愛帕琳(Apelin)是一種由脂肪細胞產(chǎn)生和分泌的循環(huán)細胞因子，因此被認為是脂肪因子(Boucher等2005)。愛帕琳最初發(fā)現(xiàn)自牛胃提取物，是作為孤兒受體APJ的內(nèi)源配體(Tatemoto等1998)。愛帕琳是APLN基因的產(chǎn)物并且被翻譯成77氨基酸前體肽原。該前體肽原隨后裂解形成若干生物活性肽，這些生物活性肽是通過其長度來標示，包括愛帕琳-12、愛帕琳-13、愛帕琳-16、愛帕琳-17、愛帕琳-19和愛帕琳-36。在哺乳動物中，愛帕琳C端的最后23個殘基是相同的(Pitkin等2010)，這意味著對這些肽的重要生理作用。采用合成肽的研究已揭示愛帕琳-13和愛帕琳-36可為最豐富的生物活性片段(Kawamata等2001)并且結(jié)構(gòu)研究顯示APJ與血管緊張素受體I具有31％的結(jié)構(gòu)相似性。此外，愛帕琳-36通過血管緊張素轉(zhuǎn)化酶相關(guān)性羧肽酶2-ACE2降解成愛帕琳-13(Vickers等2002)。然而，這種裂解不太可能使肽失活，因為若干研究已顯示愛帕琳-12(即，愛帕琳-13減去C端處的苯基丙氨酸(Phe))在APJ受體處與原生愛帕琳-13具有類似的結(jié)合親和力和活性，這表明除了ACE2的失活途徑之外還存在其他失活途徑。有意思的是，愛帕琳-13的C端Phe的丙氨酸置換不僅阻斷ACE2的降解效應(yīng)，而且還在APJ受體處產(chǎn)生拮抗劑。(Ala¹³)愛帕琳-13和愛帕琳-13的共同注射在大鼠中完全阻斷了愛帕琳-13的血管擴張劑效應(yīng)(Lee等2005)。迄今為止沒有研究測試(Ala¹³)愛帕琳-13對胰島素分泌和食物攝取的效應(yīng)。愛帕琳和APJ表達均位于垂體前葉中的下丘腦內(nèi)和視上核和室旁核周圍，這表明牽涉激素釋放以及食物和水攝取的調(diào)控。實際上，愛帕琳-13的腦室內(nèi)(i.c.v.)施用會降低經(jīng)飼喂的和經(jīng)受饑餓的大鼠的食物攝取(Sunter等2003)。對于夜間施用愛帕琳-12觀察到類似的效應(yīng)，而白天急性腦室內(nèi)注射會增加食物攝取(O'Shea等2003)。Valle及其合作者的研究(2008)顯示將愛帕琳-13腦室內(nèi)注射超過10天會增加小鼠的食物攝取、運動活性和體溫。相比之下，將愛帕琳-13腹膜內(nèi)(i.p.)施用10天對大鼠的食物攝取顯示出很小的效應(yīng)，但劑量依賴性會抑制大鼠的體重增量(Higuchi等2007)。因此，愛帕琳可參與動物的食物攝取調(diào)控，但需要另外的研究來確定精確機制。

在下丘腦中，愛帕琳通過抑制加壓素釋放神經(jīng)元的電活動性而參與流體穩(wěn)態(tài)的調(diào)控(Lee等2005)。然而，關(guān)于愛帕琳對水攝取的效應(yīng)的研究已產(chǎn)生可變的結(jié)果。愛帕琳的中樞注射和全身性注射會增加貧水大鼠的水攝取(Valle等2008)，但在禁水48h的大鼠中已發(fā)現(xiàn)對飲水的抑制效應(yīng)(Pitkin等2010)。Mitra及其合作者(2006)發(fā)現(xiàn)在中樞或外周施用藥理學劑量的(pGlu)愛帕琳-13之后對水攝取沒有可靠的效應(yīng)。

在CNS之外，已在許多組織中檢測到愛帕琳mRNA，所述組織包括嚙齒動物和人的血管內(nèi)皮細胞、胃、腎、肺、乳腺和脂肪組織(Winzell等2005；Quazi等2009)。類似地，已在多個器官中檢測到APJ mRNA，所述器官包括肺、心臟、脂肪組織、小腸、直腸粘膜、卵巢、甲狀腺和下丘腦(Pitkin等2010)，因此，與許多其他肽一樣，愛帕琳已被證實具有多種生理作用。在腸中，愛帕琳-13和愛帕琳-36刺激胃細胞增殖。愛帕琳-12、愛帕琳-13和愛帕琳-19誘導(dǎo)從鼠的腸內(nèi)分泌STC-1細胞的CCK-釋放(Winzell等2005)。已在大鼠胃內(nèi)的泌酸細胞中檢測到愛帕琳免疫反應(yīng)性，這表明愛帕琳可起到腔內(nèi)CCK-釋放因子的作用。由于CCK與局部迷走神經(jīng)纖維上減少胃排空并增加飽腹感的CCK1R受體結(jié)合，因此愛帕琳可調(diào)節(jié)食后CCK信號傳導(dǎo)(Pitkin等2010)。

據(jù)認為愛帕琳對進食行為、葡萄糖利用和胰島素分泌具有許多生物學作用。最近，Ringstrom及其合作者(2010)發(fā)現(xiàn)位于胰腺β細胞上的愛帕琳受體在α細胞中具有某種程度的表達。有許多將愛帕琳與葡萄糖穩(wěn)態(tài)相關(guān)聯(lián)的報告，但這些報告具有相沖突的結(jié)果。這從Ringstrom及其合作者(2010)的報告可以看出，愛帕琳-36可同時刺激并抑制胰島素分泌(取決于肽的濃度)。然而，Dray及其合作者(2008)報導(dǎo)急性靜脈內(nèi)(i.v.)注射愛帕琳-13(每45min 2000pmol/kg，持續(xù)3.75小時)在胰島素敏感組織中具有強效的降葡萄糖效應(yīng)和改善的葡萄糖攝取。Valle及其合作者的食物攝取研究(2008)顯示愛帕琳-13(1μg/天)在3-7天顯著增加了食物攝取。相反，Sunter及其合作者(2003)報導(dǎo)在經(jīng)飼喂或禁食的Wistar大鼠中靜脈內(nèi)輸注10^-10M愛帕琳-13無食物攝取變化。就愛帕琳對葡萄糖穩(wěn)態(tài)的響應(yīng)而言，還取決于注射部位。因此，假設(shè)愛帕琳-13在葡萄糖穩(wěn)態(tài)和進食行為控制中起著核心作用，但精確的作用機制目前尚不知曉。研究表明最有效的愛帕琳同種型為N端焦谷氨酸化的愛帕琳-13形式(pGlu-愛帕琳-13)，該形式被認為是主要的生物配體(Zhu等2011)。這些研究人員還得出結(jié)論，愛帕琳對于維持體內(nèi)全身性胰島素敏感性而言是必需的。另外，愛帕琳在脂肪組織中的產(chǎn)生被胰島素強烈上調(diào)，并且研究顯示肥胖和高胰島素小鼠和人類中的血漿濃度升高(Pitkin等2010)。

許多有益的活性歸因于愛帕琳相關(guān)肽，包括在心血管疾病中的保護作用(Liu等2013)，促進心肌中的葡萄糖攝取(Xu等2012)，在糖尿病性腎病中具有保護作用(Pitkin等2010)并且其通過不同的機制來抑制前體脂肪細胞的脂肪生成和成熟脂肪細胞中的脂類分解(Valle等2008)。已報導(dǎo)，愛帕琳具有許多血管方面的益處(Kidoya&Takakura2012)，減少ApoE^-/-小鼠中粥樣硬化病變的程度以及減低腹主動脈瘤的發(fā)展(Chun等2008)。先前的研究已顯示，愛帕琳肽改變血壓、進食行為、垂體激素釋放并且可具有神經(jīng)保護作用(Cheng等2012)。愛帕琳已作為在能量代謝和改善胰島素敏感性方面具有有效作用的新成員出現(xiàn)(Castan-Laurell等2008)。總體而言，愛帕琳作為具有抗肥胖癥和抗糖尿病特性的有益脂肪因子出現(xiàn)，其可改善胰島素敏感性和葡萄糖利用并因此在對抗這些代謝障礙方面具有有前景的治療概況。

已合成一系列愛帕琳-13相關(guān)肽類似物供抗糖尿病測試，以評估它們的體外和體內(nèi)抗糖尿病潛力。一系列愛帕琳類似物的活性通過檢驗它們在小鼠血漿中的穩(wěn)定性來測試。通過每天兩次的腹膜內(nèi)愛帕琳類似物和選定脂肪酸衍生物的長期慢性效應(yīng)來檢驗在高脂肪飼喂的小鼠中最具前景的所選類似物。

發(fā)明概述

根據(jù)本發(fā)明的第一方面，提供一種肽類似物，其包含至少SEQ ID NO:1的殘基2-13并且還包含SEQ ID NO:1的殘基13處的置換和/或修飾。

任選地，所述肽類似物由SEQ ID NO:1的殘基2-13組成。

任選地，殘基13處的置換選自Tyr、Thi(β[2-噻吩基]-丙氨酸)、4-疊氮基-Phe、4-氰基-Phe或Trp；任選地，Tyr。

任選地，殘基13為C端殘基并且殘基13處的修飾為末端羧基被酰胺基置換。

任選地，所述肽類似物包含至少SEQ ID NO:1的殘基1-13或由SEQ ID NO:1的殘基1-13組成。

任選地，所述肽類似物還包含N端添加的pGlu(5-氧代脯氨酸)、乙?；?、酰基或酰化部分；任選pGlu(5-氧代脯氨酸)。

任選地，所述肽類似物還包含SEQ ID NO:1的殘基8處的修飾，其中進一步任選地，殘基8處的修飾為將脂肪酸基團添加至殘基8。進一步任選地，脂肪酸基團為C₁₂至C₂₀脂肪酸，任選C₁₆脂肪酸(棕櫚酸)，其通過二價接頭、任選γ-谷氨酰接頭連接至殘基8。

任選地，存在于肽類似物的2-7位和9-12位的那些氨基酸相對于SEQ ID NO:1的相應(yīng)殘基是未置換的。

任選地，殘基13處的置換選自Val或Ala。

任選地，所述肽類似物為激動劑并且選自包含下列的群組：(Tyr¹³)愛帕琳-13、愛帕琳-13-酰胺、(pGlu)愛帕琳-13、pGlu(Tyr¹³)愛帕琳-13、(pGlu)愛帕琳-13-酰胺、Lys⁸GluPAL(Tyr¹³)愛帕琳-13、(Lys⁸GluPAL)愛帕琳-13-酰胺、pGlu(Lys⁸GluPAL)愛帕琳-13-酰胺；進一步任選地，選自包含下列的群組：(Lys⁸GluPAL)愛帕琳-13-酰胺和pGlu(Lys⁸GluPAL)愛帕琳-13-酰胺。

或者，肽類似物為拮抗劑并且選自包含下列的群組：(Ala¹³)愛帕琳-13、(Val¹³)愛帕琳-13、pGlu(Ala¹³)愛帕琳-13和pGlu(Val¹³)愛帕琳-13；任選地，選自包含下列的群組：pGlu(Ala¹³)愛帕琳-13和pGlu(Val¹³)愛帕琳-13。

為避免疑義，或是殘基13處的置換選自Tyr、Thi(β[2-噻吩基]-丙氨酸)、4-疊氮基-Phe、4-氰基-Phe或Trp，或是殘基13處的置換選自Val或Ala。另外地或替代地，殘基13為C端殘基并且殘基13處的修飾(當存在時)為酰胺基對末端羧基的置換，前提條件是所述肽類似物不為(Ala¹³)愛帕琳-13。

根據(jù)本發(fā)明的第二方面，提供一種藥物組合物，其包含本發(fā)明的第一方面的肽類似物聯(lián)合藥學上可接受的賦形劑。

根據(jù)本發(fā)明的第三方面，提供一種治療糖尿病的方法，所述方法包括向個體施用本發(fā)明的第一方面的肽類似物。任選地，糖尿病為2型糖尿病。

根據(jù)本發(fā)明的第四方面，提供一種刺激胰島素釋放的方法，所述方法包括向個體施用本發(fā)明的第一方面的肽類似物。

根據(jù)本發(fā)明的第五方面，提供一種調(diào)節(jié)血糖波動的方法，所述方法包括向個體施用本發(fā)明的第一方面的肽類似物。

根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供一種增加食物攝取或增加體重的方法，所述方法包括向個體施用本發(fā)明的第一方面的肽類似物。

根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供一種用于治療糖尿病的本發(fā)明的第一方面的肽類似物。任選地，糖尿病為2型糖尿病。

根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供一種用于刺激胰島素釋放的本發(fā)明的第一方面的肽類似物。

根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供一種用于調(diào)節(jié)血糖波動的本發(fā)明的第一方面的肽類似物。

如本文所用，pGlu是指：

，其羧酸基團與N端殘基的酰胺形成肽鍵。

愛帕琳-13的類似物與原生GIP相比可具有增強的刺激胰島素分泌、增強葡萄糖處理、延緩葡萄糖吸收的能力，或可表現(xiàn)出增強的血漿中穩(wěn)定性。它們還具有增強的降解抵抗性。

這些特性中的任一種都會增強類似物作為治療劑的效能。

本發(fā)明的藥物組合物旨在通過透皮、鼻腔吸入、經(jīng)口或注射途徑來遞送。本發(fā)明的肽類似物可單獨施用或通過與利拉魯肽的原生或衍生類似物(以商標名Victoza市售并且由Novo Nordisk研發(fā))、毒蜥外泌肽-4(exendin-4)(1-39)(艾塞那肽(INN，以Byetta,Bydureon市售))等的聯(lián)合療法來進行施用。

不受理論束縛，如下的肽類似物充當激動劑，所述肽類似物包含至少SEQ ID NO:1的殘基2-13并且還包含SEQ ID NO:1的殘基13處的置換和/或修飾，其中殘基13處的置換選自Tyr、Thi(β[2-噻吩基]-丙氨酸)、4-疊氮基-Phe、4-氰基-Phe或Trp；任選地，Tyr。

令人驚訝的是，如下的肽類似物充當拮抗劑，所述肽類似物具有或不具有N端添加的pGlu，包含至少SEQ ID NO:1的殘基2-13并且還包含SEQ ID NO:1的殘基13處的置換和/或修飾，其中殘基13處的置換選自Ala或Val。

附圖簡述

現(xiàn)將參照附圖以舉例的方式描述本發(fā)明的實施方案，在附圖中：

圖1示出在用來自禁食的正常小鼠的血漿溫育后各種愛帕琳-13相關(guān)類似物的穩(wěn)定性。(A)示出0、2、4、8和24小時后完整肽的百分比(n＝2)。值表示平均值±SEM。與每個時間點處的愛帕琳-13相比，^*P<0.05、^**P<0.01且^***P<0.001。(B)示出對每種類似物的曲線下面積(AUC)分析。值表示平均值±SEM。與愛帕琳-13相比，^***P<0.001。

圖2示出各種愛帕琳-13類似物的序列。箭頭指示在暴露于來自禁食的正常NIH Swiss小鼠的血漿之后一級序列上的各肽鍵斷裂的點。

圖3示出在用禁食的正常小鼠血漿溫育后各種(pGlu)-愛帕琳-13相關(guān)類似物的穩(wěn)定性。(A)示出0、2、4、8和24小時后完整肽的百分比(n＝2)。值表示平均值±SEM。與每個時間點處的(pGlu)愛帕琳-13相比，^*P<0.05、^**P<0.01且^***P<0.001。(B)示出對每種類似物的曲線下面積分析。值表示平均值±SEM。與(pGlu)愛帕琳-13相比，^***P<0.001。

圖4示出各種(pGlu)愛帕琳-13類似物的序列。箭頭指示在暴露于來自禁食的正常NIH Swiss小鼠的血漿之后一級序列上的各肽鍵降解的點。

圖5示出(A+B)愛帕琳-13和(C+D)(pGlu)愛帕琳-13相關(guān)類似物在患有膳食誘發(fā)的糖尿病的高脂肪飼喂的NIH Swiss小鼠中對降葡萄糖和胰島素釋放的急性效應(yīng)。在飼喂高脂肪飲食150天的禁食18小時的小鼠中，在腹膜內(nèi)單獨施用葡萄糖(18mmol/kg體重)或與愛帕琳類似物(25nmol/kg體重)聯(lián)合施用之前和之后測量血漿葡萄糖和血漿胰島素濃度。值表示八只小鼠的平均值±SEM(n＝8)。與單獨的葡萄糖相比，^*P<0.05、^**P<0.01且^***P<0.001。

圖6出在飼喂高脂肪飲食150天的禁食18小時的小鼠中，腹膜內(nèi)單獨施用葡萄糖(18mmol/kg體重)、分別與(Ala¹³)愛帕琳-13、(Tyr¹³)愛帕琳-13或兩者聯(lián)合施用(每種25nmol/kg體重)對(A)血糖和(B)血漿胰島素的效應(yīng)。值表示八只小鼠的平均值±SEM(n＝8)。與單獨的葡萄糖相比，^*P<0.05且^**P<0.01；與(Tyr¹³)愛帕琳-13相比，⁺P<0.05；與(Ala¹³)愛帕琳-13相比，且

圖7示出在飼喂高脂肪飲食150天的禁食18小時的小鼠中，腹膜內(nèi)單獨施用葡萄糖(18mmol/kg體重)、分別與(Val¹³)愛帕琳-13、(Tyr¹³)愛帕琳-13或兩者聯(lián)合施用(每種25nmol/kg體重)對(A)血糖和(B)血漿胰島素的效應(yīng)。值表示八只小鼠的平均值±SEM(n＝8)。與單獨的葡萄糖相比，^*P<0.05且^**P<0.01；與(Tyr¹³)愛帕琳-13相比，⁺P<0.05且⁺⁺P<0.01；與(Val¹³)愛帕琳-13相比，

圖8示出在飼喂高脂肪飲食150天的禁食18小時的小鼠中，腹膜內(nèi)單獨施用葡萄糖(18mmol/kg體重)、分別與(Ala¹³)愛帕琳-13、愛帕琳-13-酰胺或兩者聯(lián)合施用(每種25nmol/kg體重)對(A)血糖和(B)血漿胰島素的效應(yīng)。值表示八只小鼠的平均值±SEM(n＝8)。與單獨的葡萄糖相比，^*P<0.05且^**p<0.01；與愛帕琳-13-酰胺相比，⁺P<0.05且⁺⁺P<0.01；與(Ala¹³)愛帕琳-13相比，且

圖9示出在飼喂高脂肪飲食150天的禁食18小時的小鼠中，腹膜內(nèi)單獨施用葡萄糖(18mmol/kg體重)、分別與(Val¹³)愛帕琳-13、愛帕琳-13-酰胺或兩者聯(lián)合施用(每種25nmol/kg體重)對(A)血糖和(B)血漿胰島素的效應(yīng)。值表示八只小鼠的平均值±SEM(n＝8)。與單獨的葡萄糖相比，^*P<0.05且^**P<0.01；與愛帕琳-13-酰胺相比，⁺P<0.05、⁺⁺P<0.05且⁺⁺⁺P<0.001；與(Val¹³)愛帕琳-13相比，

圖10示出在飼喂高脂肪飲食150天的禁食18小時的小鼠中施用愛帕琳相關(guān)類似物(25nmol/kg體重)2小時后進行的試驗。在腹膜內(nèi)單獨施用葡萄糖(18mmol/kg體重)或與愛帕琳類似物聯(lián)合施用之前和之后測量(A)血糖和(B)血漿胰島素。值表示八只小鼠的平均值±SEM(n＝8)。與單獨的葡萄糖相比，^*P<0.05且^**P<0.01。

圖11示出在飼喂高脂肪飲食150天的禁食18小時的小鼠中施用愛帕琳相關(guān)類似物(25nmol/kg體重)8小時后進行的試驗。在腹膜內(nèi)單獨施用葡萄糖(18mmol/kg體重)或與愛帕琳類似物聯(lián)合施用之前和之后測量(A)血糖和(B)血漿胰島素。值表示八只小鼠的平均值±SEM(n＝8)。與單獨的葡萄糖相比，^*P<0.05且^**P<0.01。

圖12示出在患有膳食誘發(fā)的糖尿病的高脂肪飼喂的Swiss NIH小鼠中，脂肪酸改性的愛帕琳類似物對降葡萄糖和胰島素釋放的急性效應(yīng)。在飼喂高脂肪飲食150天的禁食18小時的小鼠中，在腹膜內(nèi)單獨施用葡萄糖(18mmol/kg體重)或與愛帕琳類似物(25nmol/kg體重)聯(lián)合施用之前和之后測量(A)血糖和(B)血漿胰島素。值表示八只小鼠的平均值±SEM(n＝8)。與單獨的葡萄糖相比，^*P<0.05。

圖13示出在飼喂高脂肪飲食150天的小鼠中施用脂肪酸愛帕琳類似物(25nmol/kg體重)16小時后進行的試驗。在腹膜內(nèi)單獨施用葡萄糖(18mmol/kg體重)或與愛帕琳類似物聯(lián)合施用之前和之后測量(A)血糖和(B)血漿胰島素。值表示八只小鼠的平均值±SEM(n＝8)。與單獨的葡萄糖相比，^*P<0.05、^**P<0.01且^***P<0.001。

圖14示出在高脂肪飼喂的NIH Swiss小鼠中，在28天研究期間，每天兩次施用鹽水、毒蜥外泌肽-4(1-39)、愛帕琳-13-酰胺和(pGlu)愛帕琳-13-酰胺(每種25nmol/kg體重)對(A)體重和(B)體重變化(％)的效應(yīng)。黑色水平條表示治療期。值表示平均值±S.E.M.(n＝8)，其中與高脂肪飼喂的鹽水治療小鼠相比，^*P<0.05并且^***p<0 001；與正常的對照小鼠相比，且

圖15示出在高脂肪飼喂的NIH Swiss小鼠中，在28天研究期間，每天兩次施用鹽水、毒蜥外泌肽-4(1-39)、愛帕琳-13-酰胺和(pGlu)愛帕琳-13-酰胺(每種25nmol/kg體重)對(A)累積食物攝取和(B)能量攝取的慢性效應(yīng)。值表示累積食物攝取的平均值±S.E.M.(n＝8)，其中與高脂肪飼喂的鹽水治療小鼠相比，^*P<0.01且^***P<0.001。

圖16示出在高脂肪飼喂的NIH Swiss小鼠中，在28天研究期間，每天兩次施用鹽水、毒蜥外泌肽-4(1-39)、愛帕琳-13-酰胺和(pGlu)愛帕琳-13-酰胺(每種25nmol/kg體重)對(A)血糖和(B)血漿胰島素的慢性效應(yīng)。黑色水平條表示治療期。值表示平均值±S.E.M.(n＝8)，其中與高脂肪飼喂的鹽水治療小鼠相比，^*P<0.05、^**P<0.01且^***p<0 001。

圖17示出每天兩次腹膜內(nèi)施用鹽水((0.9％w/v)NaCl)、毒蜥外泌肽-4(1-39)、愛帕琳-13-酰胺和(pGlu)愛帕琳-13-酰胺(每種25nmol/kg體重)并持續(xù)28天后在高脂肪飼喂的NIH Swiss小鼠中進行的ipGTT試驗。小鼠先前禁食18小時。在腹膜內(nèi)單獨施用葡萄糖(18mmol/kg體重)之前和之后測量(A)血糖和(B)血漿胰島素濃度。還包括0-60分鐘的葡萄糖和胰島素AUC值(C+D)。值表示平均值±S.E.M.(n＝8)，其中與高脂肪飼喂的鹽水治療小鼠相比，^*P<0.05、^**P<0.01且^***P<0.001；與正常小鼠相比，且

圖18示出每天兩次腹膜內(nèi)施用鹽水((0.9％w/v)NaCl)、毒蜥外泌肽-4(1-39)、愛帕琳-13-酰胺和(pGlu)愛帕琳-13-酰胺(每種25nmol/kg體重)并持續(xù)28天后在高脂肪飼喂的NIH Swiss小鼠中進行的OGGT試驗。小鼠先前禁食18小時。在經(jīng)口單獨施用葡萄糖(18mmol/kg體重)之前和之后測量(A)血糖和(B)血漿胰島素濃度。還包括0-60分鐘的葡萄糖和胰島素AUC值(C+D)。值表示平均值±S.E.M.(n＝8)，其中與高脂肪飼喂的鹽水治療小鼠相比，^*P<0.05、^**P<0.01且^***P<0.001；與正常小鼠相比，且

圖19示出每天兩次腹膜內(nèi)施用鹽水((0.9％w/v)NaCl)、毒蜥外泌肽-4(1-39)、愛帕琳-13-酰胺和(pGlu)愛帕琳-13-酰胺(每種25nmol/kg體重)并持續(xù)28天后對在高脂肪飼喂的NIH Swiss小鼠中進行的飼喂試驗的響應(yīng)。小鼠先前禁食18小時并且可自由獲取常飲食15分鐘。在t＝0、15、30、60和105分鐘時測量(A)血糖和(B)血漿胰島素濃度并且飼喂時間由黑色水平條表示。還示出0-60分鐘的葡萄糖和胰島素AUC數(shù)據(jù)(C+D)。值表示平均值±S.E.M.(n＝8)，其中與高脂肪飼喂的鹽水治療小鼠相比，^*P<0.05、^**P<0.01且^***P<0.001；與正常小鼠相比，且

圖20示出在28天的鹽水((0.9％w/v)NaCl)、毒蜥外泌肽-4(1-39)、愛帕琳-13-酰胺和(pGlu)愛帕琳-13-酰胺(每種25nmol/kg體重)施用之后在高脂肪飼喂的NIH Swiss小鼠中進行的胰島素敏感性試驗。在t＝0分鐘(A+B)時通過腹膜內(nèi)注射來施用胰島素(25U/kg體重)。還示出0-60分鐘注射后的％血漿葡萄糖曲線上面積(AAC)值(C+D)。值表示平均值±S.E.M.(n＝8)，其中與高脂肪飼喂的鹽水治療小鼠相比，^*P<0.05且^**P<0.01；與正常小鼠相比，

圖21示出在28天的鹽水((0.9％w/v)NaCl)、毒蜥外泌肽-4(1-39)、愛帕琳-13-酰胺和(pGlu)愛帕琳-13-酰胺(每種25nmol/kg體重)施用之后在高脂肪飼喂的NIH Swiss小鼠中進行的糖化血紅蛋白試驗的結(jié)果。從每只小鼠的尾靜脈采血并通過Bayer A1CNow⁺多測試系統(tǒng)記錄測量結(jié)果。值表示平均值±S.E.M.(n＝8)，其中與高脂肪飼喂的鹽水治療小鼠相比，^*P<0.05且^**P<0.01；與正常小鼠相比，且

圖22示出在高脂肪飼喂的、對照和治療的以及瘦型對照小鼠中，每天兩次腹膜內(nèi)施用鹽水((0.9％w/v)NaCl)、毒蜥外泌肽-4(1-39)、愛帕琳-13-酰胺和(pGlu)愛帕琳-13-酰胺(每種25nmol/kg體重)，施用28天之后對(A)體重(研究結(jié)束時)和(B)脂肪量(％)的慢性效應(yīng)。值表示平均值±S.E.M.(n＝6)，其中與高脂肪飼喂的鹽水治療小鼠相比，^*P<0.05且^***p<0 001；與正常小鼠相比，且

圖23示出在高脂肪飼喂的NIH Swiss小鼠中，每天兩次腹膜內(nèi)施用鹽水((0.9％w/v)NaCl)、毒蜥外泌肽-4(1-39)、愛帕琳-13-酰胺和(pGlu)愛帕琳-13-酰胺(每種25nmol/kg體重)，施用28天之后對能量消耗(A+B)的慢性效應(yīng)。將小鼠在CLAMS代謝室中放置24小時(12小時暗期，如黑色條所示)并且使用RER通過下列公式來計算能量消耗：(3.815+1.232×RER)×VO2。值表示平均值±S.E.M.(n＝6)，其中與高脂肪飼喂的鹽水治療小鼠相比，^*P<0.05。還示出單獨的光暗循環(huán)AUC值(C+D)。

圖24示出在高脂肪飼喂的NIH Swiss小鼠中，在28天研究期間，每天一次施用鹽水、利拉魯肽、(Lys⁸gluPAL)愛帕琳-13-酰胺和pGlu(Lys⁸gluPAL)愛帕琳-13-酰胺(每種25nmol/kg體重)對(A)體重和(B)體重變化(％)的慢性效應(yīng)。黑色水平條表示治療期。值表示平均值±S.E.M.(n＝8)，其中與高脂肪鹽水治療小鼠相比，^*P<0.05、^**P<0.01且^***P<0.001；與正常小鼠相比，且

圖25示出在高脂肪飼喂的NIH Swiss小鼠中，在28天研究期間，每天一次施用鹽水、利拉魯肽、(Lys⁸gluPAL)愛帕琳-13-酰胺和pGlu(Lys⁸gluPAL)愛帕琳-13-酰胺(每種25nmol/kg體重)對(A)累積食物攝取和(B)能量攝取的慢性效應(yīng)。值表示累積食物攝取和能量攝取的平均值±S.E.M.(n＝8)，其中與高脂肪鹽水治療小鼠相比，^*P<0.05、^**P<0.01且^***P<0.001。

圖26示出在高脂肪飼喂的NIH Swiss小鼠中，在28天研究期間，每天一次施用鹽水、利拉魯肽、(Lys⁸gluPAL)愛帕琳-13-酰胺和pGlu(Lys⁸gluPAL)愛帕琳-13-酰胺(每種25nmol/kg體重)對(A)血糖和(B)血漿胰島素的慢性效應(yīng)。黑色水平條表示治療期。值表示平均值±S.E.M.(n＝8)，其中與高脂肪鹽水治療小鼠相比，^*P<0.05、^**P<0.01且^***P<0.001。

圖27示出每天一次腹膜內(nèi)施用鹽水((0.9％w/v)NaCl)、利拉魯肽、(Lys⁸gluPAL)愛帕琳-13-酰胺和pGlu(Lys⁸gluPAL)愛帕琳-13-酰胺(每種25nmol/kg體重)并持續(xù)28天后在高脂肪飼喂的NIH Swiss小鼠中進行的ipGTT試驗。小鼠先前禁食18小時。在腹膜內(nèi)單獨施用葡萄糖(18mmol/kg體重)之前和之后測量(A)血糖和(B)血漿胰島素濃度。還包括0-60分鐘的葡萄糖和胰島素AUC值(C+D)。值表示平均值±S.E.M.(n＝8)，其中與高脂肪鹽水治療小鼠相比，^*P<0.05、^**P<0.01且^***P<0.001；與正常小鼠相比，且

圖28示出每天一次腹膜內(nèi)施用鹽水((0.9％w/v)NaCl)、利拉魯肽、(Lys⁸gluPAL)愛帕琳-13-酰胺和pGlu(Lys⁸gluPAL)愛帕琳-13-酰胺(每種25nmol/kg體重)并持續(xù)28天后在高脂肪飼喂的NIH Swiss小鼠中進行的OGTT試驗。小鼠先前禁食18小時。在經(jīng)口單獨施用葡萄糖(18mmol/kg體重)之前和之后測量(A)血糖和(B)血漿胰島素濃度。還包括0-60分鐘的葡萄糖和胰島素AUC值(C+D)。值表示平均值±S.E.M.(n＝8)，其中與高脂肪鹽水治療小鼠相比，^*P<0.05、^**P<0.01且^***P<0.001；與正常小鼠相比，且

圖29示出每天一次腹膜內(nèi)施用鹽水((0.9％w/v)NaCl)、利拉魯肽、(Lys⁸gluPAL)愛帕琳-13-酰胺和pGlu(Lys⁸gluPAL)愛帕琳-13-酰胺(每種25nmol/kg體重)并持續(xù)28天后對在高脂肪飼喂的NIH Swiss小鼠中進行的飼喂試驗的響應(yīng)。小鼠先前禁食18小時并且可自由獲取常飲食15分鐘。在t＝0、15、30、60和105分鐘時測量(A)血糖和(B)血漿胰島素濃度并且飼喂時間由黑色水平條表示。還示出0-60分鐘的葡萄糖和胰島素AUC值(C+D)。值表示平均值±S.E.M.(n＝8)，其中與高脂肪鹽水治療小鼠相比，^*P<0.05、^**P<0.01且^***P<0.001；與正常小鼠相比，且

圖30示出在28天的鹽水((0.9％w/v)NaCl)、利拉魯肽、(Lys⁸gluPAL)愛帕琳-13-酰胺和pGlu(Lys⁸gluPAL)愛帕琳-13-酰胺(每種25nmol/kg體重)(A+B)施用之后在高脂肪飼喂的NIH Swiss小鼠中進行的胰島素敏感性試驗。在t＝0分鐘時通過腹膜內(nèi)注射來施用胰島素(25U/kg體重)。還示出0-60分鐘注射后的％血漿葡萄糖AAC值(C+D)。值表示平均值±S.E.M.(n＝8)，其中與高脂肪鹽水治療小鼠相比，^*p<0.05、^**P<0.01且^***P<0.001；與正常小鼠相比，

圖31示出在28天的鹽水((0.9％w/v)NaCl)、利拉魯肽、(Lys⁸gluPAL)愛帕琳-13-酰胺和pGlu(Lys⁸gluPAL)愛帕琳-13-酰胺(每種25nmol/kg體重)施用之后在高脂肪飼喂的NIH Swiss小鼠中進行的糖化血紅蛋白試驗的結(jié)果。從每只小鼠的尾靜脈采血并通過BayerA1CNow⁺多測試系統(tǒng)記錄測量結(jié)果。值表示平均值±S.E.M.(n＝8)，其中與高脂肪鹽水治療小鼠相比，^*P<0.05、^**p<0.01且^***p<0.001；與正常小鼠相比，且

圖32示出在高脂肪飼喂的鹽水對照、肽治療的以及瘦型對照小鼠中，在高脂肪飼喂的NIH Swiss小鼠中，每天一次腹膜內(nèi)施用鹽水((0.9％w/v)NaCl)、利拉魯肽、(Lys⁸gluPAL)愛帕琳-13-酰胺和pGlu(Lys⁸gluPAL)愛帕琳-13-酰胺(每種25nmol/kg體重)，施用28天之后對(A)體重(研究結(jié)束時)和(B)脂肪量(％)的慢性效應(yīng)。值表示平均值±S.E.M.(n＝6)，其中與高脂肪鹽水治療小鼠相比，^*P<0.05、^**P<0.01且^***P<0.001；與正常小鼠相比，

圖33示出在高脂肪飼喂的NIH Swiss小鼠中，每天一次腹膜內(nèi)施用鹽水((0.9％w/v)NaCl)、利拉魯肽、(Lys⁸gluPAL)愛帕琳-13-酰胺和pGlu(Lys⁸gluPAL)愛帕琳-13-酰胺(每種25nmol/kg體重)，施用28天之后對能量消耗(A+B)的慢性效應(yīng)。將小鼠在CLAMS代謝室中放置24小時(12小時暗期，如黑色條所示)并且使用RER通過下列公式來計算平均能量消耗以及暗階段和光階段能量消耗：(3.815+1.232×RER)×VO₂。值表示平均值±S.E.M.(n＝6)，其中與高脂肪鹽水治療小鼠相比，^*P<0.05且^**P<0.01；與正常小鼠相比，還示出單獨的光暗循環(huán)AUC值(C+D)。

圖34示出在高脂肪飼喂的NIH Swiss小鼠中，每天一次施用利拉魯肽、(Lys⁸gluPAL)愛帕琳-13-酰胺和pGlu(Lys⁸gluPAL)愛帕琳-13-酰胺對(A)總膽固醇和(B)甘油三酯的效應(yīng)。值表示平均值±S.E.M.(n＝8)，其中與高脂肪飼喂的小鼠相比，^*P<0.05、^**P<0.01且^***p<0 001。

圖35示出在高脂肪飼喂的NIH Swiss小鼠中，每天一次施用利拉魯肽、(Lys⁸gluPAL)愛帕琳-13-酰胺和pGlu(Lys⁸gluPAL)愛帕琳-13-酰胺對(A)HDL-C和(B)LDL-C的效應(yīng)。值表示平均值±S.E.M.(n＝8)，其中與高脂肪飼喂的對照相比，^*P<0.05且^**P<0.01；與正常小鼠相比，

圖36示出在雄性NIH Swiss小鼠中，(A)愛帕琳-13類似物(25nmol/kg)對主動食物攝取的效應(yīng)和(B)(pGlu)愛帕琳-13類似物(25nmol/kg)對主動食物攝取的效應(yīng)。通過腹膜內(nèi)注射施用鹽水和肽類似物并且在飼喂后的30、60、90和120分鐘對累積食物攝取進行監(jiān)測。值為平均值±SEM(n＝8)。與鹽水對照組相比，^*P<0.05、^**P<0.01且^**P<0.001。

圖37示出在雄性NIH Swiss小鼠中，(A)愛帕琳-13(1-100nmol/kg)對主動食物攝取的急性劑量響應(yīng)效應(yīng)和(B)(pGlu)愛帕琳-13(1-100nmol/kg)對主動食物攝取的急性劑量響應(yīng)效應(yīng)。通過腹膜內(nèi)注射施用鹽水和肽類似物并且在飼喂后的30、60、90和120分鐘對累積食物攝取進行監(jiān)測。值為平均值±SEM(n＝8)。與鹽水對照組相比，^*P<0.05且^**P<0.01。

圖38示出在雄性NIH Swiss小鼠中，(A)愛帕琳-13-酰胺(1-100nmol/kg)對主動食物攝取的急性劑量響應(yīng)效應(yīng)和(B)急性劑量響應(yīng)效應(yīng)of(pGlu)愛帕琳-13-酰胺(1-100nmol/kg)對主動食物攝取的急性劑量響應(yīng)效應(yīng)。通過腹膜內(nèi)注射施用鹽水和肽類似物并且在飼喂后的30、60、90和120分鐘對累積食物攝取進行監(jiān)測。值為平均值±SEM(n＝8)。與鹽水對照組相比，^*P<0.05且^**P<0.01。

圖39示出在雄性NIH Swiss小鼠中，(Lys⁸GluPAL)愛帕琳-13-酰胺、pGlu(Lys⁸GluPAL)愛帕琳-13-酰胺、Lys⁸GluPAL(Tyr¹³)愛帕琳-13和Lys⁸GluPAL(Val¹³)愛帕琳-13(25nmol/kg)對主動食物攝取的效應(yīng)。通過腹膜內(nèi)注射施用鹽水和肽類似物并且在飼喂后的30、60、90和120分鐘對累積食物攝取進行監(jiān)測。值為平均值±SEM(n＝8)。與鹽水對照組相比，^*P<0.05且^**P<0.01。

圖40示出在雄性NIH Swiss小鼠中，(A)各種脂肪酸衍生的愛帕琳-13類似物(1-100nmol/kg)對主動食物攝取的急性劑量響應(yīng)效應(yīng)和(B)各種脂肪酸衍生的(pGlu)愛帕琳-13類似物(1-100nmol/kg)對主動食物攝取的急性劑量響應(yīng)效應(yīng)。通過腹膜內(nèi)注射施用鹽水和肽類似物并且在飼喂后的30、60、90和120分鐘對累積食物攝取進行監(jiān)測。值為平均值±SEM(n＝8)。與鹽水對照組相比，^*P<0.05且^**P<0.01。

材料和方法

來自禁食的正常NIH Swiss小鼠的血漿對愛帕琳肽的降解

在37℃下于軌道式振蕩器上，將愛帕琳肽(>95％純度；100μg)在50mM三乙醇胺緩沖液(370μl；pH 7.4)中用10μl禁食的正常小鼠血漿(從禁食18小時的NIH Swiss小鼠收集)體外溫育0、2、4、8和24小時。將酶促反應(yīng)通過添加50μl 10％TFA(0.1％v/v；Sigma-Aldrich Ltd,(Poole,Dorset,UK)來終止并且在-20℃下冷凍直至分離。然后將終止的反應(yīng)產(chǎn)物施加至分析型Vydac C-8柱(4.6×150mm；Phenomenex,Macclesfield,Cheshire,UK)上以用于rp-HPLC分析。使用Spectrasystem UV 2000檢測器(Thermoquest Limited,Manchester,UK)監(jiān)測214nm處的吸光度并且通過Thermo Electron ChromQuest數(shù)據(jù)收集軟件(4版)來記錄跡線。人工收集HPLC峰級分并且通過MALDI-TOF質(zhì)譜儀以進行肽鑒定。

使用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜儀(MALDI-TOF MS)來表征愛帕琳肽。

通過MALDI-TOF質(zhì)譜來檢查并表征所有購買的肽。將1mg/ml肽樣品的等分試樣(1.5μl)施加至100孔不銹鋼樣品板的一個孔中。將另外1.5μl基質(zhì)溶液(10mg/ml溶液)與肽樣品混合并在室溫下進行干燥。使用Voyager-DE BioSpectrometry Workstation(PerSeptive Biosystems,Framingham,MA,USA)來記錄質(zhì)譜。將質(zhì)量記錄為相對于相對峰強度的質(zhì)荷(m/z)比并且與理論值進行比較。

愛帕琳類似物的體內(nèi)急性和長期效應(yīng)。

NIH Swiss小鼠(Harlan UK Ltd.,Blackthorne,UK)源于得自美國國立衛(wèi)生研究院(Bethesda,Maryland)的細胞核克隆。將一組小鼠維持標準嚙齒動物飲食(10％脂肪、30％蛋白質(zhì)、60％碳水化合物；(％)總能量12.99kJ/g,Trouw Nutrition,Cheshire,UK)并且用作正常血糖模型。將其他NIH Swiss小鼠(8周齡)維持高脂肪飲食(45％脂肪、20％蛋白質(zhì)、35％碳水化合物；(％)總能量26.15kJ/g；Dietex,Essex,UK)達150天以產(chǎn)生飲食誘發(fā)的肥胖癥-糖尿病模型。與接受標準嚙齒動物飲食的小鼠相比，高脂肪飼喂的小鼠表現(xiàn)出增加的體重和升高的非空腹血糖(n＝8)。所有小鼠均容納在維持于22±2℃的12小時光:12小時暗循環(huán)(08:00-20:00h)的空調(diào)室中，進行單獨關(guān)籠并根據(jù)體重和非空腹血糖來選擇用于實驗組。飲用水和飲食均可自由獲得。所有研究均根據(jù)英國動物(科學程序)法案1986(UK Animals(Scientific Procedures)Act 1986)進行。

對于急性體內(nèi)研究，在腹膜內(nèi)注射葡萄糖(18mol/kg體重)之前(t＝0)和之后的15、30、60和105分鐘就立即將來自禁食的清醒小鼠的切去尾尖的尾部靜脈的血樣收集到氟化物/肝素涂布的葡萄糖微量離心管(Sarstedt,Germany)中。

對于每天施用兩次所選愛帕琳類似物的28天長期研究，將正常對照NIH Swiss和高脂肪飼喂的NIH Swiss分組并在4天導(dǎo)入期(run-in period)期間接受每天兩次(09:00h和17:00h)腹膜內(nèi)注射鹽水媒介物(0.9％NaCl(w/v))。在導(dǎo)入期后，正常對照(n＝8)和高脂肪飼喂的小鼠(n＝8)接受每天兩次(09:00h和17:00h)腹膜內(nèi)施用鹽水媒介物(0.9％NaCl(w/v))并持續(xù)28天。在28天治療期內(nèi)，其他組的高脂肪飼喂的小鼠(n＝8)接受每天兩次腹膜內(nèi)注射愛帕琳-13-酰胺、(pGlu)愛帕琳-13-酰胺或毒蜥外泌肽-4(1-39)(每種25nmol/kg體重)。

對于每天施用一次所選愛帕琳類似物的另一項28天長期研究，將正常對照NIH Swiss(n＝8)和高脂肪飼喂的NIH Swiss(n＝8)分組并在4天導(dǎo)入期內(nèi)接受每天一次(17:00h)腹膜內(nèi)注射鹽水媒介物(0.9％NaCl(w/v))。在導(dǎo)入期后，正常對照(n＝8)和高脂肪飼喂的小鼠(n＝8)接受每天一次(17:00h)腹膜內(nèi)施用鹽水媒介物(0.9％NaCl(w/v))并持續(xù)28天。在28天治療期內(nèi)，其他組的高脂肪飼喂的小鼠(n＝8)接受每天一次腹膜內(nèi)注射(Lys⁸gluPal)愛帕琳-13-酰胺、pGlu(Lys⁸gluPal)愛帕琳-13-酰胺或利拉魯肽(每種25nmol/kg體重)。

28天長期研究的代謝效應(yīng)的測量

在整個導(dǎo)入期和28天治療期中，以2-3天的間隔監(jiān)測食物攝取、體重、血糖和血漿胰島素。在整個研究中以一定的間隔從清醒小鼠的切除的尾靜脈收集用于葡萄糖和血漿胰島素測量的血樣。在28天治療期后，進行經(jīng)口、腹膜內(nèi)和膳食試驗葡萄糖耐受性(18nmol/kg體重)以及胰島素敏感性(25U/kg體重)試驗。使用Ascensia Contour儀測量葡萄糖并且對血進行收集并處理以通過放射性免疫測定進行血漿胰島素分析。還使用PIXImus DEXA掃描儀來評估體重和脂肪量，同時使用CLAMS代謝室來評估能量消耗、攝取、食物攝取和取食持續(xù)時間(bout)。使用Bayer A1C Now⁺Multi測試儀28天后分析HbA_1c。通過使用iLab分析儀獲得脂質(zhì)特征試驗。使用iLab分析儀測量血漿(3μl)中的膽固醇、甘油三酯和HDL-膽固醇水平。使用Friedewald公式來獲得LDL-膽固醇水平＝總膽固醇-HDL-(甘油三酯/3)。

食物攝取的愛帕琳類似物的急性效應(yīng)

通過在3周期間逐漸減少每日飼喂時段來使小鼠適應(yīng)3小時/天的每日飼喂方案。執(zhí)行這種方案以確保小鼠在3小時內(nèi)消耗全部的每日食物攝取，從而允許在小鼠的已知的進食時段期間測量“肽”效應(yīng)。在1至7天，從10:00h至20:00h向小鼠供食；在8至14天，從10:00h至19:00h供食；在15至21天，從10:00h至13:00h以3小時的間隔限食。此方案在整個實驗時段中持續(xù)。

向適應(yīng)3小時每日飼喂方案的小鼠施用的是在10:00h以腹膜內(nèi)注射鹽水(0.9％w/v NaCl)或愛帕琳肽(1-100nmol/kg體重)(n＝8)。在剛注射后，首先對食物進行稱重，然后提供給小鼠，隨后以30分鐘的間隔稱重并持續(xù)最多180分鐘。

統(tǒng)計分析

結(jié)果以平均值±S.E.M示出。通過Prism GraphPad 5.0版使用學生t檢驗(Student t-test)來比較數(shù)據(jù)。使用梯形法則通過基線扣除來計算曲線下面積(AUC)分析。將P<0.05視為統(tǒng)計學顯著性。

表1.愛帕琳-13相關(guān)類似物的降解概況。

各種愛帕琳-13相關(guān)類似物的降解概況：在Vydac C-8分析型HPLC柱上分離血漿(4h)溫育物并在通過MALDI-TOF質(zhì)譜儀進行分析之前收集所有峰級分。示出降解片段、實際分子量(M_r)和保留時間(RT)。每個片段的理論分子量在括號中示出。

表2.(pGlu)愛帕琳-13相關(guān)類似物的降解概況。

各種(pGlu)愛帕琳-13相關(guān)類似物的降解概況：在Vydac C-8分析型HPLC柱上分離血漿(4h)溫育物并在通過MALDI-TOF質(zhì)譜儀進行分析之前收集所有峰級分。示出降解片段、理論分子量(M_r)和保留時間(RT)。每個片段的理論分子量在括號中示出。

表3. 4小時后留下的完整肽的百分比和估計的愛帕琳肽半衰期(t_1/2)。

匯總表顯示完整肽的百分比和所測試愛帕琳相關(guān)肽類似物的半衰期。百分比通過構(gòu)建完整肽百分比相對于時間的圖來計算半衰期。使用線性回歸"最佳擬合"分析來計算一半的肽降解的時間。值為兩次獨立實驗的平均值±SEM。與愛帕琳-13相比，^***P<0.001。

表4.數(shù)據(jù)顯示在飼喂高脂肪飲食150天的NIH Swiss小鼠中與體內(nèi)急性降葡萄糖和促胰島素活性有關(guān)的愛帕琳-13相關(guān)類似物的等級次序。

注意：^表示肽拮抗劑。分別與單獨的血糖組合單獨的血漿胰島素葡萄糖組相比，^*P<0.05、^**P<0.01且^***P<0.001。

表5.數(shù)據(jù)顯示在飼喂高脂肪飲食150天的NIH Swiss小鼠中，單獨的和組合的(Tyr¹³)愛帕琳-13和愛帕琳-13-酰胺對血糖和血漿胰島素分泌的急性效應(yīng)，以及單獨的和組合的(Ala¹³)愛帕琳-13和(Val¹³)愛帕琳-13對血糖和血漿胰島素分泌的拮抗特性。

分別與單獨的血糖組合單獨的血漿胰島素葡萄糖組相比，^*P<0.05、^**P<0.01且^***P<0.001。

表6.數(shù)據(jù)顯示在飼喂高脂肪飲食150天的NIH Swiss小鼠中，在2小時延緩后，各種愛帕琳相關(guān)類似物對降葡萄糖和血漿胰島素分泌的等級次序。

分別與單獨的血糖組合單獨的血漿胰島素葡萄糖組相比，^**P<0.01且^***P<0.001。

表7.數(shù)據(jù)顯示在飼喂高脂肪飲食150天的NIH Swiss小鼠中，在8小時延緩后，各種愛帕琳相關(guān)類似物對降葡萄糖和血漿胰島素分泌的等級次序。

分別與單獨的血糖組合單獨的血漿胰島素葡萄糖組相比，^*P<0.05。

表8.數(shù)據(jù)顯示在飼喂高脂肪飲食150天的高脂肪飼喂NIH小鼠中，在急性腹膜內(nèi)葡萄糖耐受性試驗后，脂肪酸衍生的愛帕琳激動劑響應(yīng)于胰島素分泌和降葡萄糖效應(yīng)的等級次序。

與單獨的血漿胰島素葡萄糖組相比，^*P<0.05。

表9.數(shù)據(jù)顯示在飼喂高脂肪飲食150天的高脂肪飼喂NIH小鼠中，在16小時的延緩腹膜內(nèi)葡萄糖耐受性試驗后，脂肪酸衍生的愛帕琳激動劑響應(yīng)于胰島素分泌和降葡萄糖效應(yīng)的等級次序。

分別與單獨的血糖組合單獨的血漿胰島素葡萄糖組相比，^*P<0.05、^**P<0.01且^***P<0.001。

圖36示出(A)與鹽水治療對照相比，愛帕琳-13-酰胺(25nmol/kg)在3小時內(nèi)將食物攝取從21.5％減少至33.7％(P<0.05-P<0.001)。與鹽水治療對照相比，(Val¹³)愛帕琳-13(25nmol/kg)充當拮抗劑并在3小時內(nèi)將食物攝取從10.7％增加至16.0％(P<0.05且P<0.01)。(B)與鹽水治療對照相比，(pGlu)愛帕琳-13-酰胺(25nmol/kg)在3小時內(nèi)將食物攝取從27.0％減少至32.4％(P<0.01且P<0.001)。

與鹽水治療對照相比，pGlu(Val¹³)愛帕琳-13(25nmol/kg)充當拮抗劑并在3小時內(nèi)將食物攝取從13.6％增加至15.8％(P<0.05且P<0.01)。

圖37示出(A)愛帕琳-13(100nmol/kg)在90分鐘時將食物攝取減少16.7％(P<0.01),然而，此效應(yīng)在3小時內(nèi)不可持續(xù)。(B)(pGlu)愛帕琳-13(100nmol/kg)在90分鐘時并將食物攝取從3.8％減少至28.1％(P<0.05且P<0.01)。然而，此效應(yīng)在3小時內(nèi)不可持續(xù)。

圖38示出(A)與鹽水治療對照相比，愛帕琳-13-酰胺(25nmol/kg)在3小時內(nèi)將食物攝取從23.2％減少至31.3％(P<0.05-P<0.001)。與鹽水治療對照相比，愛帕琳-13-酰胺(100nmol/kg)在3小時內(nèi)將食物攝取從19.4％減少至34.5％(P<0.05且P<0.01)。(B)與鹽水治療對照相比，(pGlu)愛帕琳-13-酰胺(25nmol/kg)在3小時內(nèi)將食物攝取從24.1％減少至30.8％(P<0.05-P<0.001)。與鹽水治療對照相比，(pGlu)愛帕琳-13-酰胺(100nmol/kg)在3小時內(nèi)將食物攝取從減少26.7％至41.1％(P<0.01且P<0.001)。

圖39示出與鹽水治療對照相比，(Lys⁸GluPAL)愛帕琳-13-酰胺(25nmol/kg)將食物攝取從12.0％減少至23.0％(120至180分鐘；P<0.01且P<0.001)。與鹽水治療對照相比，pGlu(Lys⁸GluPAL)愛帕琳-13-酰胺(25nmol/kg)將食物攝取從20.8％減少至30.1％(120至180分鐘；P<0.001)。與鹽水治療對照相比，Lys⁸GluPAL(Val¹³)愛帕琳-13(25nmol/kg)將食物攝取增加最多9.2％(150分鐘；P<0.05且P<0.01)。

圖40示出(A)與鹽水治療對照相比，(Lys⁸GluPAL)愛帕琳-13-酰胺(25nmol/kg)將食物攝取從14.5％減少至25.7％(120至180分鐘；P<0.01且P<0.001)。與鹽水治療對照相比，(Lys⁸GluPAL)愛帕琳-13-酰胺(100nmol/kg)將食物攝取從9.0％減少至40.2％(90至180分鐘；P<0.05-P<0.001)。(B)與鹽水治療對照相比，pGlu(Lys⁸GluPAL)愛帕琳-13-酰胺(25nmol/kg)將食物攝取從19.8％減少至32.1％(120至180分鐘；P<0.001)。與鹽水治療對照相比，pGlu(Lys⁸GluPAL)愛帕琳-13-酰胺(100nmol/kg)將食物攝取從9.6％減少至40.3％(90至180分鐘；P<0.05且P<0.001)。

以各種劑量測試某些肽(圖36-40)。用于其他生理研究的25nmol/kg劑量在減少食物攝取方面起到有效的作用。25nmol/kg劑量常常與100nmol/kg劑量同樣有效。

所述類似物在減少食物攝取方面更優(yōu)于原生肽(存在于圖37中)。脂肪酸肽在后面的時間點起效較慢，但的確具有顯著的效應(yīng)。優(yōu)于方案的關(guān)系，發(fā)明人未進行超過3小時的觀察，但這些脂肪酸改性的類似物可能具有超過3小時的更長的持續(xù)效應(yīng)。

討論

研究指示僅愛帕琳類似物的降解途徑是經(jīng)由血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)同系物ACE2(Vickers等2002)，其裂解愛帕琳序列上的C端氨基酸(Phe¹³)。圖2示出愛帕琳-13類似物的可能裂解位點，并且圖4示出(pGlu)愛帕琳-13類似物基于當前MALDI-MS裂解模式的預(yù)測裂解。這在表1和表2中示出。幾乎全部的所測試類似物顯示出在它們各自的序列內(nèi)的不止一個肽鍵處的裂解點。這符合Pitkin及其合作者2010的報告：不含C端苯丙氨酸的(pGlu)愛帕琳-13在體外對人體組織的APJ受體具有相似的親和力和激動劑活性，這表明在人體中ACE2對愛帕琳的裂解并非唯一的失活步驟。實際上，El Messari及其合作者(2004)的結(jié)論是，ACE2裂解不太可能使愛帕琳肽失活，因為體外結(jié)構(gòu)活性研究顯示，不含C端苯丙氨酸的愛帕琳在CHO細胞中表達的大鼠愛帕琳受體處顯示出類似的結(jié)合和功能活性。

尚不存在已公布的關(guān)于愛帕琳類似物的體外穩(wěn)定性的數(shù)據(jù)。當前數(shù)據(jù)突出Phe向Ala、Tyr、Val的C端置換以及酰胺化C端的添加(圖1和圖3)的穩(wěn)定性和有效性的改善。與原生愛帕琳-13相比，愛帕琳-13類似物(Val¹³)愛帕琳-13(t_1/2 7.7h)、(Tyr¹³)愛帕琳-13(t_1/28.5h)和愛帕琳-13-酰胺(t_1/2 11.4h)在用瘦型小鼠血漿溫育時均在2、4和8小時顯示出顯著更大的完整肽(t_1/2 2.1h)。實際上，表3指示除了原生(pGlu)愛帕琳-13、愛帕琳-36和愛帕琳-12之外，所有測試的類似物均具有比愛帕琳-13顯著更長的半衰期(t_1/2)，就等級次序而言，pGlu(Tyr¹³)愛帕琳-13和愛帕琳-13酰胺顯示出最高的穩(wěn)定性(除了此階段改性的脂肪酸類似物之外)。

為了評估(Ala¹³)愛帕琳-13和(Val¹³)愛帕琳-13的拮抗特性，將這些肽在體內(nèi)單獨施用，以及與兩種愛帕琳-13相關(guān)激動劑(Tyr¹³)愛帕琳-13和愛帕琳-13-酰胺(圖6-10；表5)聯(lián)合施用。當與表現(xiàn)為最有效拮抗劑的(Val¹³)愛帕琳-13聯(lián)合施用時，(Ala¹³)愛帕琳-13和(Val¹³)愛帕琳-13兩者均阻斷(Tyr¹³)愛帕琳-13和愛帕琳-13-酰胺的降葡萄糖特性。

在高脂肪飼喂的NIH Swiss小鼠中進行急性體內(nèi)研究后，顯示(pGlu)愛帕琳-13-酰胺和愛帕琳-13-酰胺在降血糖和改善葡萄糖耐受性方面為最有前景的APJ受體激動劑(圖5)。這些急性體內(nèi)研究結(jié)果匯總于表4中。在高脂肪飼喂的NIH Swiss小鼠中，在腹膜內(nèi)注射至少4小時后這兩種類似物仍保持功效(圖11)，其中(pGlu)愛帕琳-13-酰胺保持功效最多8小時(圖12)。

為了產(chǎn)生更長效作用的肽，合成愛帕琳-13-酰胺、(Tyr¹³)愛帕琳-13和(pGlu)愛帕琳-13-酰胺的脂肪酸類似物。使用在8位連接至賴氨酸(Lys)的ε-氨基的C₁₆棕櫚酸(PAL)基團。已產(chǎn)生GIP和GLP-1的許多?；衔?，這些酰化化合物均顯示出完全的酶穩(wěn)定性和延長的藥動學特征。脂肪酸部分向肽鏈中的摻入促進與蛋白質(zhì)如白蛋白的結(jié)合，并從而延長作用的持續(xù)時間。與原生愛帕琳-13相比，顯示這三種脂肪酸類似物Lys⁸GluPAL(Tyr¹³)愛帕琳-13、(Lys⁸GluPAL)愛帕琳-13-酰胺和pGlu(Lys⁸GluPAL)愛帕琳-13-酰胺(均含有經(jīng)由谷氨酸接頭(Glu)綴合至Lys⁸的C₁₆脂肪酸(PAL))在用瘦型小鼠血漿溫育時具有顯著更大的完整肽(t_1/2>24小時)(表3)。在高脂肪飼喂的NIH Swiss小鼠中進行急性體內(nèi)研究后，顯示pGlu(Lys⁸GluPAL)愛帕琳-13-酰胺和(Lys⁸GluPAL)愛帕琳-13-酰胺在評估降血糖和改善葡萄糖耐受性(圖12)時為最具前景的，并且此類活性被保持并且甚至超過最多16小時(圖13)。這些急性體內(nèi)研究結(jié)果匯總于表6-9中。

在急性體內(nèi)研究后，使用患有飲食誘發(fā)的胰島素抗性和肥胖癥的高脂肪飼喂的雄性NIH Swiss小鼠來在兩次單獨的研究中評估四種最有前景的類似物的慢性降葡萄糖和促胰島素效應(yīng)，即，愛帕琳-13-酰胺、(pGlu)愛帕琳-13-酰胺(它們的作用與有效GLP-1激動劑、毒蜥外泌肽-4(1-39)相比)(圖14-23)以及(Lys⁸GluPAL)愛帕琳-13-酰胺和pGlu(Lys⁸GluPAL)愛帕琳-13-酰胺(它們的作用與脂肪酸GLP-1激動劑、利拉魯肽相比)(圖24-35)。

與急性測試的早先研究結(jié)果符合，高脂肪飼喂的小鼠顯示出體重、食物攝取和高胰島素血癥的逐漸增加，這與葡萄糖耐受性異常以及胰島素分泌和胰島素敏感性降低相關(guān)聯(lián)(Gault等2007)。每天兩次施用愛帕琳-13-酰胺和(pGlu)愛帕琳-13-酰胺在研究的大致第20天顯著降低了體重，并且只有(pGlu)愛帕琳-13-酰胺顯著減少了食物攝取。(pGlu)愛帕琳-13-酰胺在研究的第10天開始顯著減少循環(huán)血糖并增加血漿胰島素濃度，如同毒蜥外泌肽-4(1-39)一樣(圖14-16)。兩者在研究結(jié)束時均顯著降低了血糖濃度。

(pGlu)愛帕琳-13-酰胺和毒蜥外泌肽-4(1-39)顯示出對非空腹血漿胰島素水平的顯著增加，而愛帕琳-13-酰胺沒有(圖16)。(pGlu)愛帕琳-13-酰胺、愛帕琳-13-酰胺和毒蜥外泌肽-4(1-39)在腹膜內(nèi)和經(jīng)口葡萄糖負荷后均顯著改善了葡萄糖耐受性和血漿胰島素波動(28天治療期后)(圖17和圖18)。此外，毒蜥外泌肽-4在葡萄糖負荷后對血糖濃度的效應(yīng)負荷先前利用此肽的研究結(jié)果。用(pGlu)愛帕琳-13-酰胺得到的急性研究結(jié)果顯示出有效的抗高血糖和促胰島素特性；在利用類似物的28天長期施用后也注意到這種結(jié)果，因此鞏固了急性研究中所觀察到的效應(yīng)。響應(yīng)于飼喂(圖19)，(pGlu)愛帕琳-13-酰胺、毒蜥外泌肽-4(1-39)和愛帕琳-13-酰胺均顯示出相似的血糖濃度降低水平和胰島素分泌增加水平，其中與正常小鼠相比，(pGlu)愛帕琳-13-酰胺未顯示出關(guān)于血糖的顯著性。

(pGlu)愛帕琳-13-酰胺顯著改善了胰島素敏感性(圖20)并且此研究結(jié)果符合Yue及其合作者(2010)的結(jié)論：愛帕琳是維持胰島素敏感性體內(nèi)所必需的。實際上，與高脂肪飼喂的鹽水治療對照相比，(pGlu)愛帕琳-13-酰胺還顯示出糖化血紅蛋白(HbA_1c)的減少(圖21)。

與高脂肪飼喂的對照(35.8％)相比，(pGlu)愛帕琳-13-酰胺顯著降低了脂肪量百分比，而毒蜥外泌肽-4和愛帕琳-13-酰胺未達到顯著性(圖22B)。此外，與HF治療的鹽水組(10.3kcal/h)相比，(pGlu)愛帕琳-13-酰胺(11.5kcal/小時；P<0.05)增加了能量消耗(圖23)。

每天一次施用pGlu(Lys⁸GluPAL)愛帕琳-13-酰胺在28天研究的第16天誘發(fā)顯著的體重降低，而(Lys⁸GluPAL)愛帕琳-13-酰胺和利拉魯肽在第21天顯示出顯著性(圖24A)。實際上，pGlu(Lys⁸GluPAL)愛帕琳-13-酰胺將體重減少大約7％，而(Lys⁸GluPAL)愛帕琳-13-酰胺和利拉魯肽分別將體重減少大約4％和3％(圖24B)。pGlu(Lys⁸GluPAL)愛帕琳-13-酰胺、(Lys⁸GluPAL)愛帕琳-13-酰胺和利拉魯肽在研究的第8天均顯著減少了食物攝取(圖25)。(Lys⁸GluPAL)愛帕琳-13-酰胺和利拉魯肽在研究的第10天開始顯著減少循環(huán)血糖并增加血漿胰島素濃度，而pGlu(Lys⁸GluPAL)愛帕琳-13-酰胺在第13天顯示出顯著性(圖26)。

響應(yīng)于腹膜內(nèi)和經(jīng)口葡萄糖耐量篩查(glucose challenge)，利拉魯肽(Lys⁸GluPAL)愛帕琳-13-酰胺和pGlu(Lys⁸GluPAL)愛帕琳-13-酰胺在28天治療期后均顯著改善了葡萄糖耐受性和血漿胰島素波動(圖27和圖28)，其中當與正常小鼠相比時，pGlu(Lys⁸GluPAL)愛帕琳-13-酰胺在腹膜內(nèi)葡萄糖耐量篩查后在降血糖方面未顯示出顯著差異。在飼喂試驗后治療期之后觀察到相似的模式(圖29)。

(Lys⁸GluPAL)愛帕琳-13-酰胺和pGlu(Lys⁸GluPAL)愛帕琳-13-酰胺顯著改善了胰島素敏感性并且此效應(yīng)大于利用利拉魯肽所觀察到的效應(yīng)(圖30)。另外，在僅28天治療后，相對于瘦型對照，pGlu(Lys⁸GluPAL)愛帕琳-13-酰胺顯著降低了HbA_1c水平，超過(Lys⁸GluPAL)愛帕琳-13-酰胺和利拉魯肽。

DEXA分析表明，(Lys⁸GluPAL)愛帕琳-13-酰胺和pGlu(Lys⁸GluPAL)愛帕琳-13-酰胺與高脂肪飼喂的鹽水對照小鼠(36.2％)相比顯著降低了脂肪量百分比(30.8％；分別為P<0.05且30.1％；P<0.05)，并且未觀察到與瘦型對照相比的顯著性。然而，利拉魯肽治療小鼠與瘦型對照相比顯示出顯著更高的脂肪量百分比(圖32)。

與高脂肪飼喂的鹽水對照小鼠(13.0kcal/小時)相比，(Lys⁸GluPAL)愛帕琳-13-酰胺(15.4kcal/小時；p<0.05)和pGlu(Lys⁸GluPAL)愛帕琳-13-酰胺(16.0kcal/小時；p<0.05)在24小時時段內(nèi)在CLAMS室中消耗顯著更多的能量并且利拉魯肽未達到顯著性(圖33)。這可解釋利用這些肽觀察到的顯著體重降低。

這些觀察指示，利用(pGlu)愛帕琳-13-酰胺進行的28天長期治療甚至與用確立的腸降血糖素療法毒蜥外泌肽-4治療相比時也顯示出增強的治療特性，毒蜥外泌肽-4為T2D療法中廣泛使用的非常確實的GLP-1擬似物。此外，利用脂肪酸類似物pGlu(Lys⁸GluPAL)愛帕琳-13-酰胺進行的28天長期治療與長效作用的GLP-1激動劑、利拉魯肽進行的治療相比顯示出相似的甚至增強的治療特性。

利拉魯肽、(Lys⁸GluPAL)愛帕琳-13-酰胺和pGlu(Lys⁸GluPAL)愛帕琳-13-酰胺均顯著降低血漿甘油三酯水平，其中pGlu(Lys⁸GluPAL)愛帕琳-13-酰胺表現(xiàn)為最有效的。pGlu(Lys⁸GluPAL)愛帕琳-13-酰胺為經(jīng)測試可顯著降低血漿中的總膽固醇水平的唯一的肽(圖34)。與高脂肪飼喂的對照相比，(Lys⁸GluPAL)愛帕琳-13-酰胺和pGlu(Lys8GluPAL)愛帕琳-13-酰胺均顯著降低了LDL-膽固醇水平，與飼喂正常飲食的瘦型對照小鼠相似。與瘦型對照和高脂肪飼喂的小鼠相比，(Lys⁸GluPAL)愛帕琳-13-酰胺和pGlu(Lys8GluPAL)愛帕琳-13-酰胺也均顯著增加了HDL-膽固醇水平。

參考文獻

Boucher J，Masri B，Daviaud D，Gesta S，Guigne C，Mazzucotelli A，Castan-Laurell I，Tack I，Knibiehler B，Carpene C，Audigier Y，Saulnier-Blache JS&Valet P(2005)Apelin，a newly identified adipokine up-regulated by insulin and obesity.Endocrinology 146 1764-71.

Castan-Laurell I，Vitkova M，Daviaud D，Dray C，Kovacikova M，Kovacova Z，Hejnova J，Stich V&Valet P 2008 Effect of hypocaloric diet-induced weight loss in obese women on plasma apelin and adipose tissue expression of apelin and APJ.European Journal of Endocrinology 158 905-10.

Cheng B，Chen J，Bai B&Xin Q 2012 Neuroprotection of apelin and its signalling pathway.Peptides 37 171-173.

Chun HJ，Ali ZA，Kojima Y，Kundu RK，Sheikh AY，Agrawal R，Zheng L，Leeper NJ，Pearl NE，Patterson AJ，Anderson JP，Tsao PS，Lenardo MJ，Ashley EA&Quertermous T 2008 Apelin signalling antagonizes Ang II effects in mouse models of atherosclerosis.Journal of Clinical Investigation 118 3343-3354.

Dray C，Knauf C，Daviaud D，Waget A，Boucher J，Buléon M，Cani PD，Attané C，Guigné C，Carpéné C，Burcelin R，Castan-Laurell I&Valet P 2008 Apelin stimulates glucose utilization in normal and obese insulin-resistant mice.Cell Metabolism 8 437-45.

El Messari S，Iturrioz X，F(xiàn)assot C，De Mota N，Roesch D&Llorens-Cortes C 2004 Functional dissociation of apelin receptor signaling and endocytosis：implications for the effects of apelin on arterial blood pressure.Journal of Neurochemistry 90 1290-301.

Gault VA，McClean PL，Cassidy RS，Irwin N&Flatt PR 2007 Chemical gastric inhibitory polypeptide receptor antagonism protects against obesity，insulin resistance，glucose intolerance and associated disturbances in mice fed high-fat and cafeteria diets.Diabetologia 50 1752-1762.

Higuchi K，Masaki T，Gotoh K，Chiba S，Katsuragil，Tanaka K，Kakuma T&Yoshimatsu H 2007 Apelin，an APJ receptor ligand，regulates body adiposity and favours the messenger ribonucleic acid expression of uncoupling proteins in mice.Endocrinology 148 2690-7.

Kidoya H&Takakura N 2012 Biology of the apelin-APJ axis in vascular formation.Journal of Biochemistry 152 125-131.

Kawamata Y，Habata Y，F(xiàn)ukusumi S，Hosoya M，F(xiàn)ujii R，Himuma S，Nishizawa N，Kitada C，Onda H，Nishimura O&Fujino M 2001 Molecular properties of apelin：tissue distribution and receptor binding.Biochimica et Biophysica Acta 23 162-71.

Lee DK，Saldivia VR，Nguyen T，Cheng R，George SR&O′Dowd BF 2005 Modification of the terminal residue of apelin-13 antagonizes its hypotensive action.Endocrinology 146 231-236.

Liu QF，Yu HW，You L，Liu MX，Li KY&Tao GZ 2013 Apelin-13-induced proliferation and migration induced of rat vascular smooth muscle cells is mediated by the upregulation of Egr-1.Boichemical and Biophysical Research Communications doi：10.1016/j.bbrc.2013.08.051

Mitra A，Katovich，MJ，Mecca A，Rowland NE 2006 Effects of central and peripheral injections of apelin on fluid intake and cardiovascular parameters in rats.Physiology&Behaviour 89 221-225.

O′Shea M，Hansen MJ，Tatemoto K&Morris MJ 2003 Inhibitory effect of apelin-12 on nocturnal food intake in the rat.Nutritional Neuroscience 3 163-7

Pitkin SL，Maguire JJ，Bonner TI&Davenport AP 2010 International Union of Basic and Clinical Pharmacology.LXXIV.Apelin receptor nomenclature，distribution，pharmacology，and function.Pharmacological Reviews 62 331-42.

Quazi R，Palaniswamy C&Frishman WH 2009 The emerging role of apelin in cardiovascular disease and health.Cardiology Reviews.17 283-286.

C，Nitert MD，Bennet H，F(xiàn)ex M，Valet P，Rehfeld JF，F(xiàn)riis-Hansen L&Wierup N 2010 Apelin is a novel islet peptide.Regulatory Peptides 162 44-51.

Winzell M，Magnusson C&Ahren B 2005 The APJ receptor is expressed in pancreatic islets and its ligand，apelin，inhibits insulin secretion in mice.Regulatory Peptides 131 12-17.

Sunter D，Hewson AK&Dickson SL 2003 Intracerebroventricular injection of apelin-13 reduces food intake in the rat.Neuroscience Letters 353 1-4.

Tatemoto K，Hosoya M，Habata Y，F(xiàn)ujii R，Kakegawa T，Zou MX，Kawamata Y，F(xiàn)ukusumi S，Hinuma S，Kitada C，Kurokawa T，Onda H&Fujino M 1998 Isolation and characterization of a novel endogenous peptide ligand for the human APJ receptor.Biochemical and Biophysical Research Communications 251 471-6.

Valle A，Hoggard N，Adams AC，Roca P&Speakman JR 2008 Chronic central administration of apelin-13 over 10 days increases food intake，body weight，locomotor activity and body temperature in C57BL/6mice.Journal of Neuroendocrinology 20 9-84.

Vickers C，Hales P，Kaushik V，Dick L，Gavin J，Tang J，Godbout K，Parsons T，Baronas E，Hsieh F，Acton S，Patane M，Nichols A&Tummino P 2002Hydrolysis of biological peptides by human angiotensin-converting enzyme-related carboxypeptidase.The Journal of Biological Chemistry 277 14838-43.

Xu S，Han P，Huang M，Wu JC，Chang C，Tsao PS&Yue P 2010In vivo，ex vivo，and in vitro studies on apelin′s effect on myocardial glucose uptake.Peptides 37 320-6.

Yue P，Jin H，Aillaud M，Deng AC，Azuma J，Asagami T，Kundu RK，Reaven GM，Quertermous T&Tsao PS 2010Apelin is necessary for the maintenance of insulin sensitivity.American Joumal of Physiology，Endocrinology and Metabolism 298 59-6.

Zhu S，Sun F，Li W，Cao Y，Wang C，Wang Y，Liang D，Zhang R，Zhang S，Wang H，Cao F 2011 Apelin stimulates glucose uptake through the PI3K/Akt pathway and improves insulin resistance in 3T3-L1 adipocytes.Molecular and Cellular Biochemistry 353 303-313.

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