專利名稱：堿性果膠酶突變體及其重組表達工程菌的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種堿性果膠酶突變體及其重組表達工程菌。
背景技術(shù)：
果膠酶是指能催化果膠質(zhì)分解的多種酶的總稱，對果膠質(zhì)結(jié)構(gòu)化學(xué)的研究表明，果膠質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜，能催化其分解的果膠酶也是種類繁多。根據(jù)分解糖苷鍵的反應(yīng)性質(zhì)或降解底物的性質(zhì)，果膠酶可以分為3類果膠水解酶、果膠裂解酶和果膠酯酶。果膠酶按其作用最適PH分為酸性果膠酶和堿性果膠酶。目前研究和應(yīng)用最多的是酸性果膠酶，主要用于水果榨汁和果汁澄清。
堿性果膠酶是在堿性范圍內(nèi)具有較高活性的果膠酶，在造紙、紡織等行業(yè)有著巨大的應(yīng)用前景，已經(jīng)引起廣泛的關(guān)注。堿性果膠酶可用于棉麻織物雜質(zhì)的有效去除，提高織物潤濕性，且不會像纖維素酶那樣降低棉纖維的強度。以堿性果膠酶為主要成分的脫膠酶，在苧麻、亞麻等麻類植物的脫膠工藝中的應(yīng)用也越來越受到重視，可以不破壞植物纖維，不污染環(huán)境、節(jié)約能源。但現(xiàn)有堿性果膠酶，酶活水平普遍較低，只有幾十個酶活單位，且堿性果膠酶對過氧化氫的耐受性低，不能滿足工業(yè)生產(chǎn)的需要。目前工業(yè)上多采用構(gòu)建重組表達工程菌株的方法來提高酶制劑的產(chǎn)量，常用的有大腸桿菌、畢赤酵母、曲霉、枯草芽孢桿菌等表達系統(tǒng)，其中枯草芽孢桿菌發(fā)酵周期短、工藝成熟，因此得到廣泛使用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種堿性果膠酶突變體及其重組表達工程菌，即通過隨機突變的方法對來源于枯草芽孢桿菌的堿性果膠酶基因進行改造，獲得了酶活水平極大提高的突變體。同時，突變體的酶學(xué)性質(zhì)也比突變前有了很大的改進，為堿性果膠酶的產(chǎn)業(yè)化提供了有力的支持。本發(fā)明的一個方面涉及一種堿性果膠酶突變體，其氨基酸序列為SEQ ID N0:4;其編碼核苷酸序列為SEQ ID N0:3。本發(fā)明另一個方面涉及一種重組載體，所述的重組載體為攜帶有序列為SEQ IDNO:3的核苷酸片段的表達載體。上述的表達載體為原核表達載體。本發(fā)明的另一方面涉及一種枯草芽孢桿菌工程菌，該工程菌攜帶有能表達上述堿性果膠酶突變體的表達載體。所述枯草芽孢桿菌工程菌株，命名為Bacillus subtilis PL113，已于2012年8月31日，保藏于地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院中科院微生物研究所(郵編100101)的中國普通微生物菌種保藏管理中心，保藏號為=CGMCC NO 64890本發(fā)明另一方面涉及上述工程菌株的應(yīng)用，用于生產(chǎn)堿性果膠酶突變體。
本發(fā)明還涉及上述堿性果膠酶突變體在紡織等領(lǐng)域的應(yīng)用。本發(fā)明的堿性果膠酶突變體在枯草芽孢桿菌168中的表達量高達1140U/mL，是突變前的40多倍，且具有更好的酶學(xué)性質(zhì)，對溫度、pH和雙氧水的耐受性都得到很大的提高。本發(fā)明的堿性果膠酶突變體最適作用溫度為60°C，60°C處理20min后，仍能保留38%的酶活，是突變前的4倍；最適pH為9. 0，在pH9. O條件下，60°C處理lh，仍能保留64. 7%的酶活，是突變前的5. 7倍；在含H20210g/L的緩沖體系中處理60min，仍能保留31. 3%的酶活，是突變前的3. 8倍。


圖I :表達載體pWB980-PL113的構(gòu)建示意圖；圖2 :堿性果膠酶突變體相對酶活-溫度變化曲線圖；圖3 :堿性果膠酶突變體相對酶活-pH變化曲線圖。
具體實施例方式下面結(jié)合實例對本發(fā)明的方法做進一步說明。但實例僅限于說明，并不限于此。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通?？砂闯Ｒ?guī)條件，如J.薩姆布魯克(Sambrook)等編寫的《分子克隆實驗指南》中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件運行。本領(lǐng)域相關(guān)的技術(shù)人員可以借助實施例更好地理解和掌握本發(fā)明。但是，本發(fā)明的保護和權(quán)利要求范圍不限于所提供的案例。實施例I堿性果膠酶基因PL的克隆一、枯草芽孢桿菌CGMCC1. 897染色體的提取所述枯草芽孢桿菌CGMCC1. 897購自“中國普通微生物菌種保藏管理中心”，分類命名為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)，保藏號為CGMCC1. 897。，挑取新鮮的枯草芽孢桿菌CGMCC1.897單菌落于5mLLB液體培養(yǎng)基中，37°C搖床200rpm振蕩培養(yǎng)過夜，按照Tiangen細(xì)菌基因組提取試劑盒(天根生化科技有限公司)的說明提取染色體。二、引物設(shè)計根據(jù)NCBI上堿性果膠酶同源序列設(shè)計引物，上游引物為5’ATGAAACGACTTTTTTTATGGTTCA3’ ；下游引物為5’ TCAGTAGCCAAATACCAGAGTTG 3’。三、目的基因PL PCR擴增以枯草芽孢桿菌CGMCC1.897染色體為模板，利用上下游引物進行擴增，擴增條件為94°C預(yù)變性5min，94°C變性40s，60°C退火40s，72°C延伸60s，30個循環(huán)后，72°C延伸IOmin0凝膠回收試劑盒回收PCR擴增產(chǎn)物，命名為PL，大小為1038bp。四、基因測序驗證將目的基因PL克隆至pMDlS-T載體，送至北京華大基因測序中心進行測序，測得PL基因序列為SEQ ID NO: I，其編碼氨基酸序列為SEQ ID N0:2。通過NCBI同源序列比對，確定擴增的基因為堿性果膠酶基因，且與Genbank中YP 004203799. I的氨基酸序列同源性達 100%。
實施例2枯草芽孢桿菌工程菌株的構(gòu)建一、目的基因的PCR擴增根據(jù)載體pWB980多克隆位點上的單酶切位點SalI和Sphll，設(shè)計引物，上游引物為 PLF :5’ CCGGTCGACGATGAAACGACTTTTTTTATGGTTC 3’ ；下游引物為 PLR :5’ CCAGCATGCTCAGTAGCCAAATACCAGAGTTG 3’ 。以枯草芽孢桿菌CGMCC1.897染色體為模板，利用上下游引物擴增目的基因PL。二、重組載體的構(gòu)建將回收的PL PCR擴增產(chǎn)物和載體PWB980，利用限制性內(nèi)切酶SalI和SphlI，37°C酶切過夜。酶切產(chǎn)物用I. 5%瓊脂糖凝膠電泳進行回收。按照PL pffB980摩爾比3:1比例進行連接反應(yīng)，22°C連接5h，得到重組表達質(zhì)粒pWB980-PL的連接產(chǎn)物，構(gòu)建過程見圖I?！?br> 三、宿主菌感受態(tài)細(xì)胞制備I、將宿主菌Bacillus subtilis 168在LB平板上活化。2、挑單菌落于5mLGMI培養(yǎng)基中，30°C，125r/min振蕩培養(yǎng)過夜。3、次日取過夜培養(yǎng)物ImL接到9mLGMI培養(yǎng)基中，37°C，200rpm,振蕩培養(yǎng)3. 5h。4、取2mL上一步的培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接到18mL的GMII培養(yǎng)基中，37°C，200r/min振蕩培養(yǎng)90分鐘。5、上一步培養(yǎng)液，5000g/min室溫離心10分鐘，收集菌體，用2mL原培養(yǎng)液上清重懸菌體，懸浮后的菌體即為感受態(tài)細(xì)胞。四、重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化宿主菌I、將全部連接產(chǎn)物與250uL制備好的宿主菌感受態(tài)細(xì)胞混合，37°C，200rpm，振蕩培養(yǎng)O. 5h。2、涂布含有30ug/mL卡納霉素的LB平板，篩選得到含有重組表達質(zhì)粒的枯草芽孢桿菌工程菌株，工程菌株命名為Bacillus subtilis PL。3、測序分析按照omega質(zhì)粒提取試劑盒的操作說明，提取重組菌Bacillus subtilis PL的質(zhì)粒，進行測序分析，驗證連接后獲得的是正確的表達閱讀框?？莶菅挎邨U菌168感受態(tài)細(xì)胞制備用溶液IOX 鹽溶液15%Κ2ΗΡ04· 3Η20, 6%ΚΗ2Ρ04, 2%(ΝΗ4)2S04, 0. 2%MgS04. 7H20,1% 檸檬酸
鈉，在蒸餾水中一次溶解，115 °C高溫滅菌，室溫貯存?？莶菅挎邨U菌168感受態(tài)細(xì)胞制備用培養(yǎng)基IOmLGMI 培養(yǎng)基9. 6ImLl X 鹽溶液，O. ImL 10% 酵母粉，O. 25mL 20% 葡萄糖，O. 04mL 5%水解酪蛋白。IOmLGMII 培養(yǎng)基9. 662mL I X 鹽溶液，O. 05mL 10% 酵母粉，O. 25mL 20% 葡萄糖O. 008mL 5% 水解酪蛋白，O. 025mL IMMgCl2 溶液，O. 005mL IM CaCl2 溶液。 實施例3堿性果膠酶基因PL的隨機點突變及突變文庫構(gòu)建利用易錯PCR對基因PL進行隨機點突變。一、易錯PCR條件的確定根據(jù)文獻經(jīng)驗，本發(fā)明中選用的Mn2+終濃度為O. 5mmol/L。在這個濃度下，根據(jù)不同Mg2+濃度下擴增出目的條帶的亮度和特異性，最終選擇Mg2+濃度為6mmol/L。
二、易錯PCR擴增以質(zhì)粒pWB980-PL為模板，上游引物PLF 5’CCGGTCGACGATGAAACGACTTTTTTTATGGTTC 3’ ；下游引物PLR :5’ CCAGCATGCTCAGTAGCCAAATACCAGAGTTG 3’，隨機突變堿性果膠酶
基因PL。每100 μ L 體系為IOxPCR buffer 10 μ L ;dATP (10mmol/L) 2 μ I ; dGTP(10mmol/L)2y I ;dCTP(50mmol/L) I. 0μ I ;dTTP (50mmol/L) I. Ομ I ;MgC12 (25mmol/L) 24 μ I ；弓 I 物PLF(10ymol/L)4y I ;引物 PLR(10 μ mol/L) 4 μ I ；ddH20 40. 5 μ I ；Mn2+ (5mmol/L) 10 μ L ；DNA Primerstar I μ I (5M/ μ I);模板 pWB980_PL 0· 5 μ I。反應(yīng)條件為94°C4min ；94°C lmin、60°C 40s,72°C lmin，30 個循環(huán)；72°C IOmin0三、突變文庫構(gòu)建I. 5%瓊脂糖凝膠檢測易錯PCR結(jié)果，同時用凝膠回收試劑盒回收PCR片段，具體操作按照Omega Gel Extraction Kit說明書進行。將回收產(chǎn)物經(jīng)SalI和SphII雙酶切，克隆到表達載體PWB980上，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化宿主菌Bacillus subtilis 168，構(gòu)建隨機突變文庫，共得到120個單菌落。實施例4突變文庫篩選和酶活測定分別挑取活化后的實施例3所述工程菌Bacillus subtilis PL和突變文庫中的120個重組枯草芽孢桿菌單菌落，接種于30mL種子培養(yǎng)基中，37°C，200rpm發(fā)酵培養(yǎng)10h，獲得種子液；按2%的接種量再將種子液轉(zhuǎn)接到30mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，370C，200rpm發(fā)酵培養(yǎng)24h，獲得發(fā)酵液；離心去除菌體，即得到含有堿性果膠酶的粗酶液。分別測定Bacillus subtilis PL和上述各突變重組菌株粗酶液中堿性果膠酶的酶活力，酶活測定方法如下酶活單位定義ImL酶液在45 °C，pH為9. O條件下，每分鐘使聚半乳糖醛酸裂解產(chǎn)生I μ mol的不飽和聚半乳糖醛酸的酶量。反應(yīng)體系中包括粗酶稀釋液20 μ L，0. 2%聚半乳糖醛酸的甘氨酸-氫氧化鈉(0. 2mol/L)緩沖液(pH9. 0，含有 0. 44mmol/L 的 CaCl2)2mL，反應(yīng)條件為 45°C溫育 15min，用3mL0. 03mol/L的磷酸終止反應(yīng)，在235nm處測定其吸光度值。酶空白將2mL上述緩沖體系配制的底物保溫2min后，依次加入3mL0. 03mol/L的磷酸和20 μ L與實驗樣相同稀釋倍數(shù)的滅活的酶液，混勻。其他操作與實驗樣相同。
OD235XIO6X 釋倍數(shù)X Jx應(yīng)混合液體ft!計算公式· , 活力 CU/niL)=——.....................................................................................................................................................................................................——
103>^4600\{^親_液體積式中4600 (L · Iiior1Cnr1)-不飽和聚半乳糖醒酸在235nm處的摩爾吸光系數(shù)t (min) 一酶促反應(yīng)時間(在酶反應(yīng)的線性范圍內(nèi))b (cm) 一比色杯厚度經(jīng)簡化酶活力(U/mL) =3. 6232 X稀釋倍數(shù)XOD235其中Bacillus subtilis PL (PL)和酶活較高的九株突變重組菌的堿性果膠酶酶活如表I所示。表I粗酶液中堿性果膠酶酶活比較
權(quán)利要求
1.一種堿性果膠酶突變體，其特征在于，所述的堿性果膠酶突變體的氨基酸序列為SEQID N0:4。
2.一種核苷酸，其特征在于所述的核苷酸用于編碼權(quán)利要求I所述的堿性果膠酶突變體。
3.如權(quán)利要求2所述的核苷酸，其特征在于所述的核苷酸的序列為SEQID N0:3。
4.一種重組載體，其特征在于所述的重組載體為攜帶有權(quán)利要求3所述的核苷酸片段的表達載體。
5.如權(quán)利要求4所述的重組載體，其特征在于所述的表達載體為原核表達載體。
6.用于表達權(quán)利要求I所述的堿性果膠酶突變體的枯草芽孢桿菌工程菌，其特征在于，所述的枯草芽孢桿菌工程菌攜帶有權(quán)利要求4所述的重組載體。
7.如權(quán)利要求6所述的枯草芽孢桿菌工程菌，其保藏編號為CGMCCNO. 6489。
8.權(quán)利要求I所述的堿性果膠酶突變體在紡織領(lǐng)域中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種堿性果膠酶突變體及其重組表達工程菌，所述的堿性果膠酶突變體，其氨基酸序列為SEQ ID NO:4；其編碼核苷酸序列為SEQ ID NO:3。用于表達上述突變體的枯草芽孢桿菌工程菌株，其保藏編號為CGMCC NO.6489。本發(fā)明的堿性果膠酶突變體在枯草芽孢桿菌中的表達量高達1140U/mL，是突變前的40多倍，且具有更好的酶學(xué)性質(zhì)，對溫度、pH和雙氧水的耐受性都得到很大的提高。本發(fā)明的堿性果膠酶突變體最適作用溫度為60℃，60℃處理20min后，仍能保留38%的酶活，是突變前的4倍；最適pH為9.0，在pH9.0條件下，60℃處理1h，仍能保留64.7%的酶活，是突變前的5.7倍；在含H2O2的緩沖體系中處理60min，仍能保留31.3%的酶活，是突變前的3.8倍。
文檔編號D06M16/00GK102899299SQ20121032633
公開日2013年1月30日 申請日期2012年9月6日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月6日
發(fā)明者肖志壯, 張霞, 王海, 劉魯民, 郝榮耀 申請人:青島蔚藍(lán)生物集團有限公司, 濰坊康地恩生物科技有限公司