專(zhuān)利名稱：?jiǎn)瓮僖核崴募禾巧窠?jīng)節(jié)苷脂的高純度制備工藝的制作方法
神經(jīng)節(jié)苷脂是一族異構(gòu)的含唾液酸殘基的結(jié)構(gòu)復(fù)雜的膜糖脂，其分子皆由一個(gè)疏水的神經(jīng)酰胺部分和一個(gè)親水的唾液酸寡糖基團(tuán)組成。神經(jīng)酰胺由鞘氨醇的氨基與脂肪酸酸化而成。神經(jīng)節(jié)苷脂分子既有水溶性，又有脂溶性。Sevennerholm按唾液酸殘基的位置和寡糖核心區(qū)的長(zhǎng)度，將神經(jīng)節(jié)苷脂分為不同的種類(lèi)，其中GM1為單唾液酸四已糖神經(jīng)節(jié)苷脂。
哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)中神經(jīng)節(jié)苷脂含量豐富，其中以神經(jīng)系統(tǒng)灰質(zhì)含量最高。據(jù)估計(jì)，以水解后的唾液酸計(jì)算大腦中每克新鮮灰質(zhì)和白質(zhì)含量分別為3000-3500nM和1000-1250nM，明顯高于其他組織。中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)節(jié)苷脂主要為神經(jīng)節(jié)系列，大腦灰質(zhì)多為GM1，GD1a，GD1b，(GD為二唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂)GT1b(GT為三唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂)，GQ1b(GQ為四唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂)，其次是GM2和GD3；白質(zhì)以GM1和GM4為主。神經(jīng)節(jié)苷脂在神經(jīng)元胞體中含量略低于平均水平，而在突觸小體中含量高于平均水平。對(duì)于單個(gè)神經(jīng)節(jié)苷脂而言，GT1，GD1b及GM1集中于突觸前后膜。神經(jīng)節(jié)苷脂位于神經(jīng)元細(xì)胞膜雙層結(jié)構(gòu)外層，神經(jīng)酰胺一端嵌入細(xì)胞膜內(nèi)，而寡糖鏈一端伸出細(xì)胞膜外突入外環(huán)境。神經(jīng)節(jié)苷脂的這種非對(duì)稱性分布以及它們的化學(xué)性質(zhì)差異使其特別易與各種細(xì)胞外信息發(fā)生相互反應(yīng)，從而在細(xì)胞膜活動(dòng)上充當(dāng)重要角色。實(shí)驗(yàn)證明外源性神經(jīng)節(jié)苷脂尤其是GM1能嵌入神經(jīng)細(xì)胞膜，模仿內(nèi)源性神經(jīng)節(jié)苷脂的某些功能，調(diào)節(jié)膜介導(dǎo)的細(xì)胞功能，并能刺激中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后潛在的代替機(jī)制阻止損害的發(fā)展，保護(hù)未受損的神經(jīng)組織，同時(shí)還能影響體外培養(yǎng)的神經(jīng)元的生長(zhǎng)及其活性，促進(jìn)其存活及生長(zhǎng)。神經(jīng)節(jié)苷脂GM1在神經(jīng)系統(tǒng)中的主要生理作用為1，促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞的生長(zhǎng)，分化發(fā)育和神經(jīng)再生2，參與突觸傳遞，維持腦的正常機(jī)能，參與各種學(xué)習(xí)記憶活動(dòng)3，在細(xì)胞與細(xì)胞，細(xì)胞與微生物以及細(xì)胞與基質(zhì)間的相互作用過(guò)程中起介導(dǎo)作用4，調(diào)節(jié)細(xì)胞膜中各種蛋白質(zhì)功能，如離子通道，表皮生長(zhǎng)因子受體等。由意大利Fidia公司從牛腦組織中提取的GM1注射液(商品名Sygen)已于90年代正式在我國(guó)銷(xiāo)售。由于GM1能通過(guò)血腦屏障，注射后快速在大腦和脊髓組織中分散，因此臨床上GM1的治療效果十分顯著。主要用于治療人血管性或創(chuàng)傷性中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷。如腦卒中、急性脊髓損傷和腦外傷。
CM1的研究已有數(shù)十年，目前已證明其結(jié)構(gòu)組成和理化性質(zhì)，主要?dú)w結(jié)為1.GM1分子由一個(gè)唾液酸，一個(gè)葡萄糖，二個(gè)半乳糖，一個(gè)氨基半乳糖及一個(gè)神經(jīng)酰胺殘基組成。分子式為 2，分子量1551，鈉鹽為15743，性狀為乳白色粉末，無(wú)味，有吸濕性，溶于水，甲醇-水及甲醇-氯仿溶液。不溶于甲醇，丙酮，氯仿，乙醚。熔點(diǎn)207-230攝氏度。
4，紫外吸收最大波長(zhǎng)位于205nm有特殊的紅外吸收光譜，可通過(guò)氨基正相柱高效液相色和薄層色譜(TLC)進(jìn)行純度鑒定。氣相色譜可鑒定GM1分子中糖基和神經(jīng)酰胺殘基。
神經(jīng)節(jié)苷脂及GM1提取和分離純化已有文獻(xiàn)和專(zhuān)利報(bào)道。其主要提取方法是豬腦或牛腦經(jīng)絞粹，用丙酮脫水制成丙酮粉。再用氯仿、甲醇、水混合有機(jī)溶劑提取[Svennerholm.et al Biochemical et Biophsica Acta，617-109(1980)]。提取物神經(jīng)節(jié)苷脂轉(zhuǎn)入水相[J.Folch，The Journal of Biological Chemistry，226，497-509(1957)].用DEAE-Sephadex-A25純化[R.w.Ledeen，et al.Journal ofNeurochemistry，21，829(1973)].硅膠層析，GM1得率達(dá)到14％。神經(jīng)節(jié)苷脂的分離有用a環(huán)糊精技術(shù)(EP00469352A1)，也用大孔徑樹(shù)脂吸附技術(shù)(CN85102590)。神經(jīng)節(jié)苷脂脫唾液酸方法有用唾液酸酶處理法(Richard Kuhn，etal.，ChemischeBerichte，1963.96.866).有用加熱處理法(US4868292)以及微生物處理方法(FukanoY，et al.，Appl Environ Microbiol，1997.63.1861)。GM1純化方法Momoi TaKashi建立了陰離子交換層析技術(shù)(Biochim Biophys Acta，1976，411，488)。親和層析技術(shù)(Krishna Kant，et al J.Chromato，1989.494289)等。
總神經(jīng)節(jié)苷脂的提取主要依據(jù)其本身的兩個(gè)性質(zhì)脂溶性和水溶性。根據(jù)其脂溶性，可用傳統(tǒng)的提取脂肪的方法把神經(jīng)節(jié)苷脂與其它脂類(lèi)一起從腦組織中提取出來(lái)，比如用20倍體積的氯仿-甲醇(2∶1)提取，幾乎所有脂類(lèi)都釋放到溶液中，但神經(jīng)節(jié)苷脂僅70％左右釋放。這主要是大多脂類(lèi)都是非極性，而神經(jīng)節(jié)苷脂具有一定極性。本發(fā)明改變了提取有機(jī)溶劑的極性，用氯仿-甲醇-水(1∶2∶0.75)這一個(gè)體系來(lái)提取神經(jīng)節(jié)苷脂，結(jié)果神經(jīng)節(jié)苷脂幾乎全部釋放到溶液中，而其他脂類(lèi)釋放不徹底。
用本發(fā)明改良的氯仿-甲醇-水(1∶2∶0.75)這一個(gè)體系來(lái)提取神經(jīng)節(jié)苷脂，除了神經(jīng)節(jié)苷脂釋放徹底之外，其他的極性脂類(lèi)如磷脂，硫脂等也大量釋放。為了減少它們的污染，根據(jù)其極性差異，調(diào)節(jié)氯仿-甲醇-水比例為1∶2∶1.4，此時(shí)有機(jī)溶劑開(kāi)始分層，經(jīng)測(cè)定神經(jīng)節(jié)苷脂全部進(jìn)入上層水相，而色素及大部分磷脂、硫脂分配到下層有機(jī)相。經(jīng)過(guò)兩步提取分層操作，神經(jīng)節(jié)苷脂含量從腦組織中的15％左右提高到上層水相的70％左右。腦組織中神經(jīng)節(jié)苷脂主要以GM1，GD1a，GD1b(二唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂)，GT1b(三唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂b)，GQ1b(四唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂b)。其中GD1和GT1b在結(jié)構(gòu)上與GM1僅僅是多一個(gè)和兩個(gè)唾液酸殘基，如能將其多余的唾液酸殘基去除轉(zhuǎn)變成CM1，就能提高整個(gè)CM1制備工藝中的產(chǎn)率。本發(fā)明使用弱酸條件下(PH3.0-5.0)加熱到80℃以上的處理方法，GD1a，GD1b和GT1b的末端唾液酸鏈會(huì)逐一水解掉剩下最后一個(gè)唾液酸殘基。本發(fā)明對(duì)牛腦組織中的總神經(jīng)節(jié)苷脂在不同酸溶液中加熱水解后的結(jié)果表明，其中GM1含量倍增2-3倍。
總神經(jīng)節(jié)苷脂酸水解產(chǎn)物中主要為GM1和其它神經(jīng)節(jié)苷脂、磷脂、硫脂、其中GM1和其它神經(jīng)節(jié)苷脂占80％以上。根據(jù)神經(jīng)節(jié)苷脂在唾液酸和酰氨基團(tuán)數(shù)目的差異，本發(fā)明選用陰離子交換層析將其分離。采用Q-Sepharose強(qiáng)陰離子介質(zhì)和DEAE型弱陰離子介質(zhì)的結(jié)果表明，總神經(jīng)節(jié)苷脂在介質(zhì)轉(zhuǎn)為乙酸型后，在低電導(dǎo)條件下能吸附在介質(zhì)上。然后用較低的鹽濃度有效地將GM1洗脫下來(lái)，同時(shí)除去部分磷脂和硫脂。經(jīng)過(guò)此步分離純化的GM1經(jīng)薄層色譜分析其純度在90％左右。
對(duì)于殘留的少量其他脂類(lèi)物質(zhì)，本發(fā)明根據(jù)其與GM1疏水性差異，用Sourse RPC 30反相介質(zhì)進(jìn)行分離純化的結(jié)果表明，此步所得GM1純度大于98％。由于GM1不溶于丙酮，分離純化所得高純度GM1溶液中加入10倍或更多的冷丙酮，沉淀結(jié)晶的GM1經(jīng)離心、真空干燥后得白色干粉。實(shí)例1總神經(jīng)節(jié)苷脂的提取20千克洗干凈的新鮮牛腦組織，用組織勻漿機(jī)勻漿，加入50升冷丙酮(-10℃)攪拌，-10℃放置過(guò)夜，離心取沉淀，上清減壓蒸發(fā)回收。沉淀置80℃烘烤過(guò)夜，得丙酮粉，約1千克。
1千克丙酮粉加入3升甲醇，1.5升氯仿，1.125升水。具體加入方法是先加入甲醇，攪拌2小時(shí)，再加入丙酮和水，室溫?cái)嚢柽^(guò)夜。然后離心收集上清，所得上清應(yīng)是清澈的有機(jī)溶劑混合液，加入0.975升水，溶液變?yōu)槿闋钜?，小心倒置兩次后靜止分層，取上清。此上清即為總神經(jīng)節(jié)苷脂粗提液。此粗提液加入1/10體積正辛醇減壓濃縮至干，加入500毫升水即溶解，可得總神經(jīng)節(jié)苷脂約25克，其中38％神經(jīng)節(jié)苷脂GD1a，20％神經(jīng)節(jié)苷脂GM1，21％神經(jīng)節(jié)苷脂GT1b，18％神經(jīng)節(jié)苷脂GD1b。實(shí)例2總神經(jīng)節(jié)苷脂的水解及脫鹽約含5克粗神經(jīng)節(jié)苷脂的水溶液100毫升，加入0.1N乙酸20毫升，溶液最終pH為4.0。該溶液放置于100℃水浴2小時(shí)，其pH變?yōu)?.56，經(jīng)TLC分析神經(jīng)節(jié)苷脂GD1a和GT1b部分水解為GM1，GM1含量增高2.6倍。
酸水解后含GM1水溶液用Sephadex G-25柱脫鹽，檢測(cè)波長(zhǎng)為214nm，收集洗脫峰，所得收集峰溶液約500毫升，電導(dǎo)約2000us.cm-1，得率約85％。實(shí)例3Q-Sepharose F.F.柱層析分離GM1脫鹽溶液500毫升含GM1約3.5克，減壓濃縮至1/20體積后，加入氯仿和甲醇。稀釋調(diào)節(jié)氯仿∶甲醇∶水比例為30∶60∶8，佳電導(dǎo)小于100單位，用NaOH調(diào)節(jié)pH為8.0。
Q Sepharose F.F乙酸化處理5倍體積氯仿-甲醇-1M乙酸鈉(30∶60∶8)懸浮填料，靜止后去上清，如此操作3次，然后用此溶液浸泡填料過(guò)夜。又用5倍體積氯仿-甲醇-水(30∶60∶8)懸浮填料，靜止后去上清，如此操作3次后裝柱，柱規(guī)格為20cm×50mm，填料柱體積300ml，裝柱后再用氯仿-甲醇-水(30∶60∶8)洗脫5倍柱體積，檢測(cè)波長(zhǎng)為214mn。
上樣溶液體積有約1.5升，以8毫升/分鐘速度上樣，上樣結(jié)束后用5倍柱體積氯仿-甲醇-水(30∶60∶8)平衡柱子，流速為20毫升/分鐘。再用氯仿-甲醇-水(30∶60∶8，0.015M乙酸鈉)洗脫GM1，約600毫升。接著用氯仿-甲醇-水(30∶60∶8，0.2M乙酸鈉)洗脫其它神經(jīng)節(jié)苷脂。所得GM1洗脫峰減壓濃縮至干，用原體積1/4體積水溶解，即為0.8M乙酸鈉水溶液。此層析所得GM1約2.8克，純度約90％，得率為80％。實(shí)例4Source RPC 30反相柱層析實(shí)例3所得GM1水溶液中乙酸鈉濃度為0.8M，體積150毫升中含GM1約2.8克，用NaOH調(diào)至pH9.0，37℃中保溫1小時(shí)后上樣Source RPC 30反相柱。柱規(guī)格為20cm×36mm，柱體積300毫升，以10毫升/分鐘流速上樣。經(jīng)5倍柱體積水溶液平衡柱子后用甲醇-水(2∶1)洗脫GM1。檢測(cè)波長(zhǎng)為214nm，收集洗脫峰200毫升。此步所得GM1約2.4克，得率大于85％，經(jīng)lichrospher NH4柱HPLC和TLC分析純度大于98％。實(shí)例5GM1干粉制備反相層析所得GM1溶液減壓濃縮成85ml后，加入1升冷丙酮(-10℃)，放置于-10℃中過(guò)夜后，GM1沉淀結(jié)晶析出。離心收集沉淀，用80℃水溶解，即得GM1水溶液或經(jīng)真空冷凍干燥后成乳白色干粉，約重2.2克。實(shí)例6GM1對(duì)體外雞胚背根神經(jīng)節(jié)原代神經(jīng)元樹(shù)突生長(zhǎng)的作用取實(shí)例5GM1加入DMEM/N1培養(yǎng)基，使終濃度為5×10-6M及1×10-5M。將8日齡雞胚背根神經(jīng)節(jié)原代神經(jīng)元以相同的培養(yǎng)基混合，每次取100ul細(xì)胞懸液加入96孔板(1500個(gè)細(xì)胞/孔)，培養(yǎng)4小時(shí)后，每孔加入含GM1 0.5×10-6M、1×10-5M的培養(yǎng)基100ul，繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)。結(jié)果表明GM1培養(yǎng)孔的樹(shù)突性神經(jīng)元比例較對(duì)照孔顯著增加(P＜0.05)。
權(quán)利要求
1.本專(zhuān)利中單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂(GM1)的高純度制備工藝特征在于用有機(jī)溶劑混合物從哺乳動(dòng)物腦組織中提取總神經(jīng)節(jié)苷脂，然后對(duì)總神經(jīng)節(jié)苷脂提取液濃縮后進(jìn)行酸水解以提高GM1含量，濃縮水解產(chǎn)物經(jīng)脫鹽后溶解于有機(jī)溶劑混合物中進(jìn)行陰離子交換柱層析，收集含GM1的洗脫峰，濃縮后再進(jìn)行反相柱層析。所得GM1于冷丙酮中沉淀，得純度大于98％的GM1干粉。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其特征在于提取總神經(jīng)苷脂所用有機(jī)溶劑混合物是氯仿-甲醇-水。提取總脂時(shí)其體積比例是氯仿-甲醇-水，1∶2∶0.75，分離總神經(jīng)節(jié)苷脂時(shí)其體積比例調(diào)節(jié)到氯仿-甲醇-水，1∶2∶1 4，腦組織與有機(jī)溶劑比例為1∶20(v/v)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其特征在于酸水解的條件是用無(wú)機(jī)酸將總神經(jīng)節(jié)苷脂水溶液pH調(diào)節(jié)到3.0-5.0，加熱溫度至80-100℃、水解時(shí)間2h。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其特征在于所用離子交換介質(zhì)為Q-Sepharose或DEAE-Sepharose型。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述方法，其特征在于所用離子交換介質(zhì)Q-SepharoseF.F.層析條件為(1).上樣條件a柱子用氯仿-甲醇-水，30∶60∶8，(v/v/v)，平衡到電導(dǎo)率小于50us.cm-1；b.樣品溶解于氯仿-甲醇-水，30∶60∶8，(v/v/v)，電導(dǎo)率小于100us cm-1，pH為8.0；(2)洗脫條件a.氯仿-甲醇-水，30∶60∶8，(v/v/v)，(0.015M乙酸鈉)，洗脫GM1；b.氯仿-甲醇-水，30∶60∶8，(v/v/v)，(0.2M乙酸鈉)，洗脫非GM1神經(jīng)節(jié)苷脂。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其特征在于所用反相介質(zhì)為Sourse RPC 30。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述方法，其特征在于減壓濃縮后GM1溶于含30％正丙醇的水溶液中，加入乙酸鈉定終濃度0.8M，再用NaOH調(diào)PH9.0，37℃中1小時(shí)后上樣SourcRPC30反相柱，經(jīng)水相洗脫后，用甲醇-水緩沖液(2∶1)洗脫下GM1。
全文摘要
本發(fā)明涉及從動(dòng)物腦組織中分離純化高純度的單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂(Monosialotetrahexosylganglioside,GM1)的工藝方法。該方法主要包括用有機(jī)溶劑混合物提取總神經(jīng)節(jié)苷脂,酸水解總神經(jīng)節(jié)苷脂,離子交換柱層析,反相柱層析等四步,所得GM1純度大于98%。由于GM1已用于臨床治療中樞神經(jīng)損傷疾病。故本發(fā)明所述GM1的制備方法適合于規(guī)?；a(chǎn)。
文檔編號(hào)C07H15/10GK1353112SQ0013307
公開(kāi)日2002年6月12日 申請(qǐng)日期2000年11月9日 優(yōu)先權(quán)日2000年11月9日
發(fā)明者范開(kāi), 王建, 馬素永, 張益 , 田峰, 聶李亞, 黃洪濤 申請(qǐng)人:重慶富進(jìn)生物醫(yī)藥有限公司