞時(shí)，降低癌細(xì)胞的遷移。在一個(gè)實(shí)施方案 中，當(dāng)W約化M至約500yM、約扣M至約250測、或約IOiiM至約200測的濃度施用時(shí)，所述MARCKS 相關(guān)的膚展示出降低的癌細(xì)胞遷移。在一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)W約化M、約扣M、約lOiiM、約25y M、約50yM、約1 OOiiM、約150yM、約200yM、或約SOOiiM的濃度施用時(shí)，所述MARCKS相關(guān)的膚展示 出降低的癌細(xì)胞遷移。在一個(gè)實(shí)施方案中，在體外用所述膚處理癌細(xì)胞W確定膚的效果。在 一個(gè)實(shí)施方案中，癌細(xì)胞來源于患者。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，在體外用所述膚處理癌細(xì)胞 W確定患者是否很可能響應(yīng)于膚的治療。
[0034]在一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)W約O.Olmg/kg/天至約lOmg/kg/天的濃度施用于患者時(shí)， MRCKS相關(guān)的膚展現(xiàn)出降低的癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，當(dāng)W約O.lmg/kg/天至 約5.Omg/kg/天的濃度施用于患者時(shí)，MARCKS相關(guān)的膚展現(xiàn)出降低的癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移。在更進(jìn)一 步的實(shí)施方案中，當(dāng)W約0.5mg/kg/天至約2.5mg/kg/天的濃度施用于患者時(shí)，MARCKS相關(guān) 的膚展現(xiàn)出降低的癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移。例如，當(dāng)W約0.01、約0.05、約0.1、約0.5、約0.75、約1.0、約 1.25、約1.5、約1.75、約 2.0、約 2.25、約 2.5、約 2.75、約 3.0、約 3.5、約 4.0、約 5.0、約