11-取代氧化異阿樸菲衍生物的應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一系列11-取代氧化異阿樸菲衍生物的應(yīng)用。具體是11-取代氧化異阿樸菲衍生物或其藥學上可接受的鹽在制備Aβ聚集抑制劑藥物中的應(yīng)用，以及在制備同時具有抑制乙酰膽堿酯酶和抗Aβ聚集的藥物中的應(yīng)用。
【申請人】發(fā)現(xiàn)該類衍生物不僅在體外對乙酰膽堿酯酶具有很好的抑制活性，在體內(nèi)也同樣具有很好的抗乙酰膽堿酯酶效果，而且化合物無論在分子水平還是在細胞水平都具有很好的抗Aβ聚集活性。更難得的是該類化合物大部分能夠透過血腦屏障并且具有較低的毒性，在治療阿爾茨海默病和腦血管癡呆等疾病方面具有良好應(yīng)用前景。所述11-取代氧化異阿樸菲衍生物的結(jié)構(gòu)如下述式(I)所示：其中，n＝1～5。
【專利說明】
11-取代氧化異阿樸菲衍生物的應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及藥物化學技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及11-取代氧化異阿樸菲衍生物的新應(yīng) 用。
【背景技術(shù)】
[0002] 阿爾茨海默?。ˋlzheimer disease，AD)是由德國的神經(jīng)病理學家阿爾茨海默 (Alois Alzheimer)于1907年首先發(fā)現(xiàn)，并以其名字而命名的一種疾病，AD是一種漸進性 的神經(jīng)變性性疾病，這種疾病表現(xiàn)為全面的認知障礙，包括記憶、定位、判斷和推理。其臨床 特點是以潛隱性病，逐漸出現(xiàn)記憶力減退、認知功能障礙、行為異常和社交障礙。通常病情 呈進行性加重，逐漸喪失獨立生活能力。由于AD病涉及多種病理過程，其發(fā)病機制是個很 復雜、多機制、多因素的過程。
[0003] 盡管AD的發(fā)病機制目前仍未完全清楚，但由淀粉樣β蛋白（Αβ )沉積造成的老 年斑和包含tau蛋白的神經(jīng)纖維原纏結(jié)被認為是AD的主要發(fā)病機理。
[0004] 現(xiàn)有已經(jīng)上市的五種治療AD病的藥物：Donepezil ;Rivastigmine ;Galantamine ; Tacrine和N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA)受體調(diào)節(jié)劑Memantine。這類藥物的革E點為乙 酰膽堿酯酶（AChE)，它們雖然不能徹底治愈疾病，但能改善病人的癥狀。目前較為先進 的緩解疾病候選藥物（disease-modifying drug DMD)包括以Αβ抑制產(chǎn)生和清除為目 標的Tramiprosate(已進入三期臨床研究）；調(diào)節(jié)γ-分泌酶的Tarenflurbil(已進入 三期臨床研究）；淀粉樣蛋白的主動免疫疫苗ACC-001和被動免疫疫苗Bapineuzumab和 LY2062430(已進入二期臨床研究）等。
[0005] 上述已經(jīng)上市的和正在開發(fā)的藥物都是單一靶點的治療藥物，鑒于AD發(fā)病的復 雜性，這類藥物很難從根本上解決問題。因為一方面AD本身發(fā)病機理中往往由多個信號通 路參與，而單靶點的理論忽視了細胞內(nèi)或體內(nèi)生物大分子的相互影響及信號通路中構(gòu)成的 網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)的相互影響，靶分子在細胞內(nèi)多存在備份，當藥物抑制一種信號分子時，信號通路 可以通過回路或啟用備份，最終抵消藥物的作用。另一方面，現(xiàn)有藥靶有多功能性，強烈抑 制或激活某一藥靶會導致副作用的產(chǎn)生，如使用抗膽堿酯酶藥物往往會導致外周的乙酰膽 堿的積累增加而引起惡心、嘔吐等外周膽堿樣反應(yīng)。
[0006] 多靶點藥物的設(shè)計是旨在利用生物結(jié)構(gòu)信息和藥效團模型，獲得所需的多樣生物 活性，同時去除不需要的生物活性，其化合物的特點是針對疾病的不同病理環(huán)節(jié)發(fā)揮作用 而增強療效。另外，多靶點化合物對諸靶點作用的聯(lián)合較相應(yīng)各單靶點藥物對其作用的相 加要有效的多，原因在于這種不完全的多靶向作用具有適度阻斷分子之間的相互作用的優(yōu) 點。AD的發(fā)病機制復雜，多種信號通路參與此過程，許多信號分子在其中發(fā)揮重要作用，近 年來科學研究者嘗試將多靶向治療策略應(yīng)用于治療，發(fā)現(xiàn)較單靶點藥物治療具有更優(yōu)越的 療效和臨床前景。
[0007] 本
【申請人】在之前的研究中發(fā)現(xiàn)，具有下述式（A)所示結(jié)構(gòu)的11-取代氧化異阿樸 菲衍生物在體外對乙酰膽堿酯酶具有很好的抑制作用（具體請見公開號為CN103923010A 的發(fā)明專利），但目前尚未發(fā)現(xiàn)有該類衍生物具有體內(nèi)抗乙酰膽堿酯酶和細胞內(nèi)抗Αβ聚 集作用以及低毒性和高血腦屏障透過性的相關(guān)報道。
[0008]
[0009] 其中，η = 1 ~〇。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種11-取代氧化異阿樸菲衍生物的新應(yīng)用。
[0011] 具體地說，本發(fā)明提供具有下述式（I)所示結(jié)構(gòu)的11-取代氧化異阿樸菲衍生物 或其藥學上可接受的鹽在制備Αβ聚集抑制劑藥物中的應(yīng)用；
[0012]
[0013] 其中，η = 1 ~5。
[0014] 進一步地，本發(fā)明還提供具有下述式（I)所示結(jié)構(gòu)的11-取代氧化異阿樸菲衍生 物或其藥學上可接受的鹽在制備同時具有抑制乙酰膽堿酯酶和抗Αβ聚集的藥物中的應(yīng) 用；
[0015]
[0016] 其中，η = 1 ~5。
[0017] 本發(fā)明所述技術(shù)方案中涉及的具有式（I)所示結(jié)構(gòu)的11-取代氧化異阿樸菲衍生 物可參考公開號為CN103923010A的發(fā)明專利進行合成。
[0018] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明提供了具有式（I)所示結(jié)構(gòu)的11-取代氧化異阿樸菲衍 生物或其藥學上可接受的鹽在制備Αβ聚集抑制劑藥物中的應(yīng)用，以及該類衍生物在制備 同時具有抑制乙酰膽堿酯酶和抗Αβ聚集的藥物中的應(yīng)用。
【申請人】發(fā)現(xiàn)該類衍生物不僅 在體外對乙酰膽堿酯酶具有很好的抑制活性，在體內(nèi)也同樣具有很好的抗乙酰膽堿酯酶效 果，而且化合物無論在分子水平還是在細胞水平都具有很好的抗Αβ聚集活性。更難得的 是該類化合物大部分能夠透過血腦屏障并且具有較低的毒性，在治療阿爾茨海默病和腦血 管癡呆等疾病方面具有良好應(yīng)用前景。
【附圖說明】
[0019] 圖1為本發(fā)明所述的11-取代氧化異阿樸菲衍生物對Αβ42轉(zhuǎn)基因果蠅腦內(nèi)乙酰 膽堿酯酶的抑制活性條形圖；
[0020] 圖2為本發(fā)明所述的11-取代氧化異阿樸菲衍生物對SH-SY5Y_APPsw細胞Α β 42的 抑制活性條形圖；
[0021] 圖3為平行人工膜滲透模型的示意圖；
[0022] 圖4為采用圖3所示模型檢測9個市售藥物的ΡΑΜΡΑ-ΒΒΒ實驗數(shù)據(jù)與文獻值的相 關(guān)性曲線。
【具體實施方式】
[0023] 下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進一步的詳述，以更好地理解本發(fā)明的內(nèi)容，但 本發(fā)明并不限于以下實施例。
[0024] 本發(fā)明中按下述合成路線合成得到式（I)所示結(jié)構(gòu)的11-取代氧化異阿樸菲衍生 物。
[0025]
[0026] 實施例1 :4-氯-2-苯基異二氫吲哚-1，3-二酮（化合物1)的合成
[0027] 將57g(0. lmol) 3-氯鄰苯二甲酸酐和45g(0. lmol)苯乙胺加入到1L的三孔圓底 燒瓶中，再加入500ml甲苯，回流6小時，趁熱倒出，冷卻，析出結(jié)晶，抽濾，得到化合物1(白 色片狀結(jié)晶），產(chǎn)率約98%。
[0028] 對化合物1進行分析，其波譜特性如下：
[0029] 4 NMR (CDC13, 500MHz) : δ 3. 00 ~3. 04 (m，2H)，3. 94 ~3. 97 (m，2H)，7. 23 ~ 7. 34(m, 5H), 7. 65(d, J = 1. 7, 1H), 7. 66 (s, 1H), 7. 78 (dd, Ji= 5. Oand J 2= 3. 2, 1H)； ESI-MS(m/z) :287[M+H]+.
[0030] 因此，可確定上述化合物1為4-氯-2-苯基異二氫吲哚-1，3-二酮，其結(jié)構(gòu)式如 下式所示：
[0031]
1234 實施例2 :10-C1_1-氮雜苯并蒽酮（化合物2)的合成 2 將75g(0. 56mol)的無水三氯化鋁和15g氯化鈉加入1L的三孔圓底燒瓶中，混 合加熱至140°C熔融，再向其中分批緩慢加入53g(0. 2mol)的化合物1，加入完畢，升溫至 220°C，攪拌反應(yīng)3小時，乘熱倒入研缽中，冷卻，搗碎，得到紅棕色固體，放置于干燥器皿 中。 3 取600ml濃硫酸加入到2L的三孔圓底燒瓶中，升溫到80 °C時，開始分批加入上步 4 得到的紅棕色固體，加完后升溫至230°C，攪拌反應(yīng)2. 5小時，冷卻，倒入到約600g的冰水 中，用NaOH調(diào)節(jié)體系的pH值約2~3,析出大量固體，抽濾，水洗，得到粗產(chǎn)品。粗產(chǎn)品經(jīng)硅 膠柱層析（石油醚/乙酸乙酯=30:1)純化，得到化合物2 (黃色粉末），產(chǎn)率約35 %。
[0035] 對化合物2進行分析，其波譜特性如下：
[0036] 蟲 NMR(CDC13, 500MHz) : δ 7. 59(dd，J!= 8. 2Hz and J 2= 1. 5Hz，1H)，7. 78(d，J =5. 5Hz, 1H), 7. 92 (dd, J = 7. 7Hz, 1H), 8. 17 (d, J = 8. 1Hz, 1H), 8. 34 (d, J = 8. 3Hz, 1H), 8. 65(d, J = 7. 2Hz, 1H), 8. 78 (d, J = 5. 3Hz, 1H), 8. 86 (d, J = 1. 5Hz, 1H)； ESI-MS(m/z) :267[M+H]+.
[0037] 因此，可確定上述化合物2為10-Cl-1-氮雜苯并蒽酮，其結(jié)構(gòu)式如下式所示：
[0038]
[0039] 實施例3 :11-氨基-10-氯-7H-二苯并喹啉-7-酮（化合物3)的合成
[0040] 取濃硫酸6mL，緩慢加入4g化合物2,待其全部溶解完全后，再加入3mL的發(fā)煙硝 酸，室溫下攪拌20min，再于50°C下反應(yīng)4h，停止反應(yīng)。待冷卻后倒入約150mL的冰水中，抽 濾，烘干。得到黃色的11位硝化產(chǎn)物，產(chǎn)率約85%。
[0041] 取上步所得的硝化產(chǎn)物，6. 7g九水合硫化鈉和2. 6gNa0H于250mL的圓底燒瓶中， 然后加入200mL的乙醇溶液（乙醇：水（體積比）=7:3)，攪拌回流4. 5h。停止反應(yīng)后，冷 卻，減壓蒸除乙醇，水洗，抽濾，得到化合物3 (暗紅色固體），產(chǎn)率約35%。
[0042] 對化合物3進行分析，其波譜特性如下：
[0043] NMR (500MHz，CD Cl 3) δ 8. 89 (d, J = 5. 5Hz, 1H) , 8. 59 (d, J = 7. 3Hz, 1H) , 8. 12 (d, J = 8. 2Hz, 1H) , 7. 90 (t, J = 7. 7Hz, 1H) , 7. 75 (d, J = 5. 5Hz, 1H), 7. 56(d, J = 9. 0Hz, 1H), 6. 78 (d, J = 8. 9Hz, 1H), 1. 62 (s, 2H). ESI-MS (m/ z) : 282 [M+H]+.
[0044] 因此，可確定上述化合物3為11-氨基-10-氯-7H-二苯并喹啉-7-酮，其結(jié)構(gòu)式 如下式所示：
[0045]
12 實施例4 :11- (2-哌啶乙酰氨基）-10-氯-7H-二苯并喹啉-7-酮（化合物4)的 合成 2 取0· 3g(0. 0012mol)化合物3于25mL圓底燒瓶中，加入15mL CH2C12使其全部溶 解后，向裝有3. 0g(0. 018mol)2-(l-哌啶基）乙酰氯的反應(yīng)瓶中緩慢滴加，滴加完畢后TLC 追蹤反應(yīng)2. 5h，用似!10)3調(diào)pH值至8-9,并用蒸餾水洗滌3-4次，CH 2C1J1用無水Na 2S04 干燥，粗產(chǎn)品用硅膠柱層析（石油醚/氯仿=20:1)純化，得到化合物4(黃色粉末），產(chǎn)率 81%〇
[0048] 對化合物4進行分析，其波譜特性如下：
[0049] NMR(500MHz, CDC13) δ 13. 64(s, 1H), 9. 05(d, J = 9. 2Hz, 1H), 8. 92 (d, J =5. 5Hz, 1H), 8. 67 (d, J = 7. 3Hz, 1H), 8. 20 (d, J = 8. 1Hz, 1H), 7. 94 (t, J = 7. 7Hz, 1H), 7. 85 (d, J = 9. 2Hz, 1H), 7. 79 (d, J = 5. 5Hz, 1H), 3. 27 (s, 2H), 2. 67 (s, 4H), 1. 88 (s, 4H), 1. 28 (s, 2H). ESI-MS (m/z) : 407 [M+H]+.
[0050] 因此，可確定上述化合物4為11- (2_哌啶乙醜氛基）_l〇-氣-7H-二苯并陸 啉-7-酮，其結(jié)構(gòu)式如下式所示：
[0051]
[0052] 實施例5 :11- (3-哌啶丙酰氨基）-10-氯-7H-二苯并喹啉-7-酮（化合物5)的 合成
[0053] 取0· 3g(0. 0012mol)化合物3于25mL圓底燒瓶中，加入15mL CH2C12使其全部溶 解后，向裝有3. 2g(0. 018mol)3-(l-哌啶基）丙酰氯的反應(yīng)瓶中緩慢滴加，滴加完畢后TLC 追蹤反應(yīng)2. 5h，反應(yīng)物用NaHC03調(diào)其pH值至8~9,并用蒸餾水洗滌3~4次，CH 2C1J1用 無水Na2S04干燥，粗產(chǎn)品用硅膠柱層析（石油醚/氯仿=10:1)純化，得到化合物5(黃色 粉末），產(chǎn)率78%。
[0054] 對化合物5進行分析，其波譜特性如下：
[0055] 4 匪R(500MHz，CDC13) δ 13. 06(s，1H)，8. 94(d，J = 2. 0Hz，1H)，8. 92(d，J = 1. 7Hz, 1H), 8. 62 (dd, J = 7. 3, 1. 1Hz, 1H), 8. 21 (dd, J = 8. 2, 1. 0Hz, 1H), 7. 94 (dd, J =8. 0, 7. 4Hz, 1H), 7. 84(d, J = 9. 2Hz, 1H), 7. 79 (d, J = 5. 5Hz, 1H), 2. 91 (t, J = 10. 8Hz, 2H), 2. 80 (t, J = 4. 1Hz, 2H), 2. 57 (s, 4H), L 67 (m, 4H), 1. 29 (s, 2H). ESI-MS (m/ z) :421 [M+H]+.
[0056] 因此，可確定上述化合物5為11- (3_哌啶丙醜氛基）_l〇-氣-7H-二苯并陸 啉-7-酮，其結(jié)構(gòu)式如下式所示：
[0057]
[0058] 實施例6 :11- (4-哌啶丁酰氨基）-10-氯-7H-二苯并喹啉-7-酮（化合物6)的 合成
[0059] 取0· 3g(0. 0012mol)化合物3于25mL圓底燒瓶中，加入15mL CH2C12使其全部溶 解后，向裝有3. 4g(0. 018mol)4-(l-哌啶基）丁酰氯的反應(yīng)瓶中緩慢滴加，滴加完畢后TLC 追蹤反應(yīng)2. 5h，反應(yīng)物用NaHC03調(diào)其pH值至8~9,并用蒸餾水洗滌3~4次，CH 2C1J1用 無水Na2S04干燥，粗產(chǎn)品用硅膠柱層析（石油醚/氯仿=10:1)純化，得到化合物6(橙黃 色粉末），產(chǎn)率70%。
[0060] 對化合物6進行分析，其波譜特性如下：
[0061] NMR(500MHz, CDC13) δ 13. 04(s, 1H), 8. 96(d, J = 9. 2Hz, 1H), 8. 93 (d, J =5. 4Hz, 1H), 8. 62 (d, J = 7. 3Hz, 1H), 8. 21 (dd, J = 8.2,1.0Hz,lH),7.97-7. 90 (m, 1H) , 7. 84 (d, J = 9. 2Hz, 1H) , 7. 79 (d, J = 5. 5Hz, 1H) , 2. 64 (t, J = 7. 3Hz, 2H), 2. 56 - 2. 46 (m, 2H), 2. 14 - 1. 98 (m, 4H), 1. 72 - 1. 58 (m, 4H) ,1.53- 1. 41 (m, 2H), 1. 27 (d, J = 7. 4Hz, 2H). ESI-MS (m/z) : 435 [M+H]+.
[0062] 因此，可確定上述化合物6為11- (4-哌啶丁酰氨基）-10-氯-7H-二苯并喹 啉-7-酮，其結(jié)構(gòu)式如下式所示：
[0063]
1234 實施例7 :11- (5-哌啶戊酰氨基）-10-氯-7H-二苯并喹啉-7-酮（化合物7)的 合成 2 取0· 3g(0. 0012mol)化合物3于25mL圓底燒瓶中，加入15mL CH2C12使其全部溶 解后，向裝有3. 7g(0. 018mol)5-(l-哌啶基）戊酰氯的反應(yīng)瓶中緩慢滴加，滴加完畢后TLC 追蹤反應(yīng)2. 5h，反應(yīng)物用NaHC03調(diào)其pH值至8~9,并用蒸餾水洗滌3~4次，CH 2C1J1用 無水Na2S04干燥，粗產(chǎn)品用硅膠柱層析（石油醚/氯仿=8:1)純化，得到化合物7 (橙黃色 粉末），產(chǎn)率64%。 3 對化合物7進行分析，其波譜特性如下： 4 4 匪R(500MHz，CDC13) δ 13. 03(s，1H)，8. 96(d，J = 9. 2Hz，1H)，8. 93(d，J = 5. 5Hz, 1H), 8. 62 (dd, J = 7. 3, 0. 8Hz, 1H), 8. 21 (dd, J = 8. 2, 1. 0Hz, 1H), 7. 93 (m, 1H ),7.84(d, J = 9. 2Hz, 1H), 7. 78(d, J = 5. 5Hz, 1H), 2. 61 (t, J = 7. 5Hz, 2H), 2. 53- 2. 43 (m, 4H), 1. 87 (t, J = 15. 2, 2H), 1. 73 (m, 2H), 1. 69 - 1. 62 (m, 4H), 1. 48 (d, J = 5. OHz, 2H), 1. 27 (d, J = 7. 2Hz, 2H). ESI-MS (m/z) : 449 [M+H]+.
[0068] 因此，可確定上述化合物7為11- (5_哌啶戊醜氛基）_l〇-氣-7H-二苯并陸 啉-7-酮，其結(jié)構(gòu)式如下式所示：
[0069]
[0070] 實施例8 :11- (6-哌啶己酰氨基）-10-氯-7H-二苯并喹啉-7-酮（化合物8)的 合成
[0071] 取0· 3g(0. 0012mol)化合物3于25mL圓底燒瓶中，加入15mL CH2C12使其全部溶 解后，向裝有3. 9g(0. 018mol)6-(l-哌啶基）己酰氯的反應(yīng)瓶中緩慢滴加，滴加完畢后TLC 追蹤反應(yīng)3h，反應(yīng)物用NaHC03調(diào)其pH值至8~9,并用蒸餾水洗滌3~4次，CH不12層用 無水Na 2S04干燥，粗產(chǎn)品用硅膠柱層析（石油醚/氯仿=5:1)純化，得到化合物8 (黃色粉 末），產(chǎn)率53%。
[0072] 對化合物8進行分析，其波譜特性如下：
[0073] 4 NMR (500MHz，CDC13) δ 13. 06 (s，1H)，8. 93 (s，1H)，8. 92 (d，J = 3. 2Hz, 1H) , 8. 64 (d, J = 7. 3Hz, 1H) , 8. 22 (d, J = 8. 2Hz, 1H) , 7. 95 (t, J = 7. 7Hz, 1H), 7. 84(d, J = 9. 2Hz, 1H), 7. 80 (d, J = 5. 5Hz, 1H), 3. 00 (s, 2H), 2. 93 (d, J = 8. 7Hz, 2H), 2. 61 (t, J = 7. 1Hz, 4H), 2. 32 (m, 6H), 1. 88 (t, J = 7. 4Hz, 4H), 1. 55 (m, 2H). ESI-MS (m/z) :463 [M+H]+.
[0074] 因此，可確定上述化合物8為11- (6-哌啶己酰氨基）-10-氯-7H-二苯并喹 啉-7-酮，其結(jié)構(gòu)式如下式所示：
[0075]
[0076] 為進一步說明11-取代氧化異阿樸菲衍生物的用途，
【申請人】進行了以下實驗：
[0077] 實驗例1 :11_取代氧化異阿樸菲衍生物體外乙酰膽堿酯酶和丁酰膽堿酯酶抑制 活性的測定
[0078] 應(yīng)用 Ellman (Ellman，G. L. ;Courtney，K. D. ;Andres，V. ;et al. Biochem. Pharmacol. 1961，7, 88.)的方法測試化合物對乙酰膽堿酯酶和丁酰膽堿酯酶抑制的IC5。 值。所有測試都是用Microplate reader ELX808?型酶標儀（美國BioTek公司），在37°C 條件下測定。數(shù)據(jù)分析軟件使用Origin軟件進行數(shù)據(jù)處理，使用Tacrine作為對照品。
[0079] 1、抑制劑儲備液的配制：所測試的抑制劑配成10mM的DMS0溶液。
[0080] 2、酶儲備液的配制：乙酰膽堿酯酶（從電鰻中提?。┖投□Ｄ憠A酯酶（從馬的血 衆(zhòng)中提?。┵徸許igma公司；用pH = 8. 0的磷酸鹽緩沖液分別配成0· lmg/mL，0· 5mg/mL。
[0081] 3、底物儲備液的配制：乙酰巰基膽堿（乙酰膽堿酯酶底物）和丁酰巰基膽堿（丁 酰膽堿酯酶底物）購自Sigma公司；用pH = 8. 0的磷酸鹽緩沖液分別配成2mg/mL，2mg/mL。
[0082] 4、顯色劑儲備液的配制：顯色劑DTNB購自Sigma公司；用pH = 8. 0的磷酸鹽緩沖 液分別配成4mg/mL和2mg/mL。
[0083] 5、測試：每次測試的體積都為150 μ L的pH = 8. 0的磷酸鹽緩沖液。
[0084] 往96孔酶標板中加入pH = 8. 0磷酸鹽緩沖溶液150 μ L，10 μ L顯色劑儲備液， 10 μ L酶儲備液，再分別加入20 μ L不同濃度抑制劑溶液（用pH = 8. 0磷酸鹽緩沖溶液稀 釋抑制劑儲備液），在37°C的酶標儀中保溫15min，立即加入20 μ L底物儲備液，混勻后立即 測其在λ = 420nm處一分鐘吸光度變化（斜率）。參比液為pH = 8. 0磷酸鹽緩沖溶液。
[0085] 6、結(jié)果判斷：以未加樣品所測得的吸光度變化（斜率）作為100個活力單位； 相對酶活力=(加入抑制劑的吸光度變化（斜率）/沒有加入抑制劑的吸光度變化（斜 率））X 100,當酶的相對活力為50時的抑制劑的濃度即為抑制劑的IC5。值。
[0086] 7、實驗結(jié)果：
[0087] 化合物4-8對乙酰膽堿酯酶和丁酰膽堿酯酶抑制活性的IC5。值和抑制的選擇性如 下述表1所示。
[0088] 表1 :化合物4-8對乙酰膽堿酯酶和丁酰膽堿酯酶抑制活性的IC5。值和抑制的選 擇性
[0089]
[0091] a對乙酰膽堿酯酶的選擇性=IC5。（丁酰膽堿酯酶）/IC5。（乙酰膽堿酯酶）。
[0092] 由表1可知，所合成的11-取代氧化異阿樸菲衍生物（4~8)對乙酰膽堿酯酶的 抑制IC 5。值都在微摩爾水平。而對丁酰膽堿酯酶的抑制，也達到了微摩爾的水平?；衔?5在所有測試的化合物中具有最高的對乙酰膽堿酯酶的抑制活性（IC M= 0. 028 μM)，且其 對乙酰膽堿酯酶的選擇性大約是對照品他克林的102倍。
[0093] 實驗例2 :11_取代氧化異阿樸菲衍生物對Αβ 42轉(zhuǎn)基因果蠅腦內(nèi)乙酰膽堿酯酶的 抑制活性測定
[0094] 將各組果蠅同時飼養(yǎng)25天，每種取100只雄果蠅，顯微鏡下切下腦部，液氮研磨， 加入400 μ 1生理鹽水，在冰水浴中以3000r/min勻漿10s，反復進行3次，制成組織勻漿； 再以6000r/min離心10min，取上清液。按CHE測定試劑盒說明操作。
[0095] 結(jié)果：化合物4-8對Αβ 42轉(zhuǎn)基因果蠅腦內(nèi)乙酰膽堿酯酶的抑制活性如圖1所示。
[0096] 實驗例3 :11_取代氧化異阿樸菲衍生物對Α β 42自誘導聚集的抑制活性測定
[0097] 1.溶液的配制
[0098] (1) (λ 215Μ pH 8. 0磷酸鹽緩沖溶液：向500mL (λ 215Μ Na2HP04水溶液中緩慢滴加 0. 215M NaH2P04水溶液，攪拌混勻，用pH計將溶液pH值調(diào)至8. 0,存儲于4°C備用；
[0099] (2)用 HFIP 使 Α β (1-42)單體化（2mg/ml):稱取 0· 2mg Α β 溶于 4°C 的 HFIP，定 容至100 μ L ;室溫孵育60min，然后將A Ml-42) /HFIP溶液于4°C靜置lOmin，再使其在室 溫下自然揮發(fā)，過夜；真空冷凍干燥除去剩余的HFIP ;
[0100] (3) 2mM Α β (1-42) /DMSO儲備溶：將冷凍干燥后的Α β溶于DMSO溶液，配制成2mM 的儲備液，靜置于4°C備用；
[0101] (4)1. 5 μ Μ硫黃素 T溶液：稱取一定量的硫黃素 T用10mM pH 8. 5甘氨酸-NaOH緩 沖溶液配置成1. 5 μ Μ硫黃素 T儲備液，存儲于4°C備用；
[0102] (5) ImM抑制劑溶液：用0. 215M pH8. 0磷酸鹽緩沖溶液將10mM的樣品DMS0儲備 液稀釋至ImM的待測液。
[0103] 2.化合物對Α β 42自誘導聚積抑制作用分析方法
[0104] 取2 μ L A M1-42)儲備液分別加入16 μ L的緩沖溶液和2 μ L的抑制劑溶液（抑 制劑的最終濃度為10 μΜ)，混勻，37°C共同孵育8h ;然后加入180 μ L 1. 5 μΜ硫黃素 Τ的 甘氨酸-NaOH溶液混勾后，立即在446nm激發(fā)波長和490nm發(fā)射波長下測定其焚光值；以 0.215M pH 8.0磷酸鹽緩沖溶液為參比，并設(shè)置Α β加緩沖液作為空白；存在抑制劑時熒光 值為鞏(Α β +AChE+抑制劑），無抑制劑下的熒光值為IF。(Α β +AChE)，化合物的抑制率= KKKdFyiF。）X100]。
[0105] 結(jié)果：化合物4-8對Αβ 42自誘導聚集的抑制率如下述表2所示：
[0106] 表2 :化合物4-8對Αβ 42自誘導聚集的抑制
[0107]
[0108] 3Αβ42濃度為20 μ mol · L \化合物濃度為10 μ mol · L1，每個化合物至少平行測 試三次，結(jié)果表示為：平均值土標準誤
[0109] 實驗例4 :11-取代氧化異阿樸菲衍生物對SH-SY5Y-APPsw細胞Αβ 42的抑制活性 測定
[0110] 1.細胞培養(yǎng)：將SH-SY5Y-APPs#H胞培養(yǎng)于含有W = 10% FBS和W = 1%青鏈霉 素的DMEM培養(yǎng)液中，在37 °C、(p=5%C02、100 %飽和相對濕度的恒溫細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。 觀察細胞貼壁生長密度超過80%時，用w = 0. 25%胰蛋白酶消化傳代。
[0111] 2.取對數(shù)生長期的細胞，消化后以1X106個/mL的濃度接種于6孔板。24h后加 入終濃度為1 μ mol/L的藥物，另設(shè)只加0. 1 % DMS0的對照組，每組設(shè)3個復孔。24h后分 別收集細胞培養(yǎng)液，4°C、12000r/min離心5min后取上清，將上清置于-20°C保存。
[0112] 3.按照試劑盒的說明將標準品稀釋、加樣（分別設(shè)空白孔與待測樣品孔）、溫 育、配洗滌液、洗滌、加入酶標試劑（空白孔除外）、再溫育、再洗滌、加入顯色劑避光顯色 15min、每孔加入50 μ L的終止液終止反應(yīng)、用酶標儀在450nm波長下測定吸光度（0D值）。
[0113] 結(jié)果：化合物4-8對SH-SY5Y-APPsw細胞Α β 42的抑制如圖2所示。
[0114] 實驗例5 :11_取代氧化異阿樸菲衍生物對SH-SY5Y細胞毒性的測定
[0115] 1.細胞培養(yǎng)：將SH-SY5Y細胞培養(yǎng)于含有w = 10% FBS和w = 1%青鏈霉素的 DMEM培養(yǎng)液中，在37°C、f=5%C02、100%飽和相對濕度的恒溫細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。觀察 細胞貼壁生長密度超過80%時，用w = 0. 25%胰蛋白酶消化傳代。
[0116] 2· MTT法測定細胞相對活力：藥物對細胞生存能力的影響可用MTT試驗檢測。取對 數(shù)生長期的SH-SY5Y細胞，以1 X 104個/孔的密度接種于96孔板，每孔含200 μ 1培養(yǎng)基， 24h后，加入終濃度為50和100 μ mol/L的藥物，另設(shè)只加0. 1 % DMS0的對照組，每一個濃 度組設(shè)5個復孔。24h后，每孔加入20 μ 1濃度為5mg/ml的MTT，作用4-6h，棄去液體，每孔 加入150 μ 1的DMS0,于搖床上振蕩lOmin，用酶標儀在490nm波長下測定吸光度（0D值）。 各加藥組與對照組相比得到的數(shù)值即代表細胞的相對活力（Cell viability)。
[0117] 結(jié)果如下述表3所示：
[0118] 表3 :化合物4-8對SH-SY5Y細胞的毒性
[0119]
[0120] 實驗例6 :8-取代氧化異阿樸菲衍生物的血腦屏障透過能力測定
[0121] 血腦屏障平行人工膜滲透模型（Parallel artificial membrane permeation assay for Blood-Brain Barrier, PAMPA-BBB)的實驗裝置如圖3所示：上層板由聚四氟 乙烯和池底的聚偏氟乙烯（PVDF)多孔過濾膜構(gòu)成，實驗中將不同的磷脂溶于鏈烷中使 其均勻分布于PVDF膜上形成模擬生物膜，然后向池內(nèi)注入相應(yīng)的緩沖溶液作為受體池 (Acceptor plates);下層的供體池 （Donor plates)加入一定體積的樣品溶液后將制備好 的受體池轉(zhuǎn)移至供體池中，使磷脂膜與供體液相互接觸形成"三明治"結(jié)構(gòu)一一上層為受體 池，中間為人工磷脂膜，底部為待測藥物的供體液。
[0122] 藥物分子通過被動擴散從供體池中透過模擬生物膜進入上層受體池中（見圖 3)，擴散完畢后，分別移取受體液和供體液用紫外分光光度計測定其濃度[drug] A_ptc^P [drug] nn_，根據(jù)公式算得藥物的有效透過率：
[0123]
[0124] 其中，VD為供體池中化合物待測液的體積；V Α為受體池中緩沖液的體積；Α為多 孔過濾的有效面積（cm2) ;t為擴散時間（s) ;[drug]A(：(：eptOT為受體池中藥物的濃度；[drug] equlllb_·為藥物的理論吸收濃度；Pe的單位為cm s、
[0125] 表4 :9個市售藥物的PAMPA-BBB實驗數(shù)據(jù)和文獻值
[0126]
[0127]
[0128] a來至參考文獻：Di L. ;Kerns Ε· H. ;Fan K. ;et al. High throughput artificial membrane permeability assay for blood-brain barrier[J]. Eur. J. Med. Chem. 2003, 38(3) :223-232.
[0129] b實驗數(shù)據(jù)為至少三次平行獨立實驗的平均值
[0130] 表4為采用豬腦磷脂提取物模擬人腦內(nèi)磷脂膜建立的PAMPA-BBB模型。通過檢測 9個市售的藥物的血腦屏障透過率與文獻值對比，得到相關(guān)性方程：y = 0. 866x+0. 7068 (R2 =0. 9408)(如圖4所示）。根據(jù)相關(guān)性方程和Di等人建立的評價條件，我們對化合物的血 腦屏障透過能力可作如下定義：
[0131] (a) 'CNS+'（能夠透過血腦屏障）：Pe (10 6cm s 3 >4. 2 ;
[0132] (b) 'CNS-'（不能夠透過血腦屏障）：Pe(106cm 8 3(2.5:
[0133] (c) 'CNS+/-'（無法確定是否能夠透過血腦屏障）：Pe(10 6cm s 3 :2· 5~4· 2 ;
[0134] 1.溶液的配制
[0135] 1)0. 1Μ pH 7. 4磷酸鹽緩沖溶液（PBS):向500mL 0. 1Μ Na2HP04水溶液中緩慢滴加 0. 1M NaH2P04水溶液，攪拌混勾，用pH計將溶液pH值調(diào)至7. 4,存儲于4°C備用；
[0136] 2) 20mg/ml十二烷/PBL溶液：稱取20mg PBL溶于十二烷中，定容至1. OmL ;
[0137] 3) 25 μ g/ml樣品待測溶：稱取一定量的樣品用DMS0配制成5mg/ml的儲備液，然 后用PBS:乙醇（9:1，體積比）溶液稀釋200倍，即得到25 μ g/ml樣品待測溶液；
[0138] 2.化合物血腦屏障透過能力的分析方法
[0139] 取4 μ L 20mg/ml 十二燒/PBL溶液均勾分布于96#Multi_well Filter plate 的聚 偏氟乙烯膜上制成磷脂膜，然后將配好的PBS:乙醇（9:1，體積比）溶液300 yL加入到受 體池中；取300 μ L已配好的25 μ g/ml樣品待測溶加入到供體池中，然后將其靜置于不受干 擾的地方，再將已制備好的受體池緩慢地移至供體池內(nèi)，形成"三明治"結(jié)構(gòu)；25°C下靜于被 動擴散l〇h ;擴散實驗完畢后，將受體池從供體池中小心取出，并將供體池和受體池的溶液 分別移至96#UV透射板內(nèi)，然后用紫外分光光度計測定其濃度[drug] D_dP [drug] A_ptOT; 根據(jù)公式1，計算出化合物的PAMPA-BBB有效滲透率Pe值，并以9個市售藥物的實驗值和文 獻值標定化合物BBB有效透過率的可靠性。
[0140] 化合物4-8的血腦屏障透過率如下述表5所示：
[0141] 表5 :化合物4-8的血腦屏障透過率
[0142]
[0143] a 'CNS+'（能透過血腦屏障）：Pe(10 6cm · s ^M. 2 ;
[0144] 'CNS-'（不能透過血腦屏障）：Pe (10 6cm · s 3〈2. 5 ;
[0145] 'CNS+/-'（不確定）：Pe(10 6cm · s 3 在 2. 5 和 4. 2 之間
[0146] 通過體內(nèi)外乙酰膽堿酯酶的抑制實驗，證明了本發(fā)明的11-取代氧化異阿樸菲衍 生物對乙酰膽堿酯酶具有很強的抑制活性。體外實驗中對AChE抑制的IC 5。值達到微摩爾 水平，體內(nèi)實驗表明，化合物能有效抑制Α β 42轉(zhuǎn)基因果蠅腦內(nèi)的乙酰膽堿酯酶，特別是化 合物5,它們能使轉(zhuǎn)基因果蠅腦內(nèi)的乙酰膽堿酯酶降低到正常果蠅水平，甚至更低。同時，無 論在體外實驗還是細胞水平實驗，化合物都表現(xiàn)出明顯的抑制Α β 42聚集的活性?；衔?的毒性實驗數(shù)據(jù)表明，大部分化合物的對SH-SY5Y細胞的毒性IC5。值在50-100 μπιο? · L 1 左右，其毒性較少。血腦屏障透過率實驗表明了化合物具有一定的透過血腦屏障的能力。特 別是化合物5,其各項實驗數(shù)據(jù)表明，其很有可能成為抗AD的候選化合物。
【主權(quán)項】
1. 具有下述式（I)所示結(jié)構(gòu)的11-取代氧化異阿樸菲衍生物或其藥學上可接受的鹽在 制備A 0聚集抑制劑藥物中的應(yīng)用；其中，n = 1~5。2. 具有下述式（I)所示結(jié)構(gòu)的11-取代氧化異阿樸菲衍生物或其藥學上可接受的鹽在 制備同時具有抑制乙酰膽堿酯酶和抗AP聚集的藥物中的應(yīng)用；其中，n = 1~5。
【文檔編號】C07D221/18GK106038564SQ201510527332
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2015年8月25日
【發(fā)明人】唐煌, 衛(wèi)沈旗, 陳薇
【申請人】廣西師范大學