本發(fā)明涉及一種培養(yǎng)發(fā)酵制品的微生物，特別是涉及一種新的天貝生產(chǎn)菌株及利用該菌株在大豆發(fā)酵生產(chǎn)天貝方面的應(yīng)用。

背景技術(shù)：
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天貝(Tempeh)又稱為丹貝、天培，是通過對(duì)蒸煮的大豆進(jìn)一步發(fā)酵而形成的豆制品。

發(fā)酵優(yōu)良的天貝，風(fēng)味口感佳、營養(yǎng)價(jià)值高、富含高活性的異黃酮苷元、多種游離氨基酸、不飽和脂肪酸、B族維生素、生育酚和抗氧化劑超氧化物歧化酶(SOD)等營養(yǎng)物質(zhì)；研究表明，這些物質(zhì)對(duì)于防治肥胖、糖尿病、高血脂、高血壓和心腦血管病均有明顯的作用。由于天貝具備上述優(yōu)點(diǎn)，且其制作方法簡易、生產(chǎn)成本低等，使其在歐美等發(fā)達(dá)國家廣泛發(fā)展并深受喜愛。

我國是大豆生產(chǎn)和消費(fèi)大國，但是目前市場上主要是豆?jié){、豆腐和豆粉等大豆初加工產(chǎn)品，而高營養(yǎng)價(jià)值、高附加值的天貝產(chǎn)品并未實(shí)現(xiàn)市場化銷售。

天貝發(fā)酵過程所依賴的發(fā)酵菌株是霉菌，其中最常見的是少孢根霉菌(Rhizopous oligosporus)。但用少孢根霉菌發(fā)酵生產(chǎn)天貝所需時(shí)間較長，通常約需要48小時(shí)。

目前真正可用于產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)天貝產(chǎn)品的發(fā)酵菌株卻非常匱乏。因此，發(fā)現(xiàn)高活性的天貝發(fā)酵菌株，進(jìn)行最佳發(fā)酵條件的摸索，提供優(yōu)良的天貝制作工藝，得到高質(zhì)量(如外觀、質(zhì)地、氣味及口感風(fēng)味)的天貝產(chǎn)品，很有意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
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本發(fā)明的目的是提供一種新的高活性天貝生產(chǎn)菌株。

本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種利用該新菌株生產(chǎn)天貝產(chǎn)品的方法。

發(fā)明人從一種“干豆豉”中分離到了一種真菌，經(jīng)鑒定為無接合孢子根霉菌(R.azygosporus)LT0229，該菌株屬于根霉屬真菌，已于2016年3月1日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為CGMCC No.12164，以下簡述為LT0229。

LT0229的形態(tài)特征為：

無接合孢子根霉LT0229在PDA綜合培養(yǎng)基上會(huì)長出白色桿狀菌體和白色菌絲體，隨后，菌絲體上長出褐色孢子囊，囊柄基部帶有匍匐枝和假根狀分枝，孢子囊壁破裂后會(huì)散 落出圓形或橢圓形的灰黑色孢子。菌體生長形態(tài)見圖1所示。

提取LT0229的基因組，以NS1(GTAGTCATATGCTTGTCTC)和NS8(TCCGCAGGTTCACCTACGGA)為引物，擴(kuò)增18S rDNA的序列，該18S rDNA序列如序列表所示。通過NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行Blast序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)LT0229與無接合孢子根霉(Rhizopus azygosporus)CBS357.93的相似度最高，相似度為100％。從NCBI數(shù)據(jù)庫中選取了與LT0229相似度≧99％的前17種菌株進(jìn)行了系統(tǒng)進(jìn)化樹分析，結(jié)果如圖2所示。該結(jié)果顯示LT0229與無接合孢子根霉菌(R.azygosporus)CBS357.93的進(jìn)化距離非常近，處于同一分支中，故初步鑒定LT0229為無接合孢子根霉(R.azygosporus)。

結(jié)合菌株培養(yǎng)特征觀察及18S rDNA的鑒定結(jié)果，參照《根霉菌鑒定手冊(cè)》初步鑒定為無接合孢子根霉。

LT0229的培養(yǎng)方式為：在PDA綜合培養(yǎng)基上、25-30℃靜置，或者在PDB綜合培養(yǎng)液中25-30℃震蕩培養(yǎng)3-7天。

經(jīng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)：LT0229生產(chǎn)繁殖速度快，可以在短時(shí)間內(nèi)(35h)生產(chǎn)出天貝產(chǎn)品。極大地節(jié)約了生產(chǎn)時(shí)間和能耗。

本發(fā)明通過對(duì)各種發(fā)酵條件的摸索，如研究適宜的發(fā)酵溫度、pH和發(fā)酵時(shí)間等，得到了利用LT0229生產(chǎn)天貝的工藝方法，其步驟如下：

大豆原料精選→清洗→浸泡→去皮→蒸煮→加淀粉→瀝水→加白醋→接菌→裝袋→扎孔→發(fā)酵→殺菌。

所述無接合孢子根霉LT0229的接種量無特別限制，一般為10⁵～10⁷個(gè)孢子/mL篩選培養(yǎng)基。

本發(fā)明固體發(fā)酵所用的原料為精選大豆，發(fā)酵溫度為25～30℃，優(yōu)選最適溫度為28～30℃。

本發(fā)明所用pH為4-5，優(yōu)選pH4.5。

所述天貝制備方式為：靜置培養(yǎng)32～48h，優(yōu)選35h。

由無接合孢子根霉LT0229發(fā)酵產(chǎn)生的發(fā)酵制品也屬于本專利的保護(hù)范圍，所述發(fā)酵制品可以是發(fā)酵產(chǎn)品本身，也可以是以發(fā)酵產(chǎn)品為原料的深加工產(chǎn)品或從發(fā)酵產(chǎn)品中分離提取的營養(yǎng)成分。

天貝制備工藝研究證實(shí)，無接合孢子根霉菌(R.azygosporus)LT0229發(fā)酵生產(chǎn)天貝的周期短，所得發(fā)酵制品的品質(zhì)優(yōu)良：大豆接種該無接合孢子根霉菌35小時(shí)后便在大豆表面和內(nèi)部形成均勻白色的菌絲粘膜，所得天貝制品具有發(fā)酵醬香味，無氨味，該天貝制品可鮮食、涼拌、作為佐菜烹飪或者進(jìn)一步加工成休閑食品和分離提取功能成分(圖3)。

本發(fā)明的無接合孢子根霉菌LT0229的優(yōu)點(diǎn)如下：

1、發(fā)酵周期短，35小時(shí)即可發(fā)酵生產(chǎn)天貝，少于市場少孢根霉菌發(fā)酵生產(chǎn)天貝所需的48小時(shí)。

2、發(fā)酵所得天貝品質(zhì)好，具有發(fā)酵醬香味，沒有氨臭味；少孢根霉等天貝菌株由于發(fā)酵時(shí)間較長，容易產(chǎn)生孢子，使得產(chǎn)品出現(xiàn)黑斑，進(jìn)而影響品質(zhì)。

因此，無接合孢子根霉LT0229是理想的天貝制作菌株，并具有產(chǎn)業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)能力，且在食品、保健品和醫(yī)藥治療等領(lǐng)域均具有廣闊的市場前景。

附圖說明：

圖1為無接合孢子根霉(R.azygosporus)LT0229的菌體形態(tài)的光學(xué)顯微鏡圖；

圖2為無接合孢子根霉(R.azygosporus)LT0229的系統(tǒng)進(jìn)化樹圖；

圖3為無接合孢子根霉(R.azygosporus)LT0229對(duì)大豆進(jìn)行發(fā)酵后的天貝制品形態(tài)圖。生物材料保藏信息：

名稱：無接合孢子根霉(Rhizopus azygosporus)LT0229

保藏編號(hào)：CGMCC No.12164

保藏單位：中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心

保藏時(shí)間：2016年3月1日

保藏地點(diǎn)：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)。

具體實(shí)施方式

以下實(shí)施例僅用于舉例說明本發(fā)明的方法，并不限制本發(fā)明的范圍。

實(shí)施例1無接合孢子根霉(Rhizopus azygosporus)LT0229的分離篩選

通過對(duì)孢囊柄特征和適宜生長的溫度范圍將天貝發(fā)酵菌株分離出來，分離樣品來自湖南株洲國強(qiáng)湘菜特制加工廠生產(chǎn)的“干豆豉”中。取5g干豆豉溶于20ml無菌水中，加入玻璃珠于30℃搖床振搖30min，取1ml上清液并接種至20ml PDB液體培養(yǎng)基中，在30℃、180rpm下，振蕩培養(yǎng)至有菌絲球生成，挑取菌絲球至另一盛有20ml新鮮PDB培養(yǎng)基的三角瓶中培養(yǎng)5天，取富集后的菌體做一系列的梯度稀釋，取稀釋濃度為1.0×10⁷CFU/mL的菌液涂布PDA平板，倒置30℃恒溫培養(yǎng)，分離能夠旺盛生長的菌株。用接種環(huán)從PDA平板挑取少量該菌株的孢子，繼續(xù)在PDA平板上傳代培養(yǎng)2-3次。用接種環(huán)將得到的純菌種接種到PDA斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

實(shí)施例2無接合孢子根霉(Rhizopus azygosporus)LT0229的菌種鑒定

對(duì)純化出的菌株的表型特征、培養(yǎng)特征和18S rDNA進(jìn)行系統(tǒng)鑒定，結(jié)果如下：

培養(yǎng)特征及表型觀察：

將分離純化后的菌株接種到PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)，隨時(shí)觀察菌體生長狀態(tài)。在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)1天便可長出白色菌絲體，隨后菌絲體上開始長出褐色孢子囊，囊柄基部帶有匍匐枝和假根狀分枝，隨后孢子囊壁開始破裂，散落出圓形或橢圓形的灰黑色孢子。菌體生長過程的形態(tài)如圖1所示。

鑒定結(jié)果：

提取LT0229的基因組，以NS1(GTAGTCATATGCTTGTCTC)和NS8(TCCGCAGGTTCACCTACGGA)為引物，PCR擴(kuò)增獲得18S rDNA序列，測序結(jié)果如序列表所示。通過NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行Blast序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)LT0229與無接合孢子根霉(R.azygosporus)CBS357.93的相似度最高，相似度為100％。從NCBI數(shù)據(jù)庫中選取了與LT0229相似度≧99％的前17種菌株進(jìn)行了系統(tǒng)進(jìn)化樹分析，結(jié)果如圖2所示。該結(jié)果顯示LT0229與無接合孢子根霉菌(Rhizopus azygosporus)CBS357.93的進(jìn)化距離最近，確實(shí)處于同一分支中，故初步鑒定LT0229為無接合孢子根霉(R.azygosporus)。

根據(jù)菌株培養(yǎng)特性、形態(tài)觀察及18S rDNA的鑒定結(jié)果，參照《根霉菌鑒定手冊(cè)》初步鑒定為無接合孢子根霉。

實(shí)施例3無接合孢子根霉(R.azygosporus)LT0229發(fā)酵生產(chǎn)天貝的制備工藝

1、孢子懸液制備

用接種鏟從PDA平板上刮取新鮮的無接合孢子根霉LT0229的菌絲體到20mL液體培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)1天，將菌絲體轉(zhuǎn)接入大瓶PDB液體培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)3-5天，離心收集菌體，生理鹽水或無菌水清洗三次，重懸菌體制成1.0×10⁷CFU/mL的孢子懸液，用于固體發(fā)酵。

2、豆子預(yù)處理

2.1、浸泡：器具洗凈，用沸水燙過后放涼。取精選大豆500克，洗凈后加清水浸泡，用乳酸或者檸檬酸調(diào)節(jié)pH為4.5，浸泡約16小時(shí)，待豆子充分吸水。

2.2、去皮：將浸泡好的豆子手抓去掉豆皮，以得到脫皮的豆瓣；

2.3、水煮：將去皮的豆瓣放入清水中蒸煮15分鐘至變軟，蒸煮時(shí)間應(yīng)控制得當(dāng)，軟度合適的豆瓣才能保證發(fā)酵菌株的快速繁殖，但又要有足夠的強(qiáng)度使之在后續(xù)的加工過程中保持完整；

2.4、添加淀粉：將煮好的豆子撈出趁熱拌入20克玉米淀粉，攪拌均勻；

2.5、瀝水：將混勻的豆子倒入漏筐或簾子上瀝水；

2.6、添加白醋：將白醋加入控干的豆子里，攪拌均勻；

2.7、發(fā)酵過程：加入前期準(zhǔn)備的LT0229的孢子懸液，接種量為1％，攪拌均勻后裝入5號(hào)塑封袋后置于30℃進(jìn)行發(fā)酵，濕度設(shè)定在75～85％。發(fā)酵過程應(yīng)注意控制好氧氣含量。嚴(yán)格厭氧條件下的霉菌生長不良，甚至不生長，而氧氣過多又會(huì)導(dǎo)致霉菌產(chǎn)生孢子影響產(chǎn)品感官。只有氧氣平衡時(shí)霉菌才能形成緊密的乳白色狀菌絲，并縛在豆子上形成一個(gè)堅(jiān)硬的糕狀物。因此，發(fā)酵過程需要在帶有小孔的塑封袋中進(jìn)行(每個(gè)小孔間隔大約1厘米)，這可以使霉菌生長良好而無孢子產(chǎn)生(雖然在袋子上的小孔處有時(shí)會(huì)發(fā)現(xiàn)微小的黑色區(qū)域)。由于薄膜的透明性，因此通過視覺觀測就可以實(shí)現(xiàn)對(duì)霉菌生長的控制。35小時(shí)后發(fā)酵成熟，成品見圖3所示。