Agpat9基因在制備治療肝癌藥物、診斷及預(yù)后評估試劑中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及基因在抗腫瘤藥物制備和診斷試劑盒生產(chǎn)的應(yīng)用領(lǐng)域，具體涉及 AGPAT9基因在制備治療腫瘤特別是肝癌的藥物和生產(chǎn)腫瘤診斷試劑盒中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 原發(fā)性肝細(xì)胞肝癌（簡稱肝癌）是一種常見腫瘤，其發(fā)病率在全世界范圍內(nèi)排第 五，每年大概有100萬人新發(fā)肝癌;肝癌的死亡率在腫瘤致死率中位列第三，每年因為肝癌 而死亡的人口在70萬左右。肝癌的分布具有明顯的地區(qū)差異，我國屬于高發(fā)地區(qū)，每年肝癌 的死亡病例約為30萬。研究顯示，近二十年來肝癌的發(fā)病率在我國呈上升趨勢，其在九大惡 性腫瘤死亡率的排名中已從第三位上升到第二位。由于肝癌發(fā)病隱匿，病人首診往往已屬 中晚期且伴有肝硬化，手術(shù)切除率僅為5%~10%。盡管肝癌的臨床研究在近十多年中已取 得長足的進展，但肝癌五年生存率仍非常低而且復(fù)發(fā)率高，術(shù)后5年復(fù)發(fā)率仍高達(dá)60%以 上。肝細(xì)胞癌的高發(fā)病率、高死亡率及其逐年增高的趨勢，已成為一個極其嚴(yán)重的國際衛(wèi)生 問題。由此可見，單靠臨床研究來提高肝癌病人的生存率和降低復(fù)發(fā)率是不夠的。
[0003] 近年來隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，分子靶向治療成為肝癌治療的新方向。分子 靶向治療藥物通過特異性阻斷干預(yù)關(guān)鍵基因和重要的信號傳導(dǎo)通路發(fā)揮抑癌作用，具有特 異性強，療效顯著，不良反應(yīng)小等優(yōu)點，為肝癌臨床診斷、治療和預(yù)后提供了嶄新的方法和 手段。因此，采用先進的分子生物學(xué)技術(shù)，通過深入了解肝癌發(fā)生發(fā)展的分子機制，篩選、鑒 定出重要的靶分子，為開發(fā)肝癌靶向治療藥物，以及肝癌的基因早期診斷、基因個性化治療 和預(yù)后評估提供理論基礎(chǔ)，從而可望提高肝癌病人的生存率。
[0004] AGPAT9基因，全名叫 1-acylglycerol-3-phosphate-〇_acyltransferase 9，在美 國國家生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information)基因庫的 登錄號為NM_032717.4,位于人類染色體4q21.23,是溶血磷脂酸?；D(zhuǎn)移酶(LPAAT)家族成 員之一。AGPAT9基因于2003年從肺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)基因中分離鑒定，之后的研究證實其與肺癌 組織的惡性表型密切相關(guān)。AGPAT9基因的表達(dá)和功能研究在其它腫瘤中尚未見報道。
[0005] 肝癌和肺癌的發(fā)病機制及腫瘤相關(guān)基因變化有較大差異。一般而言，用于肺部腫 瘤的研究結(jié)論在肝癌中并不適用?，F(xiàn)階段，未有研究表明AGPAT9基因與肝癌相關(guān)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于提供AGPAT9基因在制備治療肝癌藥物、診斷及預(yù)后評估試劑中 的應(yīng)用。
[0007] 發(fā)明人在腫瘤研究中發(fā)現(xiàn)，AGPAT9基因在肝癌中發(fā)生了高頻率的遺傳變異一一 DNA擴增，基因轉(zhuǎn)錄的mRNA和蛋白明顯升高，結(jié)合臨床資料分析發(fā)現(xiàn)，其表達(dá)高低與病人預(yù) 后密切相關(guān)。
[0008] 發(fā)明人對AGPAT9基因進行了體外細(xì)胞功能學(xué)的研究，將靶向抑制AGPAT9基因的 siRNA轉(zhuǎn)染到Hep-3B細(xì)胞中瞬時敲降A(chǔ)GPAT9蛋白的表達(dá)之后，其生長速度、克隆形成能力及 細(xì)胞侵襲能力等均顯著下降，并且該基因能使細(xì)胞阻滯于G0/G1期。構(gòu)建AGPAT9 shRNA載體 并轉(zhuǎn)染具有高致瘤性和轉(zhuǎn)移能力的MHCC-97H肝癌細(xì)胞系中，建立穩(wěn)定敲降A(chǔ)GPAT9的細(xì)胞 系。動物實驗研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，敲降A(chǔ)GPAT9可顯著降低裸鼠皮下移殖瘤形成的數(shù)目和大小;細(xì) 胞經(jīng)尾靜脈注射入裸鼠體內(nèi)后，結(jié)果發(fā)現(xiàn)敲降A(chǔ)GPAT9可顯著降低肺轉(zhuǎn)移灶形成。因此，發(fā)明 人的體內(nèi)外實驗結(jié)果證實AGPAT9在肝癌中起著促癌促轉(zhuǎn)移的作用。因此，可以合成或制作 此基因的抑制物，作為肝癌潛在的靶向治療藥物；由于該基因在肝癌中有DNA擴增和mRNA及 蛋白表達(dá)升高，故可制作檢測該基因 DNA變異和表達(dá)變化的試劑盒以用于診斷肝癌；由于該 基因表達(dá)的降低與病人預(yù)后密切相關(guān)，故檢測其表達(dá)水平變化的試劑盒也可用于其預(yù)后的 評估，以指導(dǎo)臨床的治療。
[0009] 通過檢測肝癌病人中AGPAT9基因的DNA擴增和表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)AGPAT9基因發(fā)生了 高頻率的DNA擴增，而且其mRNA和蛋白的表達(dá)也明顯升高，因此，二者均可作為肝癌的診斷 標(biāo)志；該基因 mRNA和蛋白的表達(dá)水平與肝癌的預(yù)后明顯相關(guān)，即可作為診斷之用也可作為 其預(yù)后的評價指標(biāo)。同時，對AGPAT9基因進行細(xì)胞功能學(xué)的研究，發(fā)現(xiàn)干擾AGPAT9基因表達(dá) 后，肝癌細(xì)胞生長速度減慢、細(xì)胞周期阻滯、克隆形成能力和細(xì)胞侵襲能力等均顯著下降； 動物實驗證實裸鼠移殖瘤的形成和肺轉(zhuǎn)移灶均顯著減少。因此，該基因的細(xì)胞生物學(xué)功能 研究為制備基因藥物和靶向藥物提供了依據(jù)。本發(fā)明不僅在基因遺傳、轉(zhuǎn)錄(mRNA)和翻譯 (蛋白）三個水平上也在細(xì)胞生物學(xué)功能方面為制備治療腫瘤的新藥物和診斷及預(yù)后評估 試劑盒的開發(fā)提供了基礎(chǔ)。
【附圖說明】
[0010] 圖1是27例肝癌組織AGPAT9基因的拷貝數(shù)變化情況； 圖2是51對肝癌組織和癌旁組織AGPAT9基因 mRNA水平的表達(dá)情況； 圖3是AGPAT9蛋白表達(dá)與226例肝癌患者預(yù)后的關(guān)系； 圖4是Western blot驗證在肝癌細(xì)胞系中的AGPAT9敲降效果； 圖5是肝癌細(xì)胞中AGPAT9表達(dá)受siRNA抑制后，細(xì)胞增殖速度變慢； 圖6是肝癌細(xì)胞中AGPAT9表達(dá)受siRNA抑制后，細(xì)胞的G1期細(xì)胞比例增加，G2/M期細(xì)胞 比例減少顯著下調(diào)，提示細(xì)胞周期阻滯； 圖7是肝癌細(xì)胞中AGPAT9表達(dá)受siRNA抑制后，細(xì)胞的克隆形成能力降低； 圖8是肝癌細(xì)胞中AGPAT9表達(dá)受s i RNA抑制后，細(xì)胞的侵襲能力降低； 圖9是肝癌細(xì)胞MHCC-97H穩(wěn)定敲降A(chǔ)GPAT9表達(dá)后，細(xì)胞注射于裸鼠皮下，形成的移殖瘤 數(shù)目和大小顯著減少； 圖10是肝癌細(xì)胞MHCC-97H穩(wěn)定敲降A(chǔ)GPAT9表達(dá)后，細(xì)胞經(jīng)尾靜脈注射后，在裸鼠體內(nèi) 的轉(zhuǎn)移能力降低。
【具體實施方式】
[0011]下面結(jié)合實驗數(shù)據(jù)，進一步說明本發(fā)明的技術(shù)方案。
[0012 ] 實時熒光定量PCR (qPCR)檢測AGPAT9基因 DNA拷貝數(shù) 提取肝癌及癌旁組織DNA，實時定量PCR方法擴增AGPAT9基因片段，采用的引物序列見 表1:本實驗所需的探針，引物由廣州英俊公司合成。qPCR試劑盒購自美國Invitrogen公司。 [0013]表1:檢測AGPAT9DNA拷貝數(shù)變化所使用的引物
引物采用引物設(shè)計軟件Primer Premier5.0設(shè)計，引物設(shè)計確保跨內(nèi)含子，以避免殘留 mRNA的干擾。在NCBI網(wǎng)站上對所有引物序列進行BLAST比對，確定引物序列不與人類其他基 因同源。
[0014]定量PCR擴增體系的組成如表2所示。
[0015]表2:定量PCR擴增體系成份
擴增反應(yīng)包括：95 °C變性30秒，60 °C退火及延伸1分鐘，共45個循環(huán)反應(yīng)。應(yīng)用ABI PRISM7900Sequence Detector序列檢測系統(tǒng)對反應(yīng)產(chǎn)物進行實時定量測定和融解曲線分 析，分別設(shè)2個復(fù)孔。內(nèi)參用Line-Ι，以標(biāo)準(zhǔn)曲線法算出內(nèi)參及目的基因的相對表達(dá)值(倍比 稀釋正常人血gDNA，定量PCR擴增后，以CT值來計算標(biāo)準(zhǔn)曲線），以內(nèi)參作為基準(zhǔn)進行校正， 得出目的基因與內(nèi)參的比值L2份正常人粒細(xì)胞提取genomic DNA作為正常對照標(biāo)本。以正 常對照標(biāo)本中目的基因與內(nèi)參的比值R的平均數(shù)作為基準(zhǔn)，進行標(biāo)準(zhǔn)化。以正常對照標(biāo)本中 拷貝數(shù)的1.5倍作為正?？截悢?shù)的變動范圍。如大于正常對照標(biāo)本中拷貝數(shù)的1.5倍，則該 標(biāo)本拷貝數(shù)擴增;如小于正常對照標(biāo)本中拷貝數(shù)的1.5倍，則該標(biāo)本拷貝數(shù)丟失（圖1)。圖1 中，Y軸表示腫瘤組織DNA拷貝數(shù)與正常人genomic DNA拷貝數(shù)的比值，以2的指數(shù)來表示Y軸 上的刻度，藍(lán)色線表示比值大于2的0.585次方，換算后即為3倍，X軸表示實際編號，本實驗 設(shè)3個平行復(fù)孔。
[0016] qRT-PCR檢測AGPAT9基因 mRNA水平表達(dá) 提取組織總RNA，采用Promega公司的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)試劑盒，Oligo(dT)作為隨機引物進行 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，qPCR擴增體系如表3所示。
[0017] 表3:AGPAT9qPCR擴增體系成份
所用引物，均為跨內(nèi)含子引物，采用引物設(shè)計軟件Primer Premier5 · 0設(shè)計。在NCBI網(wǎng) 站上對所有引物序列進行BLAST比對，確定引物序列不與人類其他基因同源。具體的定量 PCR引物序列如表4所示。
[0018] 表4:定量PCR引物序列
[0019] AGPAT9特異性擴增反應(yīng)包括:95°C變性30秒，60°C退火及延伸1分鐘，共45個循環(huán) 反應(yīng)。應(yīng)用ABI PRISM 7900Sequence Detector序列檢測系統(tǒng)對反應(yīng)產(chǎn)物進行實時定量測 定和融解曲線分析，分別進行三次平行實驗。內(nèi)參用GAPDH，以threshold cycle(CT)法進行 表達(dá)水平的比較，用以下公式計算:2_ΛΛα( Δ Δ CT =腫瘤Δ CT-癌旁Δ CT)，每個Δ CT= Δ CT (AGPAT9)- Δ CT(GAPDH)。以10對癌旁肝組織的倍數(shù)變化平均值為1.0,進行標(biāo)準(zhǔn)化(圖2)。
[0020]肝癌組織中AGPAT9蛋白表達(dá)及其對病人的預(yù)后評價 實驗操作如下： 1) 石蠟切片常規(guī)脫蠟、水化： 2) 抗原修復(fù):玻片放入枸櫞酸鈉（lmM，pH 6.0)的抗原修復(fù)液盒子里，微波加熱至溶液 沸騰，25分鐘；自然冷卻后，PBS 15min X 3次； 3) 阻斷肝組織內(nèi)源性過氧化物酶的活性:滴加3%過氧化氫去離子水，室溫避光孵育30 分鐘，以PBS浸泡15分鐘洗片X 3次； 4) 一抗孵育：滴加 100μΙ AGAPT9抗體工作液(Sigma，1:100)，置于濕盒中，4°C孵育過 夜;PBS清洗15分鐘洗片X 3次； 5) 二抗孵育:滴加 100μΙ特異性二抗工作液于組織上，濕盒內(nèi)室溫孵育60分鐘;PBS清洗 15分鐘洗片X 3次； 6) 曝光:滴加顯色劑DAB工作液100μΙ，顯色完全后，用蒸餾水沖洗終止顯色； 7) 蘇木素復(fù)染10分鐘，1 %鹽酸酒精浸泡10秒