專利名稱：一種rna親和介質(zhì)及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體地說，是關(guān)于一種用于分離鑒定RNA專一結(jié)合蛋白的RNA親和介質(zhì)及其制備方法。
背景技術(shù)：
在分子生物學(xué)研究工作中，分離鑒定RNA專一的結(jié)合蛋白，是研究基因表達(dá)和調(diào)控的重要手段，同時也是研究疾病發(fā)生發(fā)展的分子機制的重要方法。
目前，分離鑒定RNA專一的結(jié)合蛋白的方法很多，其原理都是在試管內(nèi)模擬細(xì)胞微環(huán)境，在人工配制的結(jié)合緩沖液中使帶有目標(biāo)RNA的親和介質(zhì)與細(xì)胞蛋白質(zhì)溶液相接觸，以使靶RNA與其專一的結(jié)合蛋白相互結(jié)合，然后把結(jié)合蛋白洗脫下來并加以鑒定。這些方法中，核心部分是RNA親和介質(zhì)。
最簡單的親和介質(zhì)是將寡聚核糖核苷酸共價連接在高分子葡聚糖凝膠上，該類親和介質(zhì)已有商品銷售，比如Amersham Biosciences(PE Healthcare公司的分部)的系列產(chǎn)品除用于提純mRNA和cDNA外，尚可用來提純少數(shù)特殊的蛋白質(zhì)，如polyA結(jié)合蛋白。由于這種寡聚核糖核苷酸較短(通常為十幾個核苷酸殘基)，而且不能保證一定是以末端與葡聚糖凝膠連接，故其用途和專一性都比較有限。
目前用得較多的RNA親和介質(zhì)，是用活化劑(如溴化氰等)將載體(如葡聚糖凝膠等)的表面羥基活化，再使其與RNA共價連接(Kumel G.，Daus H.，Mauch H.Improvedmethod for the cyanogen bromide activation of agarose beads.J Chromatogr.1979；172221-6)。這種方法做成的親和介質(zhì)的用途較廣，可用來提純各種RNA結(jié)合蛋白。但其缺點仍然是在RNA分子上任何可能的位置都可形成共價鍵，因此不能保證RNA的所有部分均為自由狀態(tài)，從而使其結(jié)合蛋白的專一性和分離效率都會受影響。此外，溴化氰是劇毒物質(zhì)，實驗操作中有安全隱患。
還有一類親和介質(zhì)是使用具有鏈狀分子結(jié)構(gòu)的雙功能試劑，把RNA和載體連接起來(劉定干，李載平，用對-重氮苯砜乙基紙共價固定核酸的分子雜交方法，科學(xué)通報1982；27(16)1011-1014)。這類介質(zhì)中雖然RNA有較大的活動自由度，但由于雙功能試劑仍然可以在RNA分子所有可能的位置與其結(jié)合，有可能改變RNA分子的空間構(gòu)型，因此RNA與其結(jié)合蛋白的作用仍會受影響。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就在于克服現(xiàn)有RNA親和介質(zhì)的上述缺點和不足，從而提供一種新型的制備方便、生物識別能力強、可重復(fù)使用的RNA親和介質(zhì)。
本發(fā)明的另一個目的在于提供所述RNA親和介質(zhì)的制備方法。
本發(fā)明的RNA親和介質(zhì)包括用于固定DNA的固相載體；一端共價連接在所述固相載體上的線型單鏈DNA片段；附帶有一段與所述單鏈DNA的部分或全部核苷酸序列互補的RNA互補序列的靶RNA，其中所述RNA互補序列與所述單鏈DNA雜交相連。
上述RNA親和介質(zhì)中，所述DNA優(yōu)選多克隆位點方向相反、其余核苷酸序列相同的一對互逆克隆位點質(zhì)粒中的一個質(zhì)粒的線型單鏈DNA片段；所述一對互逆克隆位點質(zhì)粒優(yōu)選pSP64和pSP65。
上述RNA親和介質(zhì)中，所述固相載體優(yōu)選采用含有氨基基團的固相載體，最好是氨基硅烷化的玻璃微粒(玻璃粉)。
本發(fā)明的RNA親和介質(zhì)的制備方法包括如下步驟(a)將一對互逆克隆位點質(zhì)粒中一個質(zhì)粒的線型雙鏈DNA片段的一端共價結(jié)合在固相載體上，得到雙鏈DNA-固相載體；(b)將所述靶RNA的基因或cDNA克隆入另一個互逆克隆位點質(zhì)粒，形成重組質(zhì)粒；(c)將重組質(zhì)粒進行酶切，得到在其基因或cDNA的末端延伸了一段所克隆質(zhì)粒的DNA片段的DNA序列；(d)將步驟(c)所得DNA序列進行體外轉(zhuǎn)錄，得到附帶有一段與步驟(a)所述DNA部分或全部序列互補的RNA互補序列的靶RNA；(e)將步驟(a)所得雙鏈DNA-固相載體加入到含有靶RNA的復(fù)性緩沖溶液中，加熱使DNA變性為單鏈DNA，并通過逐漸降溫使靶RNA與單鏈DNA復(fù)性連接。
本發(fā)明的RNA親和介質(zhì)用于分離鑒定蛋白時，靶RNA的序列完全自由懸浮在溶液中，使得RNA靶序列和溶液中的蛋白分子在接近于天然條件下相互識別并結(jié)合，然后把與RNA專一結(jié)合的蛋白洗脫下來即可用于鑒定。
相比現(xiàn)有的RNA親和介質(zhì)，本發(fā)明的RNA親和介質(zhì)具有選擇性強、制備容易、可重復(fù)利用等優(yōu)點。


圖1為本發(fā)明的親和介質(zhì)中靶RNA的轉(zhuǎn)錄流程圖，其中，重組質(zhì)粒pSP64/0.28用PvuII切成線型，然后轉(zhuǎn)錄為附帶有一段“尾巴”的靶RNA。圖中帶有圓圈的P代表DNA或RNA鏈5’端的磷酸基團。
圖2為本發(fā)明的親和介質(zhì)中質(zhì)粒DNA與氨基硅烷化的玻璃粉共價連接示意圖，質(zhì)粒pSP65用EcoR I切成線型，并與玻璃粉表面的氨基共價連接，用HindIII酶切后形成雙鏈DNA-玻璃粉；加熱使DNA變性，得到單鏈DNA-玻璃粉。圖中，酶切位點的括弧表示該位點已不存在，此時DNA是單鏈。
圖3為靶RNA與固定在玻璃粉表面的質(zhì)粒DNA連接示意圖，靶RNA的3’-端附帶的“尾巴”與單鏈DNA-玻璃粉上的DNA復(fù)性形成雜合雙鏈。
圖4為親和結(jié)合的蛋白的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳圖，圖中A為結(jié)合前的細(xì)胞蛋白液；B為結(jié)合后的細(xì)胞蛋白液；C為與RNA-DNA-玻璃粉結(jié)合的蛋白(箭頭所示)；D為與單鏈DNA-玻璃粉結(jié)合的蛋白(極少，用考馬斯亮藍(lán)染色不能染出)；MW為蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)，自上至下依次為94kDa、66kDa、44kDa、29kDa。
圖5為RNA親和介質(zhì)重復(fù)使用2次后蛋白的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳圖，圖中MW為蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)，自上之下依次為94kDa、66kDa、44kDa；洗脫為從RNA-DNA-玻璃粉上洗脫的蛋白；未吸附為經(jīng)過結(jié)合反應(yīng)后的細(xì)胞蛋白液；原液為結(jié)合反應(yīng)前的細(xì)胞蛋白液。
具體實施例方式
下面結(jié)合附圖和實施例，對本發(fā)明作進一步的詳細(xì)說明。需要指出的是，本發(fā)明要求的保護范圍并不限于下述實施例的具體形式。
眾所周知，在分子生物學(xué)領(lǐng)域存在著其多克隆位點方向相反，而其余核苷酸序列完全相同的互逆克隆位點質(zhì)粒，比如pSP64和pSP65，其全序列可見美國國家醫(yī)學(xué)圖書館的GenBank序列數(shù)據(jù)庫，網(wǎng)址www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez。利用其結(jié)構(gòu)上的特點，可以在一個質(zhì)粒上克隆出與另一互逆克隆位點質(zhì)粒DNA部分序列相同的DNA片段，進而精確地轉(zhuǎn)錄出與互逆克隆位點質(zhì)粒DNA部分序列互補的RNA。
RNA與單鏈DNA可以通過配對堿基間的氫鍵相連接，DNA可以通過共價結(jié)合方式與某些固相載體連接，這些方法都是本技術(shù)領(lǐng)域熟知的技術(shù)，利用它們之間的連接關(guān)系可以構(gòu)建出一種新型的RNA親和介質(zhì)，使得RNA分子完全處于自由狀態(tài)，將妨礙蛋白質(zhì)與RNA相互作用的因素減到最少，從而使該親和介質(zhì)能高效而專一地提取蛋白。
本發(fā)明中，所述“互逆克隆位點質(zhì)?！笔侵高@樣的一對質(zhì)粒，它們之間的差異僅僅是其多克隆位點的方向相反，而其余核苷酸序列完全相同。比如pSP64和pSP65的結(jié)構(gòu)就有這樣的特點。
本發(fā)明中，所述“靶RNA”是指可以和某種蛋白質(zhì)專一性結(jié)合的RNA序列。
本發(fā)明中，所述“尾巴”是指靶RNA附帶的一段RNA序列，用于與單鏈DNA片段的雜交(雜合)連接，也稱為“RNA互補段”或“RNA互補序列”。
本發(fā)明中，所述“DNA-固相載體”是指雙鏈DNA或單鏈DNA一端與固相載體相連接形成的固相介質(zhì)。
本發(fā)明中，所述“RNA-DNA-玻璃粉”是指靶RNA、單鏈DNA和氨基硅烷化的玻璃微粒相連接形成的RNA親和介質(zhì)。
本發(fā)明中，所述“序列包括量”是指蛋白質(zhì)作質(zhì)譜分析時被擊成小分子的碎片，這些碎片的分子量和序列隨即被質(zhì)譜儀所監(jiān)測和分析。將這些小分子碎片的分子量和序列，與計算機數(shù)據(jù)庫中儲存的已知的蛋白質(zhì)序列進行比較，碎片可以和某一已知序列的相應(yīng)部分重合。重合的碎片與全部已知序列的比值即為序列包括量。序列包括量越大，結(jié)果就越肯定。
本發(fā)明以核轉(zhuǎn)錄因子C/EBPβ的mRNA的3’-非翻譯區(qū)為靶RNA，以pSP64和pSP65為互逆克隆位點質(zhì)粒，并以氨基硅烷化的玻璃微粒為固相載體，制備出一種RNA親和介質(zhì)，從細(xì)胞蛋白液中分離出靶RNA的專一結(jié)合蛋白并進行了鑒定。
實施例1、帶有“尾巴”的靶RNA的制備1.1、核轉(zhuǎn)錄因子C/EBPβ的mRNA的3’-非翻譯區(qū)的長度為0.28kb的cDNA，具體核苷酸序列見劉定干等(劉定干，朱麗華，陳珍珍，野田亮，郭禮和，李載平，具有抗癌基因活性的一個cDNA克隆的核苷酸序列，生物化學(xué)與生物物理學(xué)報1991；23(3)246-250)的文獻，將其正向克隆入質(zhì)粒pSP64(Promega公司)的多克隆位點。克隆的具體操作見劉定干等(劉定干，審良靜男，岸本忠三，李載平，回復(fù)系RR中一種與回復(fù)相關(guān)的蛋白表達(dá)增強，中國科學(xué)B輯1995；25(4)372-378)，得到重組質(zhì)粒pSP64/0.28。如圖1所示，在質(zhì)粒多克隆位點的下游，用PvuII酶切線性化重組質(zhì)粒pSP64/0.28，得到包含有pSP啟動子和0.28kb cDNA的線型DNA。
1.2、用試劑盒(RiboMax large scale RNA production kit，Promega公司)對上述線性化質(zhì)粒DNA進行大規(guī)模體外轉(zhuǎn)錄。按kit所附說明書提純轉(zhuǎn)錄的RNA，得到在3’-端附帶有一段“尾巴”的0.28kb的RNA靶序列(圖1)，該“尾巴”與質(zhì)粒pSP64的線型DNA中EcoR I與PvuII之間的DNA序列互補。
實施例2、玻璃粉載體的處理和氨基硅烷化普通玻璃粉(50～100目)用氯仿洗去油污后，依次用5NNaOH和5N HCl充分洗滌，再用大量蒸餾水沖洗以除去殘留的HCl，烘干備用。
潔凈的玻璃粉浸泡在3-氨基丙基三乙氧基硅烷(購自Sigma公司)的50％丙酮溶液中，室溫下浸泡半小時，再用丙酮充分洗去殘留的3-氨基丙基三乙氧基硅烷，50℃烘干備用。
實施例3、在氨基硅烷化玻璃粉載體表面固定DNA3.1、如圖2所示，質(zhì)粒pSP65(Promega)用EcoR I酶切線性化，具體條件如下質(zhì)粒pSP65 20mg 2mL10倍濃度EcoR I緩沖液250μL0.1％牛血清白蛋白 250μLEcoR I 1000單位(100μL)37℃保溫過夜(12～16小時)。
次日，取2μL電泳檢查是否完全酶解；如酶解未完全，則再加1000單位EcoR I，繼續(xù)保溫4小時，電泳檢查確認(rèn)已酶切完全。
3.2、酶切完全的反應(yīng)液用等體積Tris-HCl(pH 8)飽和的酚/氯仿(v/v 1∶1)抽提一次，氯仿抽提一次，取出水相，加二倍體積的無水乙醇，臺式離心機12000rpm離心20分鐘，沉淀pSP65質(zhì)粒DNA。
得到的線型pSP65DNA含有HindIII酶切位點，在HindIII和PvuII位點間的DNA序列與質(zhì)粒pSP64的線型DNA中EcoR I與Pvu II之間的DNA序列相同(圖1)，并且與靶RNA的“尾巴”互補。
3.3、向10mg(20mg/mL)質(zhì)粒DNA溶液中加入7mg 1-乙基-3-(3-二甲氨基)丙基碳二亞胺(EDC)結(jié)晶和10mg N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)結(jié)晶，攪拌溶解后于室溫下保溫30min，用二倍體積的無水乙醇沉淀DNA。沉淀溶于300μL TE(10mmol/LTris-HCl(pH8.0)，1mmol/L EDTA)溶液，加入0.5g氨基硅烷化玻璃粉載體，室溫振搖2hr。停止振搖，使玻璃粉自行沉淀，去除上清液，用TE洗玻璃粉3次，每次1mL。
3.4、小心吸盡液體，加入剛好淹沒玻璃粉的含200單位限制酶HindIII的1×HindIII酶緩沖液，37℃保溫2hr。用TE洗凈玻璃粉，懸于TE中，在-20℃保存?zhèn)溆谩?br> 3.5、DNA與玻璃粉的連接效率用放射性同位素方法鑒定取1μL(1μg)線型的pSP65DNA，用5’[γ-32P]ATP和T4多核苷酸激酶標(biāo)記5’端(參見《分子克隆實驗指南》(第二版).Sambrook(美)編著，金冬雁、黎孟楓譯.科學(xué)出版社，北京，1996)。在上述線型的pSP65DNA中混合約105cpm的標(biāo)記pSP65DNA，按照實施例3.3的方法進行固定，固定后的玻璃粉用TE洗5次，每次1mL，然后測定玻璃粉的放射性。以下列公式計算與玻璃粉連接的pSP65DNA的量與玻璃粉連接的pSP65DNA的量(mg)＝和玻璃粉混合的pSP65DNA的量(mg)×(玻璃粉上的放射性量(cpm)/和pSP65DNA混合的放射性pSP65DNA的量)(cpm)。
經(jīng)測量，本實施例中玻璃粉上的放射性量為1.6×104cpm，和pSP65DNA混合的放射性pSP65DNA的量為1×105cpm，故玻璃粉連接的pSP65DNA的量為3.2mg/g玻璃粉。
實施例4、靶RNA和DNA的復(fù)性連接4.1、將1mg C/EBPβ的mRNA的3’非翻譯區(qū)RNA溶于250μLRNA復(fù)性緩沖液(20mM HEPES pH 7.8，2mM EDTA，90mM NaCl)，加入雙鏈DNA-玻璃粉0.6克，密封于離心管內(nèi)，在500mL H2O中加熱到90℃，保溫2min，使雙鏈DNA變性解鏈變?yōu)閱捂淒NA(如圖2所示)；然后在原水浴中自然冷卻到37℃并保溫1hr，使靶RNA和單鏈DNA復(fù)性連接(如圖3所示)，再自然冷卻到4℃。用冰冷(0～4℃)的RNA復(fù)性緩沖液洗5次，每次1mL，除去液體，于4℃下保存。
得到靶RNA、單鏈DNA和氨基硅烷化的玻璃微粒相連接形成的RNA親和介質(zhì)，簡稱為RNA-DNA-玻璃粉。
4.2、靶RNA和DNA的連接效率用放射性同位素方法鑒定用5’[α-32P]UTP和Riboprobe試劑盒(Promega公司)標(biāo)記5’端(標(biāo)記方法見該試劑盒所附的說明書)。在上述RNA中混合約5×104cpm的標(biāo)記RNA，按照實施例4.1的方法進行固定，固定后的玻璃粉用冰冷(0～4℃)的RNA復(fù)性緩沖液洗5次，每次1mL，然后測定玻璃粉的放射性。以下列公式計算與玻璃粉連接的RNA的量與玻璃粉連接的RNA的量(μg)＝固定所使用的RNA的量(μg)×(玻璃粉上的放射性量(cpm)/和RNA混合的放射性RNA的量(cpm))。
經(jīng)測量，本實施例中玻璃粉上的放射性量為1.5×103cpm，和RNA混合的放射性RNA的量為5×104cpm，故單鏈DNA-玻璃粉連接的RNA的量為50μg/g玻璃粉。
實施例5、細(xì)胞可溶性蛋白的抽提和與靶RNA的專一結(jié)合5.1、本實施例的所有操作皆在4℃下進行。107個SMMC-7721人肝癌細(xì)胞(購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫)加入1mL 250mM蔗糖、1mg/mL毛地黃皂苷的溶液，迅速攪勻，立即在Eppendorf 5417R高速冷凍離心機(美國Eppendorf公司)上12000rpm離心3min。上清即為細(xì)胞蛋白液。
5.2、在1mL細(xì)胞蛋白液中加入0.5g RNA-DNA-玻璃粉，再加入0.2mL 5×結(jié)合緩沖液(200mM KCl，15mM MgCl2，50mM HEPES pH 7.8，5mM DTT，15％v/v甘油，50mg/mL肝素鈉，200μg/mL酵母tRNA)，在0～4℃振蕩保溫4小時至過夜。用無靶RNA的單鏈DNA-玻璃粉為對照，其中單鏈DNA-玻璃粉是RNA-DNA-玻璃粉在TE中加熱到95℃，除去RNA后得到的固相介質(zhì)。
實施例6、專一結(jié)合的蛋白的洗脫、電泳分離和鑒定6.1、結(jié)合有蛋白的RNA-DNA-玻璃粉和單鏈DNA-玻璃粉在0～4℃下用1×結(jié)合緩沖液洗5次，每次1mL。吸凈液體，加250μL的1×SDS蛋白電泳上樣液，100℃保溫2min。吸出液體，適當(dāng)濃縮后(在80℃繼續(xù)保溫2～5min)，上8％SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳。用考馬斯亮藍(lán)R-250染色，切下蛋白區(qū)帶，進行質(zhì)譜分析。
6.2、蛋白的電泳圖見圖4。由圖4可知，RNA-DNA-玻璃粉的洗脫液電泳后在分子量約50kDa范圍內(nèi)表現(xiàn)3條明顯的蛋白質(zhì)區(qū)帶；而單鏈DNA-玻璃粉的洗脫液在同樣范圍內(nèi)則沒有明顯的區(qū)帶。這就表明，這3條區(qū)帶(即3個蛋白質(zhì))是專一地結(jié)合于0.28kb RNA(靶RNA)的，同時單鏈DNA-玻璃粉對這3個蛋白的分離效率遠(yuǎn)低于RNA親和介質(zhì)。
6.3、將電泳得到的3個蛋白質(zhì)送交新加坡國立大學(xué)蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)組中心進行質(zhì)譜分析，分析結(jié)果為蛋白質(zhì)1 波形蛋白[人]gi|4507895；分?jǐn)?shù)601；標(biāo)稱分子量(Mr)53710；計算pI值5.06；分類Homo sapiens；序列包括量54％。
蛋白質(zhì)2 細(xì)胞角蛋白8gi|181573；分?jǐn)?shù)452；標(biāo)稱分子量(Mr)53529；計算pI值5.52；分類Homo sapiens；序列包括量42％。
蛋白質(zhì)3 細(xì)胞角蛋白18(424AA)[人]gi|30311；分?jǐn)?shù)877；標(biāo)稱分子量(Mr)47305；計算pI值5.27；分類Homo sapiens；序列包括量53％。
6.4質(zhì)譜分析結(jié)果證明這些蛋白分別為波形蛋白(vimentin)、細(xì)胞角蛋白8和18(cytokeratins 8and 18)。這3個蛋白是細(xì)胞蛋白液中專一地結(jié)合于0.28kb RNA的蛋白。
實施例7、RNA親和介質(zhì)的重復(fù)使用性上述蛋白質(zhì)分離后，RNA-DNA-玻璃粉在TE中加熱到95℃，并保持1分鐘，以除去RNA。棄去液體，隨即在冰水中冷卻，得到的單鏈DNA-玻璃粉于4℃保存。
取0.3g處理過的單鏈DNA-玻璃粉，替代雙鏈DNA-玻璃粉與0.5mg 0.28kb RNA按實施例4的方法復(fù)性連接，得到的RNA-DNA-玻璃粉再按實施例5和6的方法進行與細(xì)胞蛋白液的結(jié)合反應(yīng)、洗脫和電泳分析，結(jié)果如圖5所示。
由圖5的結(jié)果可見，第2次重復(fù)實驗中洗脫液的電泳結(jié)果與圖4所示RNA親和介質(zhì)的首次結(jié)合蛋白反應(yīng)的電泳結(jié)果無明顯區(qū)別。上述實驗表明RNA親和介質(zhì)可以重復(fù)使用，同時再次證明波形蛋白、細(xì)胞角蛋白8和18是0.28kb RNA的專一結(jié)合蛋白。
雖然以上僅以pSP64和pSP65作為互逆克隆位點質(zhì)粒、以核轉(zhuǎn)錄因子C/EBPβ的mRNA的3’-非翻譯區(qū)為靶RNA、并以氨基硅烷化的玻璃微粒為固相載體為例，對本發(fā)明的技術(shù)方案進行了驗證，但是根據(jù)本發(fā)明的公開，采用其他種類互逆克隆位點質(zhì)粒和固相載體同樣可以方便地制備出RNA親和介質(zhì)，這對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說是顯而易見的。因此，采用其他種類互逆克隆位點質(zhì)粒及固相載體制備用于分離鑒定RNA專一結(jié)合蛋白的RNA親和介質(zhì)，同樣應(yīng)屬于本發(fā)明的范圍。
綜上所述，本發(fā)明的RNA親和介質(zhì)制備方法并不復(fù)雜，在分離鑒定RNA專一的結(jié)合蛋白中，表現(xiàn)出較高的生物識別能力，選擇性強，并可重復(fù)利用。因此，本發(fā)明的RNA親和介質(zhì)可廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)領(lǐng)域和藥物開發(fā)。
權(quán)利要求
1.一種RNA親和介質(zhì)，其特征在于包括用于固定DNA的固相載體；一端共價連接在所述固相載體上的線型單鏈DNA；附帶有一段與所述DNA的部分或全部核苷酸序列互補的RNA互補序列的靶RNA，所述RNA互補序列與所述單鏈DNA雜交相連。
2.如權(quán)利要求1所述的RNA親和介質(zhì)，其特征在于，所述固相載體是含有氨基基團的固相載體。
3.如權(quán)利要求1所述的RNA親和介質(zhì)，其特征在于，所述固相載體是氨基硅烷化玻璃微粒。
4.如權(quán)利要求1所述的RNA親和介質(zhì)，其特征在于，所述DNA是多克隆位點方向相反、其余核苷酸序列相同的一對互逆克隆位點質(zhì)粒中的一個質(zhì)粒的線型單鏈DNA片段。
5.如權(quán)利要求4所述的RNA親和介質(zhì)，其特征在于，所述一對互逆克隆位點質(zhì)粒是pSP65和pSP64。
6.一種RNA親和介質(zhì)的制備方法，其特征在于包括如下步驟(a)將一對互逆克隆位點質(zhì)粒中一個質(zhì)粒的線型雙鏈DNA片段的一端共價結(jié)合在固相載體上，得到雙鏈DNA-固相載體；(b)將所述靶RNA的基因或cDNA克隆入另一個互逆克隆位點質(zhì)粒，形成重組質(zhì)粒；(c)將重組質(zhì)粒進行酶切，得到在其基因或cDNA的末端延伸了一段所克隆質(zhì)粒的DNA片段的DNA序列；(d)將步驟(c)所得DNA序列體外轉(zhuǎn)錄，得到附帶有一段與步驟(a)所述質(zhì)粒DNA部分或全部序列互補的RNA互補序列的靶RNA；(e)將步驟(a)所得雙鏈DNA-固相載體加入到含有靶RNA的復(fù)性緩沖溶液中，加熱使DNA變性為單鏈DNA，并通過降溫使靶RNA與單鏈DNA復(fù)性連接。
7.如權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征在于，所述一對互逆克隆位點質(zhì)粒是pSP65和pSP64。
8.如權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征在于，所述固相載體是含有氨基基團的固相載體。
9.如權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征在于，所述固相載體是氨基硅烷化玻璃微粒。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用于分離鑒定RNA專一結(jié)合蛋白的RNA親和介質(zhì)及其制備方法，將質(zhì)粒pSP65的DNA片段的一端固定在氨基硅烷化的玻璃粉上，形成雙鏈DNA－玻璃粉；將靶RNA的基因或cDNA克隆入另一互逆克隆位點質(zhì)粒pSP64，得到重組質(zhì)粒；通過酶切得到核苷酸序列延長了的DNA片段，并體外轉(zhuǎn)錄出附帶有RNA互補段的RNA靶序列，該RNA互補段與質(zhì)粒pSP65的一段DNA序列互補；將雙鏈DNA－玻璃粉和RNA靶序列共熱后逐漸冷卻，使RNA靶序列和單鏈DNA雜交連接，形成一種新型的RNA親和介質(zhì)。本發(fā)明的RNA親和介質(zhì)具有制備容易、選擇性強、可重復(fù)利用等優(yōu)點。
文檔編號C07H21/00GK1912135SQ20051002864
公開日2007年2月14日 申請日期2005年8月10日 優(yōu)先權(quán)日2005年8月10日
發(fā)明者劉定干 申請人:中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院