GhTZF1基因在增強植物抗旱性及延緩衰老中的應(yīng)用的制作方法【專利摘要】本發(fā)明屬于植物基因工程【
技術(shù)領(lǐng)域：
】，具體涉及一種分離自棉花的GhTZF1基因的分離克隆、功能驗證及應(yīng)用。本發(fā)明克隆的GhTZF1基因的cDNA序列如SEQ?ID?NO：1所示；其編碼基因的氨基酸序列如SEQ?ID?NO：2所示。本發(fā)明還公開了該基因在提高擬南芥對干旱的耐受性及延緩干旱脅迫下的植株衰老中的應(yīng)用?！緦＠f明】GhTZFI基因在增強植物抗旱性及延緩衰老中的應(yīng)用【
技術(shù)領(lǐng)域：
】[0001]本發(fā)明屬于植物基因工程【
技術(shù)領(lǐng)域：
】。具體涉及一種從棉花中分離、鑒定的CCCH型轉(zhuǎn)錄因子GhTZFl的功能驗證與應(yīng)用。功能驗證表明GhTZFl基因能提高擬南芥對干旱的耐受性以及能夠延緩干旱誘導(dǎo)的衰老，同時也能延緩H2O2誘導(dǎo)的衰老。利用本發(fā)明克隆的GhTZFl基因，通過遺傳轉(zhuǎn)化可應(yīng)用于增強植物對干旱的耐受性以及延緩干旱造成的衰老。【
背景技術(shù)：
】[0002]干旱是指可充足利用的水分短缺而導(dǎo)致產(chǎn)量減少，或者指一段時間沒有降雨或者灌溉而影響作物的生長的一種狀態(tài)(Bernieretal.,2008,Breedinguplandricefordroughtresistance.JournaloftheScienceofFoodandAgriculture,88:927-939)。據(jù)統(tǒng)計，全球約1/3的可耕地處于供水不足的狀態(tài)，而其他耕地也常受到周期性的難以預(yù)料的旱災(zāi)影響，干旱嚴重制約著農(nóng)業(yè)生產(chǎn)(Salekdehetal.,2009,Conceptualframeworkfordroughtphenotypingduringmolecularbreeding.Trendsinplantscience,14:488-496)。在非生物逆境脅迫中，干旱是影響農(nóng)作物產(chǎn)量的主要非生物因素。干旱在我國平均每兩年發(fā)生一次，嚴重影響了糧食作物和經(jīng)濟作物的生長與產(chǎn)量，因此通過抗旱育種提高作物的抗旱性或耐旱性已成為干旱和半干旱地區(qū)發(fā)展農(nóng)業(yè)的重要手段之O[0003]植物的葉片衰老是植物發(fā)育進程的一部分，伴隨著年齡增長而發(fā)生。但是，植物的葉片衰老也受各種各樣的內(nèi)部和外部環(huán)境因子影響。對農(nóng)作物而言，葉片衰老會限制農(nóng)作物產(chǎn)量。影響葉片衰老的環(huán)境因子包括生物和非生物逆境，如:干旱、極端溫度、饑餓、氧化脅迫、病原侵染等(Limetal.，2007，LeafSenescence.AnnualReviewofPlantBiology,58:115-136)。作物受到干旱脅迫后，葉片的光合速率和呼吸速率受到影響，葉片衰老加速，作物生長受到抑制，在細胞水平上，膜脂過氧化，細胞物質(zhì)代謝紊亂(黃沆和陳光輝，2010，水稻抗旱機制及相關(guān)基因研究進展，科技信息)。[0004]由逆境脅迫引起的葉片衰老可能是由活性氧的產(chǎn)生而造成的葉綠體降解(RenuKhanna-Chopraj2012，Leafsenescenceandabioticstressessharereactiveoxygenspecies-mediatedchloroplastdegradation.Protoplasma,249:469-481)。前人研究表明干旱誘導(dǎo)的衰老是由于葉綠體抗氧化保護的缺失而引起的(Boschetal.，2001，Drought-1nducedsenescenceischaracterizedbyalossofantioxidantdefencesinchloroplast.Plant,CellandEnvironment,24:1319-1327)0黑暗誘導(dǎo)的葉片衰老是由于活性氧增加而導(dǎo)致葉綠素降解(Rosenvasseretal.，2006，Increaseinreactiveoxygenspecies(ROS)andinsenescence-associatedgenetranscript(SAG)levelsduringdark-1nducedsenescenceofPelargoniumcuttings,andtheeffectofgibberellicacid.Plantscience，170(4):873-879)。通過對耐干旱和不耐干旱的作物比較發(fā)現(xiàn)作物對干旱的耐受性是由于增強了抗氧化脅迫的能力(ChopraandSelotej2007，EnvironmentalandExperimentalBotany.60，276-283)。通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)來延緩葉片的衰老而增強了植株的抗旱性的研究也有少量報道。在煙草中通過SARK啟動子驅(qū)動表達IPT基因，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株抗旱性顯著提高；在干旱脅迫下，轉(zhuǎn)基因植株衰老延緩，體內(nèi)雙氧水含量低于野生型，同時抗氧化保護的物質(zhì)高于野生型(Riveroetal.，2007.Delayedleafsenescenceinducesextremedroughttoleranceinafloweringplant.PNAS)。將擬南芥14_3_3蛋白轉(zhuǎn)入棉花后,發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株衰老延緩,抗旱性提高(Yanetal.,2004,OverexpressionoftheArabidopsisl4-3_3proteinGF14Aincottonleadstoa“stay-green，，phenotypeandimprovesstresstoleranceundermoderatedroughtconditions.Plantandcellphysiology,45，1007-1014)。綜合前人研究表明，植株調(diào)控活性氧水平的能力與其耐逆境脅迫的能力相關(guān)，植物具有一套自我保護和修復(fù)機制來抵御體內(nèi)的氧化脅迫，包括一些將(V離子轉(zhuǎn)化成雙氧水以及清除雙氧水的酶和一些維持細胞內(nèi)氧化還原穩(wěn)態(tài)的抗氧化保護物質(zhì)。[0005]在擬南芥中，CCCH類鋅指蛋白具有68個成員，它們具有一個典型的鋅指結(jié)構(gòu)域由CX6_14Cx4_5Cx3H組成，其中X代表任意氨基酸。CCCH類鋅指蛋白具有1-6個CCCHmotifs，根據(jù)鋅指結(jié)構(gòu)域中半胱氨酸和組氨酸的距離和鋅指結(jié)構(gòu)域的數(shù)目，將擬南芥CCCH超家族分為11個亞家族。其中第九亞家族是植物所特有的串聯(lián)鋅指蛋白，該亞家族除具有典型的Cx7Cx5Cx3H-X16-Cx5Cx4Cx3H串聯(lián)鋅指結(jié)構(gòu)域外，在其上游還具有一個植物所特有的鋅指結(jié)構(gòu)域Cx5H-X4-Cx3H,其中X代表任意氨基酸。表達分析表明該亞家族成員可能參與了植物對逆境的響應(yīng)(Wangetal.,2008,Genome-wideanalysisofCCCHzincfingerfamilyinArabidopsisandrice.BMCGenomics,9，44)。迄今為止，一些植物特有的TZF基因的功能相繼被報道。PEIl(AtTZF6)參與了擬南芥胚胎發(fā)育過程(ZhongsenLiandTerryL.Thomas,1998,ThePlantCell,10,383-398)；SOMNUS(AtTZF4)參與了光依賴的種子萌發(fā)(Kimetal.,2008,S0MNUS,aCCCH-TypeZincFingerProteininArabidopsis,NegativelyRegulatesLight-DependentSeedGerminationDownstreamofPIL5.ThePlantCell,20,1260-1277)；AtSZFl(AtTZFll)和AtSZF2(AtTZFlO)負調(diào)控了鹽響應(yīng)基因的表達而參與了植物對高鹽的響應(yīng)過程(Sunetal.,2007,TheCCCH-TypeZincFingerProteinsAtSZFlandAtSZF2RegulateSaltStressResponsesinArabidopsis.PlantCellPhysiol.48(8)，1148-1158)。這些植物特有的TZF基因參與了一些發(fā)育和逆境響應(yīng)過程，但是對相應(yīng)的調(diào)控機制仍然有待挖掘。在煙草中超量表達GhZFPl增強了轉(zhuǎn)基因煙草的耐鹽性以及提高了轉(zhuǎn)基因煙草的抗病性，酵母雙雜交結(jié)果顯示該基因可能與RD21A和PR5互作(Guoetal.,2009,GhZFPl,anovelCCCH-typezincfingerproteinfromcotton,enhancessaltstresstoleranceandfungaldiseaseresistanceintransgenictobaccobyinteractingwithGZIRD21AandGZIPR5.NewPhytol,183，62-75)。目前，尚未有從棉花中分離克隆的TZF類基因參與植物的抗旱性及延緩干旱誘導(dǎo)的衰老的報道。【
發(fā)明內(nèi)容】[0006]本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，從陸地棉中分離克隆一個與棉花抗逆和發(fā)育相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，通過轉(zhuǎn)化擬南芥，驗證其在抗旱和延緩葉片衰老中的功能。[0007]我們基于棉花細胞壁重建的差減文庫(Yangetal.,2008,Expressionprofileanalysisofgenesinvolvedincellwallregenerationduringprotoplastcultureincottonbysuppressionsubtractivehybridizationandmacroarray.JExpBot，59:3661-3674)，分離到在細胞壁重建過程中差異表達的GhTZFl基因，超量表達與GhTZFl具有較高同源性的AtTZFl基因后增強了擬南芥的抗旱性和耐冷性(Linetal.,2011,TheArabidopsistandemzincfingerproteinAtTZFlaffectsABA—andGA—mediatedgrowth,stressandgeneexpressionresponses.PlantJournal,65，253-268);超量表達AtTZF2和AtTZF3增強了擬南芥的抗旱性(Leeetal.,2012,ArabidopsisZincFingerProteinsAtC3H49/AtTZF3andAtC3H20/AtTZF2areInvolvedinABAandJAResponses.PlantCellPhysiol,53，673-686)。但是這些基因都是通過ABA或JA介導(dǎo)的。GhTZFl基因?qū)BA沒有響應(yīng)，我們發(fā)現(xiàn)GhTZFl基因參與植株抗旱性及延緩干旱誘導(dǎo)的衰老，同時能延緩多種逆境脅迫下地植株衰老可能是通過調(diào)控植株體內(nèi)的氧化還原平衡穩(wěn)態(tài)而介導(dǎo)的。[0008]本發(fā)明通過如下技術(shù)方案實現(xiàn):[0009](I)本發(fā)明從棉花中分離得到一個與棉花抗逆和發(fā)育相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子基因GhTZFl，它的核苷酸序列如序列表SEQNO:1所示，在該序列表中的第20-1109位所示的序列是該基因的編碼區(qū)，其編碼的蛋白與擬南芥中的AtTZFl，AtTZF2，AtTZF3基因的同源性分別為52.69%，54.92%和52.13%，聚類分析表明該基因編碼的蛋白與AtTZFl同源度最高，我們將這個基因命名為GhTZFl基因。根據(jù)測序驗證后的該基因全長cDNA序列信息構(gòu)建了該基因的超表達載體，它是序列表SEQNO:2中的第1-362位所示的DNA序列。[0010]本發(fā)明的轉(zhuǎn)錄因子的基因(核苷酸序列見SEQIDN0:1)來源于棉花，其由1089個堿基組成，蛋白質(zhì)編碼序列有362個氨基酸組成，它是SEQIDNO:1所示序列的自5’端第20位堿基到1109位堿基組成。該基因在對逆境脅迫，激素以及棉花生長發(fā)育的影響上尚未有任何報道。通過不同的脅迫處理及激素處理野生型(非轉(zhuǎn)基因)棉花，檢測該基因在野生型棉花中的表達情況，發(fā)現(xiàn)該基因受干旱(PEG)、鹽(NaCl)，茉莉酸(JA)的誘導(dǎo)表達(見圖2)。通過構(gòu)建該基因的超量表達載體PK2GW7.0(其核苷酸序列如SEQIDNO:1所示)，獲得轉(zhuǎn)化載體PK2GW7.0-GhTZFl(見圖3C)，將該轉(zhuǎn)化載體轉(zhuǎn)化到哥倫比亞生態(tài)型擬南芥中，得到該基因的超表達轉(zhuǎn)基因陽性擬南芥植株，檢測其表達量并選取具有合適表達量的兩個純系進行后續(xù)實驗(見圖4)。當(dāng)對野生型擬南芥以及超表達轉(zhuǎn)基因擬南芥植株進行PEG(水勢為-0.5MPa)模擬干旱處理時，發(fā)現(xiàn)在正常條件的培養(yǎng)基上，超表達擬南芥和野生型擬南芥的萌發(fā)率一致，而在PEG存在的培養(yǎng)基上，轉(zhuǎn)基因擬南芥的萌發(fā)率明顯高于野生型擬南芥，說明該基因的超量表達可以提高擬南芥對PEG的抗性(見圖5A和圖5B)。通過黑暗處理離體葉片時，相對于對照而言，黑暗促進了葉片衰老，但是與野生型比較而言，超表達擬南芥植株葉片受黑暗誘導(dǎo)的衰老被顯著延緩(圖5C)。表明該基因可以抑制黑暗誘導(dǎo)擬南芥葉片的衰老。通過用茉莉酸甲酯處理擬南芥離體葉片時，相對于平行對照而言，擬南芥葉片的衰老加速，但是與野生型擬南芥相比，超表達擬南芥植株葉片受茉莉酸甲酯誘導(dǎo)的衰老被顯著延緩(圖OT)。表明該基因能夠抑制茉莉酸所調(diào)控的擬南芥葉片衰老。通過用雙氧水處理離體擬南芥葉片時，相對于平行對照，擬南芥葉片的衰老加速，但是野生型的擬南芥葉片衰老顯著快于超表達擬南芥植株葉片(圖5E)。這說明該基因能夠延緩雙氧水誘導(dǎo)的擬南芥葉片衰老，即該基因能夠增強植株耐氧化脅迫的能力。通過干旱處理成株期擬南芥發(fā)現(xiàn)，超量表達擬南芥轉(zhuǎn)基因植株的萎焉程度明顯低于野生型擬南芥(圖6A-a，b)，對其相對含水量的測定發(fā)現(xiàn)，正常情況下轉(zhuǎn)基因植株與野生型植株的相對含水量一致，但是受到干旱脅迫后，野生型擬南芥的相對含水量顯著低于轉(zhuǎn)基因擬南芥植株(圖6B)。說明超量表達該基因能提高擬南芥植株的抗旱性。對植株體內(nèi)雙氧水含量的測定發(fā)現(xiàn)，受到干旱脅迫后，野生型擬南芥雙氧水含量的升聞聞于超表達擬南芥植株(圖6C),檢測與氧化脅迫相關(guān)的裳老相關(guān)基因的表達，發(fā)現(xiàn)在干旱情況下，野生型擬南芥中這些基因的表達明顯高于超表達系(圖6D)。說明該基因會影響植株體內(nèi)雙氧水含量，并且會影響植株在逆境脅迫下的衰老。通過進一步延長干旱時間后發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因植株顯著延緩了干旱誘導(dǎo)的衰老(圖6A中的c至圖6A中的h)，通過測定MDA的含量來評價膜脂過氧化的程度發(fā)現(xiàn)，在受到干旱脅迫后，超表達擬南芥植株的MDA含量顯著低于野生型擬南芥(圖6E)，表明超表達擬南芥植株的膜脂過氧化程度顯著低于野生型擬南芥植株，這些說明該基因具有調(diào)控擬南芥植株在逆境脅迫下的氧化還原穩(wěn)態(tài)的能力。[0011]具體地，本發(fā)明的操作步驟如下:[0012]I)通過RACE擴增出GhTZFl的5’和3’端，將序列拼接后得到GhTZFl的cDNA序列,根據(jù)測序的序列設(shè)計超表達載體的引物，以棉花cDNA為模板，擴增其全長(翻譯起始位點至下游1086個堿基)，獲得DNA片段，其核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。[0013]2)將步驟I)中擴增得到的全長ORF片段連接到中間載體HX)NRtm221(購自Invitrogen公司，美國，)上，通過BP-LR反應(yīng)，將該片段連接到超表達載體PK2GW7.0(比利時國立根特大學(xué)惠贈)上，再通過熱激轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞TOPlO中，獲得GhTZFl超表達轉(zhuǎn)化載體。利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因方法，將所述的載體導(dǎo)入擬南芥中，獲得轉(zhuǎn)化植株GhTZFl。[0014]3)借助卡那霉素篩選及分離比統(tǒng)計的方法獲得轉(zhuǎn)基因陽性純和植株，通過RT-PCR的方法，檢測轉(zhuǎn)基因植株的表達量。鑒定轉(zhuǎn)基因植株的表型，并進行統(tǒng)計分析。[0015]4)用干旱、高鹽以及各種激素處理野生型棉花品種YZl兩葉一心的幼苗，檢測GhTZFl基因?qū)Σ煌{迫條件的應(yīng)答。[0016]5)用GhTZFl超表達植株進行各種逆境和激素脅迫，觀察其表型。[0017]6)將生長5周的用GhTZFl超表達轉(zhuǎn)基因陽性擬南芥植株和野生型擬南芥植株進行干旱處理，觀察其表型，并測定干旱脅迫下相關(guān)指標及基因的表達。[0018]本發(fā)明的優(yōu)點在于:[0019]1.本發(fā)明克隆的GhTZFl基因可提高植物對干旱的耐受性，因此能夠利用基因工程技術(shù)有目的提高植物耐干旱的能力。[0020]2.本發(fā)明能夠利用基因工程技術(shù)有目的延長植株在逆境脅迫下的生命周期，進而可用于提高植株在逆境脅迫下產(chǎn)量的提高，并能用于研究干旱和葉片衰老的分子機制?！緦＠綀D】【附圖說明】[0021]序列表SEQIDNO:1是本發(fā)明分離克隆GhTZFl基因的核苷酸序列，序列長度為1318bp,ORF長度為1086bp。[0022]序列表SEQIDNO:2是GhTZFl基因編碼的蛋白質(zhì)的序列，編碼362個氨基酸。[0023]圖1:一種采用ClustalW軟件和MEGA4.0軟件(公開使用軟件)對GhTZFl編碼序列與擬南芥中的CCCH型第九亞家族成員基因和AtC3H14，AtC3H15聚類分析的結(jié)果。通過聚類分析表明，GhTZFl編碼序列與擬南芥中的TZF編碼序列中的AtTZFl同源性最高，因而命名為GhTZFl。[0024]圖2:使用Real-timePCR和RT-PCR的方法檢測GhTZFl基因?qū)δ婢程幚砗推浣M織的表達模式分析。圖2A為PEG處理下GhTZFl的表達情況；圖2B為NaCl處理下GhTZFl的表達分析；通過表達分析表明=GhTZFl受PEG和NaCl誘導(dǎo)表達，在24h時誘導(dǎo)表達量最高。圖2C為GhTZFl隨著葉片衰老，其表達量降低。[0025]圖3:構(gòu)建超表達載體所用的載體。圖3A為BP反應(yīng)的中間載體pD0NR?221，圖3B為所使用的超量表達載體PK2GW7.0的示意圖，圖3C為一種基因所使用的超量表達載體p35S-GhTZFl的構(gòu)建示意圖。[0026]圖4為GhTZFl超量表達轉(zhuǎn)基因擬南芥PEG處理下表型分析示意圖。圖中:圖4A為轉(zhuǎn)基因擬南芥表達量的檢測，其中左起第一個泳道為野生型，第二個泳道為轉(zhuǎn)基因系GhTZF1-3(后面的標注為0X3)，第三個泳道為轉(zhuǎn)基因系GhTZFl-4(后面的標注為0X4)，Actin2為擬南芥肌動蛋白，作為內(nèi)參基因以檢測上樣量是否一致。圖4B為PEG處理下(-0.5MPa)種子的萌發(fā)情況，其中a，b，c分別為野生型，GhTZFl超表達系0X3以及GhTZFl超表達系0X4在正常培養(yǎng)基上的萌發(fā)情況；d，e，f分別為野生型，GhTZFl超表達系0X3以及GhTZFl超表達系0X4在水勢為-0.5MPa的PEG培養(yǎng)基上的萌發(fā)情況。圖4C為PEG處理下(-0.5MPa)種子的萌發(fā)速率統(tǒng)計結(jié)果。正常情況下，野生型與超表達系的萌發(fā)速率一致，在PEG存在的條件下，野生型的萌發(fā)速率遠低于兩個超表達系。[0027]圖5為GhTZFl基因在延緩葉片衰老中的應(yīng)用。圖5中:圖5A為轉(zhuǎn)基因和野生型擬南芥離體葉片在黑暗處理下的衰老表型，其中左邊的為未處理前的對照，從上往下第一排為野生型，第二排為0X3，第三排為0X4;右邊的為黑暗處理7天后的結(jié)果。圖5B為轉(zhuǎn)基因和野生型擬南芥離體葉片在茉莉酸甲酯處理下的衰老表型，其中上排的為平行對照，下排的為45uM茉莉酸甲酯處理4天后的結(jié)果，左起第一個為野生型，第二個為0X3，第三個為0X4。圖5C為雙氧水(H2O2)處理離體葉片的表型，其中上排的為平行對照，下排的為IOmMH2O2處理4天后的結(jié)果，左起第一個為野生型，第二個為0X3，第三個為0X4。[0028]圖6為GhTZFl能夠提高植株的抗旱性并能延緩干旱誘導(dǎo)的衰老。圖中:圖6A為干旱處理后的表型，其中上排的為干旱處理7天后的表型，下排的為干旱處理15天后的表型；左邊的均為正常條件下植株的生長情況，右邊的均為干旱處理情況下的表型鑒定，每種生長條件下，從左往右依次為野生型，0X3，0X4。圖6B為干旱處理7天后植株體內(nèi)相對含水量的統(tǒng)計結(jié)果。圖6C為干旱處理7天后植株體內(nèi)雙氧水含量的統(tǒng)計結(jié)果。圖6D為干旱處理7天后與氧化脅迫相關(guān)的衰老相關(guān)基因的表達情況，其中左邊的3個泳道代表正常條件下，右邊的3個泳道代表干旱處理情況下，3個泳道從左往右依次代表野生型，0X3，0X4。圖中CK均代表正常生長情況，DT均代表干旱處理情況。圖6E為干旱處理15天后植株體內(nèi)丙二醛含量的統(tǒng)計結(jié)果?！揪唧w實施方式】[0029]以下實施例定義了本發(fā)明，并描述了本發(fā)明在分離克隆包含有GhTZFl基因完整編碼區(qū)段的DNA片段，以及驗證GhTZFl基因功能的方法。根據(jù)以下的描述和這些實施例，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以確定本發(fā)明的基本特征，并且在不偏離本發(fā)明精神和范圍的情況下，可以對本發(fā)明做出各種改變和修改，以使其適用不同的用途和條件。[0030]實施例1GhTZFl基因的分離克隆及表達模式分析[0031]本申請人:在華中農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳改良國家重點實驗室的前期工作中從建立細胞壁再生的SSH文庫(Yangetal.,2008,Expressionprofileanalysisofgenesinvolvedincellwallregenerationduringprotoplastcultureincottonbysuppressionsubtractivehybridizationandmacroarray.JExpBot,59:3661-3674)中分離出的一段EST序列(NCBIEST登錄號FF403655，提交時間2009年4月)，對該EST序列序列在NCBI基因庫中進行tBLASTx比對，發(fā)現(xiàn)這個序列可能是CCCH-type轉(zhuǎn)錄因子。這條EST序列沒有包含完整地開放讀碼框，我們采用RACE(rapid-amplificationofcDNAends)法通過PCR進行cDNA末端快速克隆技術(shù)以得到這個基因完整的編碼序列。具體步驟如下所述:A.RNA的提取及cDNA的獲得[0032]從陸地棉C201(來自中國棉花種植資源庫，中國河南安陽，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所管理)細胞壁再生3h的樣品中提取總RNA(參照Zhuetal.報道的方法，文獻見:Zhuetal.,2005,AnimprovedsimpleprotocolforisolationofhighqualityRNAfromGossypiumspp.suitableforcDNAlibraryconstruction.ActaAgronomicaSinica,31,1657-1659),利用反轉(zhuǎn)錄酶SuperscriptIIK購自Invitrogen公司，美國)將其反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，反應(yīng)條件為:65°C5min,50°C60min,70°CIOmin0[0033]B.GhTZFl基因全長序列的獲得[0034]米用RACE方法(rapid-amplificationofcDNAends)(Frohmanetal.,1988,Rapidproductionoffull-lengthcDNAsfromraretranscripts:amplificationusingasinglegene-specificoligonucleotideprimer.PNAS,85,8998-9002.)分別擴增出GhTZFl基因的5，端和3，端，采用的引物序列分別為GhTZF5r-l(5，-CATGGGCGAACCAACATAATCCAAATC-3’)和GhTZF5r_2(5，-AAGCGGACCCATTTCCTCTCGGACTC-3’)，GhTZF3r_l(5，-AATGAATGGTGCTTGTTCCTGGGGC-3’)和GhTZF3r_2(5，-TTCCACACTCCGACCCGGTTTTTGC-3’)。將序列拼接后得到GhTZFl的cDNA序列。根據(jù)上述所得的拼接序列設(shè)計ORF引物，其上下游引物分別為=GhTZFl-F(5’-CAAAAATGATGATCGGAGA-3’)和GhTZFl-R(5’-TCATTTCACCAACTCAGATAC-3’)，以細胞壁再生3h的cDNA為模板利用PCR技術(shù)擴增GhTZFl的0RF。PCR條件為94°C預(yù)變性3min；94°C30sec，55°C30sec,72°Clmin，28個循環(huán)；72°C延伸7min。將擴增獲得的PCR產(chǎn)物連入pGEM_T載體(購自普洛麥格(北京)生物技術(shù)有限公司，即美國Promega公司)，篩選陽性克隆并測序。其序列為SEQIDNO:1所不的核苷酸序列。再通過ORFFinder(http://www.ncb1.nlm.nih.gov)對獲得的cDNA進行分析，確定包含一個完整的0RF，其表達的蛋白為SEQIDN0:2所示的蛋白質(zhì)的氨基酸序列。[0035]C.PEG和NaCl處理、不同發(fā)育階段擬南芥葉片的總RNA的提取、cDNA的獲得及GhTZFl基因的表達分析[0036]以陸地棉YZl為材料(金雙俠，即Jinetal.,Identificationofanovelelitegenotypeforinvitrocultureandgenetictransformationofcotton.BiolPlant,2006,50:519-524)，提取新葉、成熟葉、老葉以及聚乙二醇(PEG)和NaCl處理不同時間點各樣品的RNA(方法同前)，選取的PEG和NaCl處理的時間點分別是Oh，lh，3h，6h，12h，24h。正常生長的YZl選取相對應(yīng)的時間點以作平行對照。利用反轉(zhuǎn)錄酶SuperscriptIII(購自Invitrogen公司，美國)將其反轉(zhuǎn)錄合成cDNA,反應(yīng)條件為:65°C5min,50°C60min,70°CIOmin0以上述反轉(zhuǎn)合成的cDNA為模板，采用Real-timePCR檢測GhTZFl的表達水平，所用引物為:GhTZFl-RTS:(5，-TCGGTGGCCTTTGATTCTTCT-3’)和GhTZFl-RTA:5’-(AGGCAGTAGCACCACMMTAGAG-3’)。同時用引物GhUbiquitin7_F:(5，-GAAGGCATTCCACCTGACCAAC-3’)和GhUbiquitin7-R:(5，-CTTGACCTTCTTCTTCTTGTGCTTG-3’)對棉花GhUbiquitin7(GenBank登陸號:DQ116441)基因做特異擴增，作為內(nèi)對照進行相對定量分析。定量PCR儀為ABI7500，定量PCR試劑購自Bio-Rad公司。PCR反應(yīng)體系(20μI)包括:1μI稀釋后的cDNA(等于IOng起始總RNA)，10μ12XPCRMasterMix,200nM的引物。反應(yīng)條件為:95°C30sec；95°C5sec，60°C35sec，40個循環(huán)。反應(yīng)過程中進行熒光檢測實時定量分析。結(jié)果表明:本發(fā)明克隆的基因GhTZFl受PEG和NaCl處理誘導(dǎo)表達，均在處理24h時表達量最高，GhTZFl的表達量隨葉片發(fā)育而降低。[0037]實施例2:GhTZFI基因植物超量表達載體的構(gòu)建[0038]根據(jù)得到的SEQIDNO:1序列設(shè)計引物用于構(gòu)建表達載體，在引物兩端分別加上BP-LR反應(yīng)的接頭堿基，引物序列分別為GhTZFlBP-F(5’-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCCAAAAATGATGATCGGAGA-3’)和GhTZFlBP-R(5，-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTTCATTTCACCAACTCAGATAC-3’)，以T-GhTZFl質(zhì)粒為模板進行PCR擴增，PCR反應(yīng)條件為:94°C預(yù)變性3min；94°C30sec,58°C30sec,72°Clmin，共28個循環(huán)；72°C延伸7min，經(jīng)PCR擴增得到包含完整ORF的PCR產(chǎn)物。PCR產(chǎn)物經(jīng)BP反應(yīng)連接至pD0NR?221載體(購自Invitrogen公司，美國，)上效果見圖3A，后轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞T0P10，以GhTZFl的特異引物GhTZFlBP-F(5，-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCCAAAAATGATGATCGGAGA-3，)和GhTZFlBP-R5，-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTTCATTTCACCAACTCAGATAC-3，)進行PCR檢測來挑取陽性克隆，并活化提取質(zhì)粒。PCR反應(yīng)條件為:94°C預(yù)變性3min；94°C30sec,55°C30sec，72°Clmin，25個循環(huán)；72°C延伸7min。再用LR反應(yīng)將GhTZFl基因連接至植物表達載體pK2GW7.0(比利時國立根特大學(xué)惠贈，LR酶購自Invitrogen公司，美國，室溫反應(yīng)4小時，圖3B)，反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞T0P10。以GhTZFl的特異引物GhTZFlBP-F(5，-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCCAAAAATGATGATCGGAGA-3’)和GhTZFlBP-R(5，-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTTCATTTCACCAACTCAGATAC-3’)進行PCR檢測來挑取陽性克隆，并活化提取質(zhì)粒。PCR反應(yīng)條件為:94°C預(yù)變性3min；94°C30sec，55°C30sec,72°Clmin，25個循環(huán)；72°C延伸7min。確定為陽性的克隆即為獲得了用于轉(zhuǎn)化的超量表達質(zhì)粒p35s-GhTZFl(圖3C)。[0039]將構(gòu)建得到的的p35s_GhTZFl載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌菌株GV3101(Rogeretal.,2000,AguidetoAgrobacteriumbinaryTivectors.TrendsPlantSci,5，1360-1385),挑取單菌落接于含50mg/L利福平和100mg/L卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中于150rpm,28°C搖48h,按菌液和甘油體積比為1:1加入1.5mL離心管混勻，-70°C保存。再通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化擬南芥。[0040]以上及以后所述的LB培養(yǎng)基配方為:蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaC110g/L；用5mMNaOH調(diào)pH=7.2;用蒸餾水定容至IL;在高溫121_125°C高壓滅菌15_20min。LB固體培養(yǎng)基為每升加入Sg瓊脂。[0041]實施例3GhTZFl基因的遺傳轉(zhuǎn)化及篩選鑒定[0042]A.擬南芥的準備[0043]供試材料為野生型擬南芥(ArabidopsisthalianaL.Columbiaecotype)。野生型擬南芥種子經(jīng)過春化處理后點播擬南芥種植專用營養(yǎng)土(培蕾牌，中國，江蘇，鎮(zhèn)江生產(chǎn)，商品營養(yǎng)土)并放入人工培養(yǎng)室(16小時光照，22±2°C)等擬南芥長到4葉左右進行定苗，以控制擬南芥的生長密度。待擬南芥生長6周左右開始開花時即可轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化前一天給擬南芥澆足水。[0044]B.農(nóng)桿菌的活化[0045]從超低溫冰箱內(nèi)取出保存的含有目標基因(即本發(fā)明克隆的GhTZFl基因)的GV3101菌株的甘油管在冰上融化，后于含50mg/L利福平和100mg/L卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基上劃線，28°C暗培養(yǎng)36-48h，待皿內(nèi)長出清晰的單菌落，挑取單菌落在加50mg/L利福平和100mg/L卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)(26.5°C，IOOrpm)，其OD6tltl=0.8-1.0時即可用于轉(zhuǎn)化；[0046]將菌液轉(zhuǎn)移到離心管中5000rpm離心5min，棄上清培養(yǎng)基。加入IOOml濃度為5%(W/V)的蔗糖溶液，重懸農(nóng)桿菌GV3101，在28°C搖床中復(fù)蘇1_2小時。加入表面活性劑0.05%(V/V)SilwetL-77，震蕩搖混勻。[0047]C.農(nóng)桿菌介導(dǎo)的花序法轉(zhuǎn)化擬南芥及轉(zhuǎn)基因擬南芥的篩選[0048]農(nóng)桿菌介導(dǎo)的花器浸醮法轉(zhuǎn)化擬南芥的轉(zhuǎn)化方法和程序參照參考Zhangetal.，2006報道的方法(Zhangetal.,2006,Agrobacterium-mediatedtransformationofArabidopsisthalianausingthefloraldipmethod.NatureProtocols,1，641-646)。具體步驟如下:[0049](I)將擬南芥花器浸入農(nóng)桿菌懸液，并輕輕攪動約30秒鐘，用紙巾吸掉過多的菌液，并用黑色塑料袋將擬南芥植株包裹起來，保濕避光處理24小時；[0050](2)24小時之后將塑料袋逐漸揭開透氣，正常培養(yǎng)；[0051](3)—個星期之后重復(fù)上述(I)的操作；[0052](4)待種子成熟可以停止?jié)菜⑹斋@種子，即為T1代種子。[0053](5)將收獲的種子消毒:先用70%(V/V)乙醇溶液浸泡I分鐘，在上述處理時要不時地使種子懸?。蝗缓笥脽o菌水洗四次；[0054](6)處理后的種子用Topagar(0.1%(W/V)瓊脂水溶液)均勻涂布在含卡那霉素的擬南芥生長培養(yǎng)基(含有100mg/L卡那霉素的1/2MS培養(yǎng)基，MS培養(yǎng)基為通用培養(yǎng)基，1/2MS是指無機鹽成分減半)表面；[0055](7)4°C下春化處理3天，移入培養(yǎng)室培養(yǎng)10天后，共選取具有卡那霉素抗性植株20株；[0056](8)將20株轉(zhuǎn)基因T1代擬南芥植株移栽到土壤培養(yǎng)，待成熟后按單株收取種子，即T2代種子。[0057](9)將收取的T2代種子按操作步驟(5)-(6)進行操作I次；[0058](10)4°C下春化處理3天，正常培養(yǎng)10天后計算具有卡那霉素抗性植株與非抗性植株的分離比，并進行統(tǒng)計分析；[0059](11)符合抗性與非抗性植株的分離比為3:1的株系認為是單拷貝株系，移栽土壤培養(yǎng)，待成熟后按單株收取種子，即為T3代種子。[0060]D.轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的純系檢測[0061]將收取的T3代轉(zhuǎn)基因擬南芥種子按實施例3中農(nóng)桿菌介導(dǎo)的花序法轉(zhuǎn)化擬南芥及轉(zhuǎn)基因擬南芥的篩選的操作步驟(5)-(6)進行操作I次；然后4°C春化3天，移入培養(yǎng)室培養(yǎng)10天后查看轉(zhuǎn)基因植株在固體篩選培養(yǎng)基(含有100mg/L卡那霉素的MS培養(yǎng)基)上是否發(fā)生抗性分離，不發(fā)生抗性分離的株系即認為是轉(zhuǎn)基因純系T4代種子，用作下一步表型分析和功能鑒定。[0062]實施例4:轉(zhuǎn)基因擬南芥的表達分析[0063]收集T3代種子生長的擬南芥植株地上部分以提取RNA，RNA的抽提用Invitrogen公司的Trizol抽提試劑盒(具體操作步驟見該試劑盒的說明書)。[0064]cDNA的合成是以3μg總RNA為模版，與Iμ1500μg/mloligo-dT(15)引物(購自Promega公司)，IμII0mMdNTP,DEPC-water混合，總體積為I2μI;然后65°C變性5min冰上驟冷；再加入8μI含有4μIRTbuffer,2μ10.1Mdithiothreitol,40unitsofRNasin#RibonucleaseInhibitor(購自Promega公司，美國)，和200unitsofSuperscriptIII反轉(zhuǎn)錄酶(購自Invitrogen公司，美國)的混合液；50°C溫浴Ih合成第一鏈；反應(yīng)結(jié)束后75°C處理15min使SuperscriptIII反轉(zhuǎn)錄酶失活。每份cDNA稀釋到200μI后-20°C保存待用。[0065]以上述反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板，用引物GhTZFl-AtOS和GhTZFl-AtOA對GhTZFl基因進行特異的PCR擴增(擴增產(chǎn)物長284bp)。同時用擬南芥Atactin2(GenBank登陸號:NM_179953)基因作為內(nèi)對照基因做特異擴增(擴增產(chǎn)物長216bp)。PCR反應(yīng)體系的總體積為20μ1，DNA模板Iul(約50叩)、1父13卩酶反應(yīng)緩沖液、251111MgCL21.2ul、2mMdNTP1.5ul、10uM引物0.2ul、0.3單位Taq酶，加ddH20至20μI。反應(yīng)程序為:94°C變性5min，94°C30s,55°C30s,72°C30s30cycles，72°C延伸5min。獲得的PCR產(chǎn)物取10μI以0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測。[0066]結(jié)果表明:本發(fā)明克隆的GhTZFl基因在擬南芥中能夠表達，并且在不同轉(zhuǎn)基因系中的表達量有差異。后續(xù)的功能驗證研究中選取具有合適表達量的0X3和0X4兩個系來進行分析(圖4Α)。[0067]所用引物為:[0068]GhTZFl-AtOS:5’-GTGAGGAGGTGTGCTCGTGGAAG-3’[0069]GhTZFl-AtOA:5’-CGAAGCTGCTCCGGTGTGTG-3’[0070]actin-f:5’-CACTGTGCCAATCTACGAGGGT-3’[0071]actin-r:5，-CACAAACGAGGGCTGGAACAAG-3’[0072]實施例5:利用轉(zhuǎn)基因擬南芥對GhTZFl基因進行功能驗證，[0073]具體步驟如下:[0074]A.PEG處理萌發(fā)實驗[0075]將超表達兩個家系0X3，0X4和野生型WT的T3代種子置于1/2MS培養(yǎng)基和含有PEG(-0.5MPa)的1/2MS培養(yǎng)基上，觀察種子萌發(fā)。在正常培養(yǎng)基上，WT、0X3和0X4的萌發(fā)一致，在PEG(-0.5MPa)培養(yǎng)基上，WT的萌發(fā)慢于超表達兩個家系0X3和0X4，這說明該基因的超表達可以提高對PEG的抗性，結(jié)果見圖5A。對萌發(fā)速率進行統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)超表達家系的萌發(fā)速率在前期遠高于野生型，隨著時間延長，超表達系可以完全萌發(fā)，而野生型的萌發(fā)率仍低于超表達系，統(tǒng)計結(jié)果見圖5B。[0076]B.黑暗處理離體葉片[0077]選取超表達兩個家系0X3，0X4和野生型WT的T3代植株相同部位的蓮座葉置于黑暗條件下離體培養(yǎng)7天，平行對照為正常光照條件下的葉片，發(fā)現(xiàn)與平行對照相比，黑暗處理誘導(dǎo)了葉片衰老，但是黑暗處理7天后，相比于野生型，轉(zhuǎn)基因葉片的葉綠素降解被顯著延緩，表明超表達該基因可以延緩黑暗誘導(dǎo)的衰老，結(jié)果如圖5C。[0078]C.MeJA處理離體葉片[0079]選取超表達兩個家系0X3，0X4和野生型WT的T3代植株相同部位的蓮座葉在含有45uM的茉莉酸甲酯(MeJA)溶液中避光處理4天，平行對照為在水溶液中避光處理4天，發(fā)現(xiàn)與平行對照相比，茉莉酸甲酯加速了葉片衰老，但是在茉莉酸甲酯的處理下，超表達系的葉片衰老程度明顯低于野生型，表明該基因可以延緩茉莉酸甲酯誘導(dǎo)的衰老，結(jié)果見圖[0080]D.雙氧水處理離體葉片[0081]選取超表達兩個家系0X3，0X4和野生型WT的T3代植株相同部位的蓮座葉在含有IOmM的雙氧水(H2O2)溶液中避光處理4天，平行對照為在水溶液中避光處理4天，發(fā)現(xiàn)與平行對照相比，雙氧水加速了葉片衰老，但是在雙氧水的處理下，超表達系的葉片衰老程度明顯低于野生型，說明該基因可以延緩雙氧水誘導(dǎo)的衰老，具有耐氧化脅迫的能力，結(jié)果見圖5E0[0082]E.GhTZFl超量表達和野生型擬南芥干旱處理[0083]將超表達轉(zhuǎn)基因擬南芥0X3和0X4及野生型種子點播于擬南芥專用營養(yǎng)土(培蕾牌，江蘇鎮(zhèn)江生產(chǎn)的產(chǎn)品，公開銷售)，并放入人工培養(yǎng)室(16小時光照，22±2°C)等擬南芥生長5周，停止?jié)菜甀個星期，觀察植株的萎焉程度，發(fā)現(xiàn)與對照野生型相比，超表達植株并未出現(xiàn)明顯萎焉，而野生型出現(xiàn)了明顯萎焉，結(jié)果見圖6A-a和圖6A-b，并測定了植株體內(nèi)的相對含水量，發(fā)現(xiàn)正常生長條件下，轉(zhuǎn)基因系擬南芥與野生型擬南芥的相對含水量并無差別，而在干旱情況下，野生型擬南芥的相對含水量顯著降低，轉(zhuǎn)基因系擬南芥的相對含水量顯著高于野生型擬南芥，統(tǒng)計結(jié)果見圖6B，這些說明該基因能夠提高擬南芥植株的抗旱性。待正常生長5周的擬南芥停止?jié)菜?5天后，發(fā)現(xiàn)植株均出現(xiàn)嚴重萎焉，并且干旱嚴重誘導(dǎo)了野生型葉片衰老加速，而與野生型相比，超表達系植株干旱誘導(dǎo)的衰老被明顯抑制，結(jié)果見圖6A-c至圖6A_h。[0084]F.GhTZFl超量表達植株和野生型擬南芥干旱處理后生理指標的測定和相關(guān)基因的表達[0085]I)過氧化氫定量測定。[0086]在酸性環(huán)境中，過氧化氫可將Fe2+離子氧化成Fe3+離子，F(xiàn)e2+離子再與染料分子結(jié)合形成Fe3+_染料復(fù)合物，該復(fù)合物在560nm(或595nm)處有最大吸收波長，且吸光值與過氧化氫的濃度成正比。[0087]將擬南芥樣品用液氮研磨，取0.1g左右的樣品至2ml離心管中，立即加入1.8ml預(yù)冷的80%丙酮，振蕩20分鐘，4°C，13000rpm/min離心15分鐘，吸取上清液轉(zhuǎn)入新的離心管用于后續(xù)實驗。按照試劑盒H202quantificationkit(SangonBiotech,Shanghai,China)提供的方法對過氧化氫進行定量測定。對干旱7天后植株體內(nèi)的雙氧水含量測定發(fā)現(xiàn)，干旱能夠提高植株體內(nèi)的雙氧水含量，即打破了細胞的氧化還原穩(wěn)態(tài)，但是與野生型擬南芥相比，超表達系擬南芥的雙氧水升高明顯低于野生型擬南芥，說明該基因可以調(diào)控雙氧水的積累，維持胞內(nèi)氧化還原平衡狀態(tài)，統(tǒng)計結(jié)果見圖6C。[0088]2)GhTZFl超量表達和野生型擬南芥干旱處理下衰老相關(guān)基因的表達[0089]在干旱處理7天時分別采集超表達系0X3和0X4及野生型擬南芥的地上部分，提取RNA,RNA的抽提用Invitrogen公司的Trizol抽提試劑盒(具體操作步驟見該試劑盒的說明書)。反轉(zhuǎn)錄后用RT-PCR檢測衰老相關(guān)基因(0RE9，SAG21，SAG14，ERD1)的表達。擬南芥Atactin2(同上)基因作為內(nèi)對照基因。結(jié)果表明:干旱處理的情況下，與野生型相比，轉(zhuǎn)基因中SAG相關(guān)基因的表達量下調(diào)，表明干旱誘導(dǎo)的衰老在轉(zhuǎn)基因植株中得到延緩(見圖6D)。[0090]所用引物分別為:[0091]0RE9-F:5，-GACACAATCGGTTTCGCACTG-3，[0092]0RE9-R:5’-CTCCTCTGGTTAACATCTCTATCCTG-3’[0093]SAG21-F:5’-ATCGTATCTGCTTTCGTCTCTCG-3，[0094]SAG21-R:5，-TTCCACTCCCTTCTTCTTCATCAC-3，[0095]SAG14-F:5’-GGAGGACTACGATGTTGGTGATGA-3，[0096]SAG14-R:5’-TGTGGCTAATGGGTTTCTCTTTCT-3’[0097]ERDl-F:5，-ATGTCACCTCCATCGCCGCT-3’[0098]ERDl-R:5，-GAACCGTTCGAAAACCGCTG-3，[0099]3)丙二醛(MDA)含量的測定。[0100]植物器官衰老或在非生物逆境條件下，膜脂發(fā)生過氧化作用，丙二醛是產(chǎn)物之一，通常利用它作為膜脂過氧化指標。在干旱處理15天后取樣進行MDA含量測定。天平稱取0.1g左右的擬南芥蓮座葉葉片，剪刀剪碎后加10%TCA2mL，用預(yù)冷的研缽置于冰上研磨至勻衆(zhòng)狀，倒入2mL離心管中。在12000rpm下冷凍(4°C)離心IOmin,取上清液0.8mL至新的2mL離心管中，向其中加入0.6%TBA0.8mL，混合后在100°C沸水中煮15min后冰上立即冷卻后離心取上清。用分光光度計分別測定上清液在450nm、532nm和600nm處的吸光度值。并按公式算出MDA濃度，再算出單位鮮重組織中的MDA含量(μmol/g)。結(jié)果計算，按公式C/ymol/L=6.45(A532-A600)*(V1*V)/(V2*W)。其中Vl為反應(yīng)液總量，V2為反應(yīng)中提取液量，V為提取液總量，W為樣品質(zhì)量。最終結(jié)果發(fā)現(xiàn)干旱導(dǎo)致膜脂過氧化，但是與野生型相t匕，超表達系的膜脂過氧化程度降低，繪圖如圖6E。[0101]以上過程中用到的擬南芥正常生長培養(yǎng)基:5mMKNO3,2mMMgSO4,2mMCa(NO3)2,ImMKH2PO4,1.5mMKCI，70μMH3BO3,14μMMnCl2,1μΜZnSO4,0.5μMCuSO4,10μMNaCI，0.2μMNa2MoO4,40μMFe-EDTA,10g/L蔗糖，ρΗ5.7，8g/LAgar0[0102]特別說明:本發(fā)明專利申請得到“中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費專項資金資助(2010QC034)”的資助?！緳?quán)利要求】1.一種從棉花中分離的GhTZFl基因，其核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。2.一種從棉花中分離的GhTZFl基因，其蛋白質(zhì)的序列如SEQIDNO:2所示。3.一種超表達載體p35s-GhTZFl，其特征在于，該載體含有如權(quán)利要求1所述的基因。4.權(quán)利要求1所述的基因在提高擬南芥耐旱性及延緩干旱誘導(dǎo)衰老中的應(yīng)用?！疚臋n編號】C07K14/415GK103468712SQ201310365814【公開日】2013年12月25日申請日期:2013年8月20日優(yōu)先權(quán)日:2013年8月20日【發(fā)明者】張獻龍,楊細燕,周婷,王麗晨申請人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)