任何在先申請(qǐng)及在所述申請(qǐng)中或在其審查期間引用的所有文件(“申請(qǐng)引用的文件”)和在申請(qǐng)引用的文件中引用的或參考的所有文件、和本文引用的或參考的所有文件(“本文引用的文件”)、和本文引用的文件中引用的或參考的所有文件、以及本文或通過(guò)引用而結(jié)合于本文的任何文件中提及的任何產(chǎn)品的任何廠商說(shuō)明書、指南、產(chǎn)品說(shuō)明書和產(chǎn)品圖表，特此通過(guò)引用結(jié)合于本文中，并可用于本發(fā)明的實(shí)施。發(fā)明背景1.
技術(shù)領(lǐng)域：
與本發(fā)明有關(guān)的某些技術(shù)定義包括“無(wú)芽孢形成型細(xì)菌”，該已知的術(shù)語(yǔ)用于不能形成細(xì)菌芽孢并且可通過(guò)熱處理、冷凍厭氧貯藏、抗菌物質(zhì)和其他本領(lǐng)域已知的方法單獨(dú)或聯(lián)合使用而消滅或控制的病原性細(xì)菌和酸敗細(xì)菌。另一個(gè)相關(guān)術(shù)語(yǔ)是“芽孢形成型細(xì)菌”，其包括能形成被稱為細(xì)菌芽孢(也被稱為內(nèi)生孢子)這一極具抗性結(jié)構(gòu)的病原性細(xì)菌和酸敗細(xì)菌，所述芽孢不一定能被本領(lǐng)域已知的用于控制無(wú)芽孢形成型細(xì)菌的常規(guī)方法消滅或控制，需要采用特定的處理來(lái)對(duì)其進(jìn)行抑制和/或滅活。另外，兩種類型的細(xì)菌均可在自然界以“營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)”(也被稱為活力細(xì)胞)存在；但是芽孢形成型細(xì)菌還可作為對(duì)化學(xué)和物理滅活處理更有抗性的“芽孢狀態(tài)”存在。在食品
技術(shù)領(lǐng)域：
，芽孢形成型細(xì)菌有其他的細(xì)菌狀態(tài)，所述狀態(tài)通過(guò)使用熱(稱為“熱激芽孢”)和/或壓力(稱為“壓激芽孢”)而人工創(chuàng)造。產(chǎn)生于食品工業(yè)的人造狀態(tài)導(dǎo)致了芽孢對(duì)化學(xué)和物理手段的滅活具有更高的抗性，并且在一些食品體系中需要受到控制從而抑制其萌發(fā)成芽孢形成型細(xì)菌的營(yíng)養(yǎng)形式和隨后帶來(lái)的食品酸敗和/或毒素產(chǎn)生。本發(fā)明涉及食品和藥品領(lǐng)域。具體而言，本發(fā)明涉及通過(guò)使用天然存在于鱷梨(Perseaamericana)的化學(xué)化合物來(lái)抑制革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌的營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞、芽孢萌發(fā)和生長(zhǎng)的方法。本發(fā)明還涉及到醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。具體而言，本發(fā)明涉及通過(guò)使用特異性針對(duì)病原性芽孢形成型細(xì)菌的抗菌提取物來(lái)抑制人或非人脊椎動(dòng)物的體內(nèi)(包括胃腸道內(nèi))該類型細(xì)菌生長(zhǎng)的方法。在食品加工學(xué)科中眾所周知的是，pH值>4.6的食品(在食品工業(yè)中一般被認(rèn)為是低酸食品)可發(fā)生芽孢形成型細(xì)菌的萌發(fā)和生長(zhǎng)。能夠抑制病原性芽孢形成型微生物(例如肉毒梭菌(Clostridiumbotulinum)、產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridiumperfringens)和蠟狀芽孢桿菌(Bacilluscereus)等)的芽孢萌發(fā)和營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)的食品添加劑的使用在食品工業(yè)中具有特殊的意義。在適當(dāng)?shù)氖称翻h(huán)境下，例如封閉的容器或產(chǎn)生于食品基質(zhì)中的厭氧條件下，這些病原性微生物的芽孢可萌發(fā)和生長(zhǎng)成有害數(shù)量的細(xì)菌細(xì)胞，在某些情況下會(huì)產(chǎn)生毒素危害人類健康。特別地，肉毒梭菌的蛋白水解和非蛋白水解性菌株因其細(xì)菌芽孢可能在食品中萌發(fā)和產(chǎn)生有效的神經(jīng)毒素而在食品工業(yè)中受到較大關(guān)注。亞硝酸鹽是食品工業(yè)中最常用的食品添加劑用于在冷凍低酸食品中延緩/抑制芽孢形成型病原性細(xì)菌生長(zhǎng)。然而，存在消費(fèi)者和行業(yè)長(zhǎng)期的關(guān)注以減少人工合成的食品添加劑的使用，尤其是亞硝酸鹽化合物。用于相同目的的其他食品添加劑包括乳酸鏈球菌肽(Rayman,1981)、重組肽(Tang等，2008)、5-氨基水楊酸鹽(Lin和Pimentel，2001)和月桂酰精氨酸乙酯(Beltran等，2011)。此外，已經(jīng)有在先專利和文章涉及到針對(duì)細(xì)菌營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞起作用的天然抗菌化合物。已經(jīng)報(bào)道許多自然資源含有主要是親脂性的抗菌化合物，但也有一些親水性化合物表現(xiàn)出活性。此類抗菌化合物的報(bào)道可以在文獻(xiàn)中查到。本發(fā)明還涉及重要的公眾健康問(wèn)題，即病原性物種(特別是革蘭氏陽(yáng)性單核細(xì)胞增多性李斯特菌(Listeriamonocytogenes))在商業(yè)冷藏溫度下生長(zhǎng)的能力，加工過(guò)的食品在最終消費(fèi)前通常在該溫度下儲(chǔ)藏。單核細(xì)胞增多性李斯特菌是一種無(wú)芽孢形成型病原性細(xì)菌，該細(xì)菌特別與速食肉類和乳制品有關(guān)，因?yàn)榇祟愂称吩谙M(fèi)者食用前經(jīng)常沒有經(jīng)過(guò)加熱處理。本領(lǐng)域熟知，被單核細(xì)胞增多性李斯特菌污染過(guò)的食品在食用后會(huì)增加感染的風(fēng)險(xiǎn)，特別是在嬰兒、老年人、孕婦和任何缺乏免疫力的個(gè)體中。對(duì)本發(fā)明來(lái)說(shuō)，殺芽孢劑為有能力殺死至少一些類型的細(xì)菌芽孢的物質(zhì)，而抑芽孢劑為有能力抑制至少一些類型的細(xì)菌芽孢的生長(zhǎng)和繁殖的物質(zhì)。芽孢萌發(fā)抑制劑包括殺芽孢劑和抑芽孢劑兩種。另外，除非另外指明，對(duì)下文所述的化合物的說(shuō)明意旨包含其所有的立體異構(gòu)形式，包括化合物的(R)和(S)形式和順式(Z)和反式(E)形式。對(duì)本發(fā)明來(lái)說(shuō)，反式(E)形式包括具有式-CH＝CH2的末端烯烴(參見下文的例子，(2R,16E)-1-乙酰氧基-2-羥基-4-氧代-十九-16,18-二烯。2.相關(guān)技術(shù)描述1951年Jensen(美國(guó)專利2,550,254)從鱷梨(Perseagratissima)種子中獲得丙酮提取物，該提取物對(duì)金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、灰綠曲霉(Aspergillusglaucus)、點(diǎn)青霉(Penicilliumnotatum)和Achromobacterperolens的營(yíng)養(yǎng)型細(xì)胞有抗菌活性。發(fā)現(xiàn)該提取物對(duì)大腸桿菌、熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)和Penicilliuncamemberti無(wú)活性。1953年同一作者(加拿大專利494,110)提到鱷梨(Perseaamericana)種子作為可用于得到具有抗菌活性的提取物另一天然的來(lái)源。Valeri和Gimeno(1954)用石油醚提取鱷梨種子并報(bào)道得到的蠟狀粗制品抑制化膿微球菌(Micrococcuspyogenes)和藤黃八疊球菌(Sarcinalutea)的生長(zhǎng)，但不抑制枯草芽孢桿菌或大腸桿菌的生長(zhǎng)?，F(xiàn)有技術(shù)表明鱷梨種子包含抗菌化合物，但提取物對(duì)具體微生物的特異性生物活性明顯依賴于提取方法，該提取方法最終影響提取物的化學(xué)組成。在相關(guān)技術(shù)中，已經(jīng)從鱷梨種子提取物中分離得到了一些化合物，并檢測(cè)了其抑制某些微生物(細(xì)菌、酵母和真菌)的生長(zhǎng)。Kashman等(1969)從鱷梨果實(shí)和種子的己烷提取物中分離得到了八種化合物并闡明了其結(jié)構(gòu)，并且制備了其大量的衍生物，其中種子比果實(shí)能獲得更高的產(chǎn)率。Kashman(1969)展示的所有化合物屬于同一類長(zhǎng)鏈脂肪族化合物，其一端不飽和，另一端高度氧化。有趣的是，作者將這些化合物按對(duì)分開，區(qū)別僅在于鏈末端有雙鍵或三鍵。這些化合物的分離是為了進(jìn)行化學(xué)表征，而不是為了獲得生物活性成分(非生物活性導(dǎo)向的分離)。之后進(jìn)行了另外的研究用于評(píng)估這些化合物對(duì)枯草芽孢桿菌、蠟狀芽孢桿菌、傷寒沙門氏菌(Salmonellatyphi)、痢疾志賀氏菌(Shigelladysenteriae)、金黃色葡萄球菌、白假絲酵母(Candidaalbicans)、釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)(ATCC7752和S288C)的抗菌活性(Néeman等，1970)。在用0.05mg化合物進(jìn)行圓盤抑制抗菌測(cè)試中，經(jīng)測(cè)試的十二種長(zhǎng)鏈脂肪族化合物中僅有六種證實(shí)了針對(duì)一些微生物具有抑制作用，但只有1,2,4-三羥基-n-十七-16-烯有能力抑制包括在其研究中的所有微生物生長(zhǎng)。作者得出結(jié)論，當(dāng)化合物氧化部分上的羥基全部或部分被乙?；瘯r(shí)，抗菌活性被極大地削弱(Néeman等1970)。因此，作為上述長(zhǎng)鏈脂肪族化合物的乙酰化形式的acetogenins不能抑制先前提到的微生物的生長(zhǎng)。Baratta等(1998年)最近進(jìn)行研究評(píng)估植物精油提取物的抗菌和抗氧化性質(zhì)，所述植物包括樟科的月桂(Laurusnobilis)，但不包括鱷梨屬。近期，Ugbogu和Akukwe(2009)報(bào)道了PerseagratissimaGaerthF及其他植物種子油對(duì)無(wú)芽孢形成型細(xì)菌的臨床隔離物的抗菌效果，所述細(xì)菌包括大腸桿菌、奇異變形菌(Proteusmirabilis)、銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermis)。作者報(bào)道了鱷梨種子油在治療傷口方面的潛在用途。Chia和Dykes(2010)也從鱷梨(PerseaAmericanaMill.)Hass,Shepard和Fuerte變種的外果皮和種子中制備了乙醇提取物。他們報(bào)道了提取物在104.2-416.7μg/ml濃度下表現(xiàn)出了對(duì)革蘭氏陽(yáng)性和革蘭氏陰性細(xì)菌營(yíng)養(yǎng)型細(xì)胞生長(zhǎng)的抗菌活性；作者還制備了僅抑制單核細(xì)胞增多性李斯特菌(93.8-375μg/ml)和表皮葡萄球菌(354.2μg/ml)生長(zhǎng)的水提取物。沒有評(píng)估乙醇或水提取物對(duì)梭菌或芽孢桿菌屬的活性。Rodríguez-Carpena等(2011)在試圖分離抗菌活性分子的時(shí)候使用三種不同的溶劑(包括乙酸乙酯、丙酮(70％)和甲醇(70％))，從兩種鱷梨栽培種(PerseaAmericanaMill.)的果皮、果肉和種子中制備了提取物。作者檢測(cè)了提取物對(duì)一組來(lái)自無(wú)芽孢形成型細(xì)菌和芽孢形成型細(xì)菌的營(yíng)養(yǎng)型細(xì)胞的抗菌性質(zhì)，得出它們的抗菌活性為中等以及原因在于其提取物中存在酚類化合物的結(jié)論。因此，以上引用的研究并不能成功地完成對(duì)可能造成所觀察到的生物活性(針對(duì)測(cè)試的細(xì)菌芽孢、熱激芽孢或壓激芽孢)原因的成分的分離或化學(xué)鑒定。類似地，其他作者已經(jīng)測(cè)試了鱷梨植物對(duì)非細(xì)菌微生物的抗微生物性質(zhì)。Prusky等(1982)描述了1-乙酰氧基-2-羥基-4-氧代-二十一-12,15-二烯(Persin)存在于未成熟的鱷梨果皮中，并認(rèn)為該分子產(chǎn)生對(duì)盤長(zhǎng)孢狀刺盤孢(Colletotrichumgloeosporioides)(引發(fā)炭疽病的一種真菌，這是在鱷梨果實(shí)貯藏期間面臨的一個(gè)公知的問(wèn)題)的抗微生物活性。該化合物通過(guò)薄層色譜法從用二氯甲烷分配的乙醇提取物中分離。該化合物后來(lái)被稱為“persin”(Oelrichs等，1995)，其他作者證實(shí)該化合物為鱷梨組分，經(jīng)體外測(cè)試證明對(duì)真菌盤長(zhǎng)孢狀刺盤孢營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)具有最高抑制活性(Sivanathan和Adikaram，1989；Domergue等，2000)，還具有抑制真菌孢子萌發(fā)和萌發(fā)管延長(zhǎng)的能力(Prusky等，1991a)。Persin在790μg/ml完全抑制真菌孢子萌發(fā)，成熟期時(shí)該化合物在果皮中的濃度極大地降低(Prusky等，1982)。具有類似結(jié)構(gòu)的單烯，1-乙酰氧基-2,4-二羥基-n-十七-16-烯，也證實(shí)有抗盤長(zhǎng)孢狀刺盤孢的生物活性，但其活性為persin活性的1/3。有趣地是，兩種抗真菌化合物按1:1比例的混合物表現(xiàn)出協(xié)同活性，并且增加了抑制發(fā)芽的分生孢子萌發(fā)管延長(zhǎng)的百分比(Prusky等，1991年b)。其他化合物例如1-乙酰氧基-2-羥基-4-氧代-二十一-5,12,15-三烯(Domergue等，2000)也被證實(shí)有抗真菌的生物活性。最后的這種化合物被稱為“PersenoneA”(Kim等，2000a)，然而所進(jìn)行的分離無(wú)一基于它的生物活性，或者以發(fā)現(xiàn)具有增加的生物活性的新型化合物或混合物為目的。大多數(shù)現(xiàn)有技術(shù)出版物將重點(diǎn)放在發(fā)現(xiàn)分子來(lái)防止收獲后的損害。已經(jīng)報(bào)道的acetogenins的其他生物活性包括殺蟲、抗腫瘤和驅(qū)蟲性質(zhì)。Persin已被表明具有殺蟲活性，在人造飼料中含量為200μg/g或更高時(shí)抑制家蠶幼蟲BombyxmoriL.的幼蟲進(jìn)食(Chang等，1975；Murakoshi等，1976)。最近，Rodriguez-Saona等(1997)證實(shí)了persin對(duì)Spodopteraexigua(一種進(jìn)食廣泛的昆蟲，不以鱷梨為食，卻是許多植物的主要害蟲之一)的作用。在食物中的含量為200μg/g和400μg/g下分別觀察到對(duì)幼蟲生長(zhǎng)和進(jìn)食的抑制作用。Persin還被鑒定為存在于鱷梨葉中的有效成分，其在60-100mg/kg的劑量下能引起鼠分泌乳汁的乳腺壞死，在超過(guò)100mg/kg的劑量下會(huì)發(fā)生鼠心肌纖維壞死，并且在影響嚴(yán)重的動(dòng)物體內(nèi)會(huì)出現(xiàn)胸腔積水(Oelrichs等，1995)。因?yàn)檫@個(gè)效果，該化合物和從鱷梨葉中得到的其他化合物獲得用于治療哺乳動(dòng)物卵巢癌和乳腺癌的專利權(quán)(Seawright等，2000)。以高達(dá)100mg/kg待治療的哺乳動(dòng)物的體重口服給予化合物，但優(yōu)選以20-40mg/kg體重在連續(xù)數(shù)天內(nèi)給藥來(lái)避免先前報(bào)道的毒性作用。先前的研究表明，鱷梨果肉中這些化合物的含量在成熟期時(shí)將極大地降低到小于1500μg/g(Kobiler等，1993)；因此，60千克的人每日需消耗超過(guò)0.8kg的鱷梨果肉才能實(shí)現(xiàn)抗癌效果，甚至更高的濃度才能達(dá)到細(xì)胞毒效應(yīng)。Pollack等報(bào)道(2010)，提議鱷梨用于癌癥治療的年治療劑量是美國(guó)實(shí)際每人年消費(fèi)鱷梨量(1.8千克或4.1英鎊)的160倍。PersenoneA和它的類似物1-乙酰氧基-2-羥基-5-十九烯-4-酮(PersenoneB)，同Persin一起被發(fā)現(xiàn)抑制細(xì)胞培養(yǎng)中過(guò)氧化物(O2-)和氧化一氮(NO)的產(chǎn)生，作者將該活性與在炎癥有關(guān)的器官中作為癌癥化學(xué)抑制劑的治療用途相關(guān)聯(lián)(Kim等，2000a、2000b和2000c)。體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)它們與DHA(二十二碳六烯酸，天然的NO產(chǎn)生抑制劑)相比有相同或更好的活性。Acetogenins的IC50值在1.2-3.5μM范圍內(nèi)，DHA為4.5μM(Kim等，2000a)。另外，1-乙酰氧基-2,4-二羥基-n-十七-16-烯、persin和persenoneA顯示了乙?；o酶A羧化酶(ACC)活性的抑制作用，IC50值范圍為4.0-9.4μM(Hashimura，2001)。作者認(rèn)為，由于ACC參與了脂肪酸的生物合成，因此這些化合物具有用作脂肪積聚抑制物來(lái)避免肥胖的潛在用途。長(zhǎng)鏈脂肪酸衍生物的大多數(shù)提取方法需要回收油的預(yù)步驟，或者使用有機(jī)溶劑例如己烷。Kashman、Neeman和Lifshitz(1969)所使用的用于經(jīng)鑒定的抗菌化合物的提取方法是在沸點(diǎn)溫度利用己烷。Broutin等在2003年(美國(guó)專利6,582,688B1)開發(fā)了一種從鱷梨果實(shí)油中獲得提取物的方法，該油富含某類長(zhǎng)鏈脂肪族化合物，例如呋喃脂質(zhì)化合物和多羥基化脂肪醇)。作者聲稱這些非極性的化合物的不同組合物可用于不同的治療、美容和食品應(yīng)用。然而通過(guò)他們的方法獲得的提取物的化學(xué)組合物或者活性分子的含量并沒有在作為抗菌劑的用途方面被詳細(xì)說(shuō)明。考慮到可能存在于粗提物中的一些化合物的毒性，確定得到設(shè)想效果所需的最小濃度就非常重要(參見美國(guó)專利申請(qǐng)公布2006-0099323和2009-0163590)。即使已經(jīng)證實(shí)了某些acetogenins對(duì)細(xì)菌營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞具有抗菌活性，現(xiàn)有技術(shù)沒有報(bào)道任何針對(duì)微生物(尤其是產(chǎn)芽孢形式的)的從鱷梨(Perseaamericana)中對(duì)抗菌化合物的生物分析導(dǎo)向的分離。本發(fā)明提供一系列方法步驟來(lái)獲得分離的化合物和/或富含天然存在于鱷梨(Perseaamericana)中的抗菌化合物的組合物，所述化合物抑制芽孢形成型細(xì)菌的營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)和芽孢狀態(tài)的生長(zhǎng)?；诋a(chǎn)芽孢微生物抑制對(duì)化合物的分離沒有構(gòu)成現(xiàn)有技術(shù)教導(dǎo)的一部分。更重要的是，部分純化的混合物中特定化合物的協(xié)同作用也是本發(fā)明的一部分。發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)，部分純化的提取物和/或分離化合物的混合物擁有芽孢萌發(fā)抑制性質(zhì)，例如抑芽孢和/或殺芽孢特性，并且在某些情況中甚至具有比單獨(dú)的分離化合物更好的效果。針對(duì)芽孢形成型微生物的活性化合物的化學(xué)特性和特異性先前從未報(bào)道過(guò)，生物活性化合物在商業(yè)應(yīng)用加工條件下的熱穩(wěn)定性或壓力穩(wěn)定性也未報(bào)道過(guò)。Maseko(2006)提出一種簡(jiǎn)易方法來(lái)生產(chǎn)被稱為(2R,4R)-1,2,4-三羥基十七-16-烯的非乙?；舅嵫苌?，該方法使用(S)-蘋果酸作為便宜的三元醇片段來(lái)源，通過(guò)Grignard反應(yīng)來(lái)實(shí)現(xiàn)脂肪鏈的延長(zhǎng)。該前體可用于鱷梨油中大多數(shù)acetogenins的合成。在Maseko(2006)中該分子被制備成分析標(biāo)準(zhǔn)物，在現(xiàn)有技術(shù)中Néeman等(1970)提出該化合物作為針對(duì)葡萄球菌(Staphylococcusspp.)(一種無(wú)芽孢形成型細(xì)菌)的抗菌劑的可能。參考現(xiàn)有技術(shù)中關(guān)于用于冷凍食品中單核細(xì)胞增多性李斯特菌的營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞的特異性控制的抗菌物質(zhì)，美國(guó)專利號(hào)5,217,950提出了乳酸鏈球菌肽組合物作為革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌殺菌劑的用途。美國(guó)專利5,573,797、5,593,800和5,573,801公開了抗菌組合物，該組合物包括鏈球菌(Streptococcus)或片球菌(Pediococcus)來(lái)源的細(xì)菌素或合成的等效抗菌劑與螯合劑的組合。美國(guó)專利號(hào)5,458,876提出抗生物素(例如乳酸鏈球菌肽)與溶菌酶組合作為抗菌劑。在該例子中，溶菌酶降解細(xì)胞壁，削弱靶細(xì)胞的結(jié)構(gòu)完整性，因此抗菌劑更高效地破壞或殺死細(xì)菌細(xì)胞。特別是，該組合被證明有效提高乳酸鏈球菌肽抗單核細(xì)胞增多性李斯特菌的抗菌功效，盡管李斯特菌(Listeria)沒有完全消除，卻明顯減少到安全適當(dāng)?shù)氖褂盟?。美?guó)專利6,620,446B2描述了在食品應(yīng)用中用于控制革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌的抗菌組合物，該組合物可以用作配料或用在食品表面。為了減少或消除革蘭氏陽(yáng)性酸敗或病原性細(xì)菌，最特別地，有害病原體單核細(xì)胞增多性李斯特菌的所有菌株，該組合物包括乳酸鏈球菌肽、和/或溶菌酶和β蛇麻子酸(betahopsacid)。Perumalla和Hettiarachchy(2011)報(bào)道綠茶提取物和葡萄籽提取物(富含多酚和原花色素的化合物)對(duì)大多數(shù)在食品上生長(zhǎng)的病原體，例如單核細(xì)胞增多性李斯特菌、鼠傷寒沙門氏菌(Salmonellatyphimurium)、大腸桿菌O157:H7和空腸彎曲桿菌(Campylobacterjejuni)有抗菌活性。此外，他們已經(jīng)證實(shí)，在多種模型系統(tǒng)中，當(dāng)與有機(jī)酸(蘋果酸、酒石酸、苯甲酸等)、細(xì)菌素(例如乳酸鏈球菌肽)或螯合試劑(例如EDTA)聯(lián)合使用時(shí)，在抗菌活性方面存在協(xié)同作用，所述模型系統(tǒng)包括新鮮產(chǎn)品(水果和蔬菜)、生肉和速食肉類以及禽類產(chǎn)品。考慮到獲得有足夠的抗菌、抗微生物或抑制芽孢萌發(fā)活性的提取物的困難性；細(xì)菌、微生物和芽孢對(duì)已知抗菌、抗微生物、抑制芽孢萌發(fā)的化合物和組合物的抵抗力提高；以及對(duì)天然食品和藥品的需求，在本領(lǐng)域中仍然對(duì)其他抗菌、抗微生物或殺芽孢化合物和組合物存在需要，優(yōu)選所述化合物和組合物獲自經(jīng)濟(jì)適用的來(lái)源，例如植物加工副產(chǎn)品和廢品。發(fā)明概述本發(fā)明涉及用作抗微生物劑、抗菌劑或芽孢萌發(fā)抑制劑的富含acetogenins或其分離分子的鱷梨(Perseaamericana)提取物。該富含acetogenins的提取物表現(xiàn)出芽孢萌發(fā)抑制活性，例如對(duì)天然細(xì)菌芽孢的殺芽孢和/或抑芽孢活性，所述細(xì)菌芽孢來(lái)自肉毒梭菌(蛋白水解性和非蛋白水解性)、艱難梭菌(Clostridiumdifficile)和生孢梭菌(Clostridiumsporogenes)、和芽孢桿菌(Bacillusspp.)及其他病原性和非病原性細(xì)菌。我們還發(fā)現(xiàn)富含acetogenin的提取物或其分離分子還表現(xiàn)出芽孢萌發(fā)抑制活性，例如針對(duì)熱激和/或壓激細(xì)菌芽孢的殺芽孢或抑芽孢活性，因此能用在食品、美容品和藥物組合物中來(lái)抑制其生長(zhǎng)。我們還發(fā)現(xiàn)在冷凍條件下，該富集提取物作為抗微生物劑對(duì)抑制其他無(wú)芽孢形成型革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌(例如單核細(xì)胞增多性李斯特菌)的活力細(xì)胞生長(zhǎng)是有效的。保護(hù)富含acetogenins的提取物在經(jīng)熱處理、壓力處理或通過(guò)其他熱或非熱保存技術(shù)穩(wěn)定化的制劑中的用途也是本發(fā)明的一部分。附圖簡(jiǎn)述圖1:存在于鱷梨種子中的化合物的初步提取圖示，用于評(píng)估所述化合物對(duì)革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌的營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞、天然芽孢和熱激芽孢的抗菌活性。圖2：提取溶劑類型對(duì)鱷梨果核粗提物針對(duì)生孢梭菌(ATCC7955)的營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞、天然芽孢和熱激芽孢生長(zhǎng)的抗菌活性的影響。提取物以12.5μg固體的終含量進(jìn)行測(cè)試。數(shù)據(jù)用三次重復(fù)的平均值±平均值標(biāo)準(zhǔn)誤差來(lái)表示。圖3：振蕩對(duì)用己烷從鱷梨果核提取物中提取抗菌化合物的影響，評(píng)估所述化合物對(duì)生孢梭菌(ATCC7955)營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞、天然芽孢和熱激芽孢生長(zhǎng)的抗菌活性。提取物以12.5μg固體的終含量進(jìn)行測(cè)試。數(shù)據(jù)用三次重復(fù)的平均值±平均值標(biāo)準(zhǔn)誤差來(lái)表示。具有相同字母的數(shù)值表示差異不顯著(LSD檢測(cè)，p<0.05)。圖4：用丙酮或乙醇代替己烷從鱷梨果核中獲得生物活性化合物的提取時(shí)間的效果比較，所述化合物抑制生孢梭菌(ATCC7955)營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)。提取物以12.5μg固體的終含量進(jìn)行測(cè)試。數(shù)據(jù)用三次重復(fù)的平均值±平均值標(biāo)準(zhǔn)誤差來(lái)表示。具有相同字母的數(shù)值表示差異不顯著(LSD檢測(cè)，p<0.05)。圖5：用丙酮或乙醇代替己烷從鱷梨果核中獲得生物活性化合物的提取時(shí)間的效果比較，所述化合物抑制生孢梭菌(ATCC7955)天然芽孢的生長(zhǎng)。提取物以12.5μg固體的終含量進(jìn)行測(cè)試。數(shù)據(jù)用三次重復(fù)的平均值±平均值標(biāo)準(zhǔn)誤差來(lái)表示。具有相同字母的數(shù)值表示差異不顯著(LSD檢測(cè)，p<0.05)。圖6：用丙酮或乙醇代替己烷從鱷梨果核中獲得生物活性化合物的提取時(shí)間的效果比較，所述化合物抑制生孢梭菌(ATCC7955)熱激芽孢的生長(zhǎng)。提取物以12.5μg固體的終含量進(jìn)行測(cè)試。數(shù)據(jù)用三次重復(fù)的平均值±平均值標(biāo)準(zhǔn)誤差來(lái)表示。具有相同字母的數(shù)值表示差異不顯著(LSD檢測(cè)，p<0.05)。圖7：A)該圖表示用丙酮對(duì)存在于鱷梨種子中的化合物進(jìn)行初步提取，隨后在己烷:甲醇體系中對(duì)初步提取物進(jìn)行分配以在各相中分別獲得F001和F002部分，隨后用于評(píng)估它們針對(duì)革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌的營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞、天然芽孢和熱激芽孢的抗菌活性。B)該圖表示用己烷:甲醇體系對(duì)存在于鱷梨種子中的化合物進(jìn)行同步提取和分配，分別獲得F003和F004部分，隨后用于評(píng)估其對(duì)革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌的營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞、天然芽孢和熱激芽孢的抗菌活性。圖8：如圖7中描述獲得的提取物F001-F004對(duì)生孢梭菌(ATCC7955)的營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞、天然芽孢和熱激芽孢生長(zhǎng)的抗菌活性評(píng)估。提取物以12.5μg固體的終含量進(jìn)行測(cè)試。數(shù)據(jù)用三次重復(fù)的平均值±平均值標(biāo)準(zhǔn)誤差來(lái)表示。具有相同字母的數(shù)值表示差異不顯著(LSD檢測(cè)，p<0.05)。圖9：用于如圖7A中描述獲得的下相F002(甲醇)的第二次分配的雙相體系(乙酸乙酯:水)的上相和下相對(duì)生孢梭菌(ATCC7955)的營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞、天然芽孢和熱激芽孢生長(zhǎng)的抗菌活性評(píng)估。提取物以12.5μg固體的終含量進(jìn)行測(cè)試。數(shù)據(jù)用三次重復(fù)的平均值±平均值標(biāo)準(zhǔn)誤差來(lái)表示。具有相同字母的數(shù)值表示差異不顯著(LSD檢測(cè)，p<0.05)。(字母c表示圓盤抑制區(qū)數(shù)值為0cm，因此在圖表上沒有豎條高度)圖10：用于如實(shí)施例1中描述獲得的丙酮粗提物分配的雙相體系(己烷:甲醇)的上相和下相對(duì)生孢梭菌(ATCC7955)的營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞、天然芽孢和熱激芽孢生長(zhǎng)的抗菌活性評(píng)估。提取物以12.5μg固體的終含量進(jìn)行測(cè)試。數(shù)據(jù)用三次重復(fù)的平均值±平均值標(biāo)準(zhǔn)誤差來(lái)表示。具有相同字母的數(shù)值表示差異不顯著(LSD檢測(cè)，p<0.05)。圖11：按實(shí)施例1中描述獲得的丙酮粗提物的未皂化化合物(unsaponifiablescompounds)和從實(shí)施例5中描述的用于丙酮粗提物分配的雙相體系(己烷:甲醇)的上相獲得的未皂化化合物對(duì)生孢梭菌(ATCC7955)的營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞、天然芽孢和熱激芽孢生長(zhǎng)的抗菌活性評(píng)估。提取物以12.5μg固體的終含量進(jìn)行測(cè)試。數(shù)據(jù)用三次重復(fù)的平均值±平均值標(biāo)準(zhǔn)誤差來(lái)表示。具有相同字母的數(shù)值表示差異不顯著(LSD檢測(cè)，p<0.05)。(字母d表示圓盤抑制區(qū)數(shù)值為0cm，因此在圖表上沒有豎條高度)圖12：通過(guò)反相快速離心分配色譜法(RP-FCPC)獲得的流分對(duì)生孢梭菌(ATCC7955)的營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞和熱激芽孢生長(zhǎng)的抗菌活性評(píng)估，所述RP-FCPC對(duì)用于實(shí)施例5中描述的丙酮粗提物分配的雙相體系(庚烷:甲醇)的上相(庚烷)來(lái)進(jìn)行。用于進(jìn)行RP-FCPC的溶劑體系為庚烷:甲醇(1:1)，甲醇用作流動(dòng)相。流分以12.5μg固體的終含量進(jìn)行測(cè)試。圖13：通過(guò)正相快速離心分配色譜法(NP-FCPC)獲得流分對(duì)生孢梭菌(ATCC7955)的營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞、天然芽孢和熱激芽孢生長(zhǎng)的抗菌活性評(píng)估，所述NP-FCPC對(duì)用于實(shí)施例5中描述的丙酮粗提物分配的雙相體系(庚烷:甲醇)的上相(庚烷)來(lái)進(jìn)行。用于進(jìn)行NP-FCPC的溶劑體系為庚烷:甲醇(1:1)，庚烷用作流動(dòng)相。流分以12.5μg固體的終含量進(jìn)行測(cè)試。圖14：通過(guò)正相快速離心分配色譜法(NP-FCPC)獲得的流分對(duì)金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)的抗菌活性評(píng)估，所述NP-FCPC對(duì)用于實(shí)施例5中描述的丙酮粗提物分配的雙相體系(庚烷:甲醇)的上相(庚烷)來(lái)進(jìn)行。用于進(jìn)行NP-FCPC的溶劑體系為庚烷:甲醇(1:1)，庚烷用作流動(dòng)相。流分以12.5μg固體的終含量進(jìn)行測(cè)試。圖15：如實(shí)施例5中描述獲得的己烷和乙酸乙酯上相的溫度(25-100℃/60分鐘)處理對(duì)生孢梭菌(ATCC7955)的營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制活性的影響。圖16：如實(shí)施例5中描述獲得的己烷和乙酸乙酯上相的溫度(25-100℃/60分鐘)處理對(duì)生孢梭菌(ATCC7955)的天然芽孢細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制活性的影響。圖17：實(shí)施例10中描述獲得的活性物集合(activepool)中存在的流分的色譜圖隨其分配系數(shù)(Kd)增加的發(fā)展變化。流分通過(guò)高效液相色譜和二極管陣列檢測(cè)儀在220nm下進(jìn)行分析。編號(hào)表示不同流分的共有峰。圖18：實(shí)施例10中描述的活性流分集合中存在的活性化合物濃度。詳述本發(fā)明提供一系列步驟以從鱷梨(PerseaAmericana)中獲得富含天然抗微生物、抗菌或抑制芽孢萌發(fā)的化合物的提取物，用于提供抗微生物、抗菌或芽孢萌發(fā)抑制作用。本發(fā)明的一方面，提取物來(lái)自鱷梨果實(shí)可食用部分的種子或肉質(zhì)中果皮。本發(fā)明的一方面，對(duì)鱷梨組織(種子或中果皮)的提取通過(guò)極性溶劑或非極性溶劑提取來(lái)實(shí)現(xiàn)。本發(fā)明該方面的一個(gè)實(shí)施方案是一種方法，所述方法從鱷梨屬(包括但不限于americana和gratissima(鱷梨))中制備天然抗微生物、抗菌或抑制芽孢萌發(fā)的化合物濃縮物，用于提供抗微生物、抗菌或芽孢萌發(fā)抑制作用(包括但不限于革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌的營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞和芽孢的生長(zhǎng))，所述方法包括：(a)用極性溶劑對(duì)種子或其他鱷梨植物組織(例如中果皮(干的或肉質(zhì)的)和/或葉)進(jìn)行提??；(b)接著進(jìn)行從鱷梨的極性溶劑提取物中或直接從磨碎的種子或其他鱷梨植物組織中富集acetogenins的純化過(guò)程；或者(a1)用非極性溶劑對(duì)種子或其他鱷梨植物組織(例如中果皮(干的或肉質(zhì)的)和/或葉)進(jìn)行提?。?b1)接著進(jìn)行從鱷梨的非極性溶劑提取物中或直接從磨碎的種子或其他鱷梨植物組織(例如中果皮(干的或肉質(zhì)的)和/或葉)中富集acetogenins的純化過(guò)程。在本發(fā)明該方面的一個(gè)實(shí)施方案中，用于提取或純化的極性溶劑獨(dú)立包括(單獨(dú)或者作為混合物)但不限于C1-C4醇(例如甲醇、乙醇、異丙醇、丁醇)、二甲基亞砜、四氫呋喃、丙酮、乙腈或其混合物。在本發(fā)明該方面的一個(gè)實(shí)施方案中，用于提取或純化的非極性溶劑獨(dú)立包括(單獨(dú)或者作為混合物)但不限于己烷、庚烷、乙醚、乙酸乙酯、石油醚、氯仿、甲苯、甲基叔丁基醚、甲基異丁酮或其混合物。本發(fā)明的另一方面為從極性或非極性溶劑提取物中富集acetogenins的純化方法。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，純化包括兩相分配體系。本發(fā)明的又一實(shí)施方案中，兩相分配體系使用的極性溶劑(一種或作為組合)包括但不限于水、C1-C4醇(例如甲醇、乙醇、異丙醇、丁醇)、二甲基亞砜、四氫呋喃、丙酮、乙腈，和使用的非極性溶劑(一種或作為組合)包括但不限于例如己烷、庚烷、乙醚、乙酸乙酯、石油醚、氯仿、甲苯、甲基叔丁基醚、甲基異丁酮和其混合物。參考例如AlainP.Foucault,L.Chevolot.Counter-currentchromatography:instrumentation,solventselectionandsomerecentapplicationstonaturalproductpurification(逆流色譜法：儀器、溶劑選擇和近期對(duì)天然產(chǎn)物純化的應(yīng)用).J.Chromatogr.A808(1998)3–22.本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，雙相分配體系的溶劑體系包括但不限于單獨(dú)或并行(inparallel)的甲醇:庚烷和/或水:己烷和/或水:丁醇和/或甲基叔丁基醚:乙腈:水、和/或庚烷:乙酸乙酯:乙腈、庚烷:乙酸乙酯:甲醇:水(以不同比率)以富集某一相中的活性物(activity)。純化方法的另一實(shí)施方案為包括快速或高效離心分配色譜法(FCPC或HPCPC)或逆流色譜法(CCC)在內(nèi)的分配分離，以根據(jù)各化合物相應(yīng)的分配系數(shù)為減少和/或消除提取過(guò)程中所得的雜質(zhì)而對(duì)化合物進(jìn)行分離。參考例如AlainP.Foucalt.CentrifugalPartitionChromatography(離心分配色譜法),ChromatographicSciencesSeries,vol.68,Marcel-Dekker(1995)。與在同樣的固體濃度(2.5mg/mL)下評(píng)價(jià)的鱷梨種子的丙酮粗提物相比較，CPC純化方法可增加來(lái)自鱷梨的抑制革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞和芽孢生長(zhǎng)的天然抗菌化合物的濃度(超過(guò)4倍)，以提供至少1.2到2倍或更高的抗菌性質(zhì)。本發(fā)明的另一方面，提取和純化方法任選沒有導(dǎo)致被富集或分離的化合物的皂化。在本發(fā)明該方面的另一實(shí)施方案中，提取和純化過(guò)程任選沒有導(dǎo)致被富集或分離的化合物的皂化。本發(fā)明的提取物包含m/z范圍在329到381內(nèi)的化合物，或者至少下列acetogenins之一：PersenoneA、PersenoneB或近期發(fā)現(xiàn)的(2R,5E,16E)-1-乙酰氧基-2-羥基-4-氧代-十九-5,16-二烯或也是最近發(fā)現(xiàn)的(2R,16E)-1-乙酰氧基-2-羥基-4-氧代-十九-16,18-二烯，所述化合物可從鱷梨(Perseaamericana)中純化或者經(jīng)化學(xué)合成來(lái)富集生物活性。本發(fā)明的另一方面是式(I)化合物其中R1為氫或乙?；?；R2為氫或羥基保護(hù)基；和R3為具有至少兩個(gè)反式(E)構(gòu)型碳-碳雙鍵的烯基。羥基保護(hù)基可以是任何已知的羥基保護(hù)基，例如在Greene和Wuts,ProtectiveGroupsinOrganicSynthesis(ThirdEdition)(有機(jī)合成中的保護(hù)基團(tuán)(第三版)),Wiley-Interscience(1999)中描述的那些基團(tuán)。如上文所述，式(I)化合物包括所有立體異構(gòu)體形式，其包括化合物(R)和(S)形式和順式(Z)和反式(E)形式。對(duì)本發(fā)明來(lái)說(shuō)，反式(E)形式包括具有式-CH＝CH2的末端烯烴(參見例如下述的(2R,16E)-1-乙酰氧基-2-羥基-4-氧代-十九-16,18-二烯)。本發(fā)明該方面的一個(gè)實(shí)施方案是式(I)化合物，其中R1為氫或乙?；?；R2為氫或羥基保護(hù)基；和R3為具有兩個(gè)碳-碳雙鍵反式構(gòu)型的C5-C22烯基。本發(fā)明該方面的另一實(shí)施方案是式(I)化合物，其中R1為氫或乙?；?；R2為氫；和R3為具有兩個(gè)反式構(gòu)型碳-碳雙鍵的C5-C22烯基。本發(fā)明該方面的另一實(shí)施方案是式(I)化合物，其中R1為乙?；籖2為氫；和R3為含有12到18個(gè)碳原子的烯基，該基團(tuán)具有兩個(gè)反式構(gòu)型的碳-碳雙鍵；并且與OR2鍵合的碳呈(R)構(gòu)型。本發(fā)明該方面的另一實(shí)施方案是式(I)化合物，其中該化合物的C-16和C-17位置上有一個(gè)雙鍵。本發(fā)明該方面的另一實(shí)施方案是具有下式的化合物(2R,16E)-1-乙酰氧基-2-羥基-4-氧代-十九-16,18-二烯或(2R,5E,16E)-1-乙酰氧基-2-羥基-4-氧代-十九-5,16-二烯式(I)化合物可通過(guò)使用Bull等(1994)描述的方法合成，該方法通過(guò)使鹵化(例如氯化或溴化)二甲基-1,3-二氧雜環(huán)戊烷-乙基鎂與式R3COX(其中R3如上文所限定，X為鹵化物)的試劑反應(yīng)，隨后由二氧雜環(huán)戊烷環(huán)形成二醇來(lái)進(jìn)行?；蛘?，式(I)化合物可通過(guò)使用MacLeod等(1995)描述的方法合成，該方法通過(guò)獲得不飽和脂肪酸并將其轉(zhuǎn)化為其相應(yīng)的甲酮，然后將該相應(yīng)的甲酮與2-乙酰氧基乙醛反應(yīng)來(lái)進(jìn)行。形成式(I)化合物的方法是例述性的，并不旨在包括制備所述化合物的所有可能的方式。提取物或化合物可單獨(dú)用于或與本領(lǐng)域熟知的其他抗菌物質(zhì)聯(lián)合用于食品或支持細(xì)菌生長(zhǎng)的組合物中以提高對(duì)細(xì)菌的營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)或芽孢狀態(tài)的抗菌活性，所述其他抗菌物質(zhì)包括但不限于亞硝酸鹽化合物、乳酸鏈球菌肽、細(xì)菌素、月桂酰精氨酸乙酯、精油、乙二胺四乙酸(EDTA)和抗壞血酸衍生物、苯甲酸衍生物及其他物質(zhì)。抑制細(xì)菌營(yíng)養(yǎng)形式和芽孢形式生長(zhǎng)的鱷梨提取物或從中獲得的化合物或提取物可與載體、賦形劑、包囊劑和其他配制組分一起配制成固體形式以改進(jìn)生物活性組分的應(yīng)用和穩(wěn)定性。制備本發(fā)明的提取物、化合物和組合物以使它們可通過(guò)口服、經(jīng)皮膚、胃腸外、經(jīng)鼻、經(jīng)眼睛、經(jīng)耳、舌下、經(jīng)直腸或經(jīng)陰道給藥。經(jīng)皮膚給藥包括局部施用或透皮給藥。胃腸外給藥包括靜脈內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)、肌肉內(nèi)和皮下注射，還包括使用輸液技術(shù)。一種或多種本發(fā)明化合物可與一種或多種非毒性藥學(xué)上可接受的成分聯(lián)合構(gòu)成組合物。這些組合物可通過(guò)應(yīng)用本領(lǐng)域已知技術(shù)制備，例如下列文獻(xiàn)中教導(dǎo)的技術(shù)：Remington—TheScienceandPracticeofPharmacy(制藥科學(xué)與實(shí)踐)2005年第21版，Goodman和Gilman的ThePharmacologicalBasisofTherapeutics(治療學(xué)的藥理學(xué)基礎(chǔ))2005年第11版和Ansel的ParmaceuticalDosageFormsandDrugDeliverySystems(藥物劑型和藥物遞送系統(tǒng))2005年第8版Allen等編輯,LippincottWilliams&Wilkins。本發(fā)明的另一方面是含有本發(fā)明提取物或化合物的食品，包括但不限于魚類、甲殼類、魚類替代品、甲殼類替代品、肉類、肉類替代品、家禽產(chǎn)品、蔬菜、綠葉蔬菜、醬料、乳液、飲料、果汁、果酒、啤酒、乳制品、蛋制品、果醬、果凍、谷物制品、烘焙制品和糖果。本發(fā)明的另一方面是含有本發(fā)明提取物或化合物的美容產(chǎn)品，包括但不限于例如霜?jiǎng)⒛z、粉末、洗液、遮光劑、唇膏、沐浴露、藥草提取物和支持細(xì)菌生長(zhǎng)的制劑。本發(fā)明的另一方面是表面包含本發(fā)明提取物或化合物的產(chǎn)品，包括但不限于工作臺(tái)面、門、窗戶、把手、外科手術(shù)設(shè)備、醫(yī)療工具、能污染人類及動(dòng)物等的接觸表面。本發(fā)明的另一方面是本發(fā)明提取物或分離的化合物或包含所述提取物或化合物的組合物為有需要的患者提供抗菌、抗微生物或殺芽孢作用的用途。本發(fā)明的另一方面是本發(fā)明提取物或分離的化合物或包含所述提取物或化合物的組合物為食品或美容組合物提供抗菌、抗微生物或殺芽孢作用的用途。本發(fā)明的另一方面是本發(fā)明提取物或分離的化合物或包含所述提取物或化合物的組合物為表面提供抗菌、抗微生物或殺芽孢作用的用途。該作用可通過(guò)將表面暴露于本發(fā)明的提取物或分離化合物，或?qū)⒈景l(fā)明的提取物或分離化合物壓制在或嵌入表面而產(chǎn)生?？刮⑸?、抗菌和/或殺芽孢的作用可用于微生物、細(xì)菌或其他芽孢形成型微生物，所述微生物屬包括但不限于梭菌(Clostridium)、芽孢桿菌(Bacillus)、脂環(huán)酸桿菌(Alicyclobacillus)和李斯特菌.抗微生物、抗菌和/或殺芽孢的作用可用于微生物、細(xì)菌或芽孢，其來(lái)自下列種，包括但不限于肉毒梭菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、艱難梭菌、炭疽芽孢桿菌(Bacillusanthracis)、蠟狀芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌(Bacilluslichniformis)、酸土脂環(huán)酸桿菌(Alicyclobacillusacidoterrestris)、嗜酸脂環(huán)酸桿菌(Alicyclobacillusacidiphilus)、單核細(xì)胞增多性李斯特菌。上述式(I)描述了從本發(fā)明提取物和純化中得到的新型化合物。為了提供抗微生物、抗菌和/或殺芽孢的作用，式(I)化合物在R3上可具有少至一個(gè)碳-碳雙鍵，該雙鍵可為順式(Z)或反式(E)構(gòu)型。式(I)化合物在該范圍的一個(gè)實(shí)施方案為，碳-碳雙鍵是C-5/C-6、C-12/C-13、C-15/C-16、C-16/C-17或其任何組合，該雙鍵為反式或順式鍵。所述化合物的范圍的另一實(shí)施方案為，碳-碳雙鍵單獨(dú)位于C-5和C-6、和/或C-16和C-17、和/或C-12和C-13、和/或C-15和C-16，作為反式或順式鍵。式(I)化合物進(jìn)一步范圍的實(shí)例包括但不限于：(2R,5E,12Z,15Z)-1-乙酰氧基-2-羥基-4-氧代-二十一-5,12,15-三烯(PersenoneA)(5E)-1-乙酰氧基-2-羥基-5-十九烯-4-酮(PersenoneB)或(2R,12Z,15Z)-1-乙酰氧基-2-羥基-4-氧代-二十一-12,15-二烯(Persin)此外，為了提供抗微生物、抗菌和/或殺芽孢的作用，式(I)化合物可單獨(dú)或與下述式(II)化合物聯(lián)合使用：其中R1為氫或乙酰基；R2和R4為氫或羥基保護(hù)基；和R3為具有至少一個(gè)碳-碳雙鍵的烯基。本發(fā)明該方面的一個(gè)實(shí)施方案是式(II)化合物，其中R1為氫或乙?；?；R2和R4為氫或羥基保護(hù)基；和R3為具有一個(gè)順式和/或反式構(gòu)型的碳-碳雙鍵的C5-C22烯基。本發(fā)明該方面的另一實(shí)施方案是式(II)化合物，其中R1為氫或乙?；?；R2和R4為氫；和R3為具有兩個(gè)反式構(gòu)型碳-碳雙鍵的C5-C22烯基。本發(fā)明該方面的另一實(shí)施方案是式(II)化合物，其中R1為乙?；籖2和R4為氫；和R3為含有12到18個(gè)碳原子的烯基，該基團(tuán)具有一個(gè)反式構(gòu)型的碳-碳雙鍵；并且與R2和R4鍵合的碳呈(S)構(gòu)型。本發(fā)明該方面的另一實(shí)施方案是式(II)化合物，其中該化合物的C-16和C-17位置上具有雙鍵。本發(fā)明該方面的另一實(shí)施方案是下述式(II)化合物的用途：(2S,4S)-1-乙酰氧基-2,4-二羥基-n-十七-16-烯式(II)化合物能通過(guò)還原式(I)化合物中的酮來(lái)進(jìn)行合成，或通過(guò)使用Sugiyama等(1982)所公開的方法使二甲基-1,3-二氧雜環(huán)戊烷-4-乙醛與R3MgX(其中R3如上文所限定，X為鹵化物)化合物反應(yīng)而合成。本發(fā)明的另一方面，抗菌、抗微生物或抑芽孢/殺芽孢的作用至少與其他已知的抗菌、抗微生物或抑芽孢/殺芽孢試劑一樣有效，例如LAE(月桂酰精氨酸乙酯單鹽酸鹽)、亞硝酸鹽或乳酸鏈球菌肽(具有34個(gè)氨基酸的多環(huán)肽)。作為天然產(chǎn)物的或容易從中得到的本發(fā)明提取物或分離化合物的用途優(yōu)于其他已知的非天然產(chǎn)物的或不容易獲得的試劑。非天然產(chǎn)物使用在生產(chǎn)食品或美容品時(shí)特別有異議，這可能需要對(duì)其應(yīng)用進(jìn)行管理批準(zhǔn)。本發(fā)明的實(shí)施方案可根據(jù)如下所述的項(xiàng)目中的任意一項(xiàng)或多項(xiàng)。項(xiàng)目1.從鱷梨屬(Perseasp.)制備天然抗微生物、抗菌或抑制芽孢萌發(fā)的化合物濃縮物用于提供抗微生物、抗菌或抑制芽孢萌發(fā)作用的方法，所述方法包括：(a)用極性溶劑對(duì)種子或其他鱷梨植物組織(例如中果皮(干的或新鮮的)和/或葉)進(jìn)行提??；(b)接著進(jìn)行從極性溶劑鱷梨提取物中或直接從磨碎的種子或其他鱷梨植物組織中富集acetogenins的純化過(guò)程；或者(a1)用非極性溶劑對(duì)種子或其他鱷梨植物組織(例如中果皮(干的或新鮮的)和/或葉)進(jìn)行提?。?b1)接著進(jìn)行從非極性溶劑鱷梨提取物中或直接從磨碎的種子或其他鱷梨植物組織中富集acetogenins的純化過(guò)程。項(xiàng)目2.根據(jù)項(xiàng)目1所述的方法，其中所述極性溶劑包括但不限于C1-C4醇(例如乙醇、異丙醇、甲醇)、二甲基亞砜、四氫呋喃、丙酮、乙腈或其混合物。項(xiàng)目3.根據(jù)項(xiàng)目1或2所述的方法，其中純化過(guò)程包括使用極性溶劑(一種或作為組合)和非極性溶劑(一種或作為組合)的雙相分配體系，所述極性溶劑包括但不限于水、C1-C4醇(例如乙醇、異丙醇、甲醇)、二甲基亞砜、四氫呋喃、丙酮、乙腈，所述非極性溶劑包括但不限于己烷、庚烷、乙醚、乙酸乙酯、石油醚、丁醇、氯仿、甲苯、甲基叔丁基醚、甲基異丁酮及其混合物。項(xiàng)目4.根據(jù)項(xiàng)目1-3中任一項(xiàng)所述的方法，其中雙相分配體系的溶劑體系包括但不限于單獨(dú)或并行的甲醇:庚烷和/或水:己烷和/或水:丁醇和/或甲基叔丁基醚:乙腈:水、和/或庚烷:乙酸乙酯:乙腈、庚烷:乙酸乙酯:甲醇:水(以不同比率)以富集各相之一中的活性物。項(xiàng)目5.根據(jù)項(xiàng)目1-4中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述純化過(guò)程為包含快速或高效離心分配色譜法(FCPC或HPCPC)或逆流色譜法(CCC)的分配分離。項(xiàng)目6.根據(jù)項(xiàng)目1-5中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述濃縮物包含以下化合物中的至少一種項(xiàng)目7.根據(jù)項(xiàng)目1-6中任一項(xiàng)所述的方法，其中濃縮物還包含：式(I)化合物其中R1為氫或乙酰基；R2為氫或羥基保護(hù)基；和R3為具有至少一個(gè)碳-碳雙鍵的烯基；和/或式(II)化合物其中R1為氫或乙酰基；R2和R4為氫或羥基保護(hù)基；和R3為具有至少一個(gè)碳-碳雙鍵的烯基。項(xiàng)目8.根據(jù)項(xiàng)目1-7中任一項(xiàng)所述的方法，其中任選提取和純化過(guò)程不導(dǎo)致被富集或分離的化合物的皂化。項(xiàng)目9.抗微生物、抗菌或抑制芽孢萌發(fā)的組合物或產(chǎn)品，所述組合物或產(chǎn)品包含項(xiàng)目1-8中任一項(xiàng)所述的提取物。項(xiàng)目10.根據(jù)項(xiàng)目9所述的抗微生物、抗菌或抑制芽孢萌發(fā)的組合物或產(chǎn)品，其中所述組合物或產(chǎn)品選自：(a)藥物組合物，所述藥物組合物適于通過(guò)口服、經(jīng)皮膚、胃腸外、經(jīng)鼻、經(jīng)眼睛、經(jīng)耳、舌下、經(jīng)直腸或經(jīng)陰道給藥；(b)食品，所述食品包括但不限于魚類、甲殼類、魚類替代品、甲殼類替代品、肉類、肉類替代品、家禽產(chǎn)品、蔬菜、綠葉蔬菜、醬料、乳液、飲料、果汁、果酒、啤酒、乳制品、蛋制品、果醬、果凍、谷物制品、烘焙制品和糖果；(c)美容品，所述美容品包括但不限于以下產(chǎn)品，例如霜?jiǎng)?、凝膠、粉末、洗液、遮光劑、唇膏、沐浴露、藥草提取物和支持細(xì)菌生長(zhǎng)的制劑；和(d)表面產(chǎn)品，所述表面產(chǎn)品包括但不限于工作臺(tái)面、門、窗戶、把手、外科手術(shù)設(shè)備、醫(yī)療工具、能污染人類、動(dòng)物等的接觸表面。項(xiàng)目11.式(I)化合物其中R1為氫或乙酰基；R2為氫或羥基保護(hù)基；和R3為具有至少兩個(gè)反式構(gòu)型碳-碳雙鍵的烯基。項(xiàng)目12.根據(jù)項(xiàng)目11所述的化合物，其中所述化合物的C-16和C-17位置處存在雙鍵。項(xiàng)目13.根據(jù)項(xiàng)目12所述的化合物，所述化合物具有下式項(xiàng)目14.根據(jù)項(xiàng)目1-8中任一項(xiàng)所述的提取物用于制備組合物或產(chǎn)品的用途，所述組合物或產(chǎn)品用于為有需要的患者或產(chǎn)品提供抗菌、抗微生物或抑制芽孢萌發(fā)作用。項(xiàng)目15.根據(jù)項(xiàng)目14所述的用途，其中所述抗菌、抗微生物或芽孢萌發(fā)抑制作用可適用于包括但不限于梭菌、芽孢桿菌、脂環(huán)酸桿菌和李斯特菌屬的微生物、細(xì)菌或芽孢。項(xiàng)目16.根據(jù)項(xiàng)目15所述的用途，其中所述抗微生物、抗菌或芽孢萌發(fā)抑制作用可適用于包括但不限于以下種的微生物、細(xì)菌或芽孢：肉毒梭菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、艱難梭菌、炭疽芽孢桿菌、蠟狀芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、酸土脂環(huán)酸桿菌、嗜酸脂環(huán)酸桿菌、單核細(xì)胞增多性李斯特菌。本發(fā)明還由下面的非限制性實(shí)施例進(jìn)行描述，這些實(shí)施例進(jìn)一步闡述了本發(fā)明，并且既不意圖也不應(yīng)該被認(rèn)為限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例實(shí)施例1：鱷梨種子丙酮和己烷提取物的抗菌和殺芽孢活性使用膠體研磨機(jī)將鱷梨種子磨碎，獲得平均半徑為0.5-2毫米的顆粒。磨碎的鱷梨種子(50克)與丙酮或己烷以原料:溶劑＝1:2(w/v)的比率混合。將混合物在25℃儲(chǔ)存24小時(shí)以獲得鱷梨種子粗提物。通過(guò)真空過(guò)濾法將種子從提取物中分離。粗提物在真空下通過(guò)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(35℃,22英寸汞柱(inHg))進(jìn)行蒸發(fā)干燥，得到的干物質(zhì)進(jìn)行稱重并重新溶解于丙酮中，得到的終濃度為2.5mg/ml。使用該調(diào)整過(guò)的樣品進(jìn)行抗菌和殺芽孢測(cè)試(見圖1)。將調(diào)節(jié)過(guò)的溶液(5μL)轉(zhuǎn)移到無(wú)菌的、由Whatman1號(hào)濾紙制成的、直徑為6mm的圓盤上進(jìn)行抗菌評(píng)估，由此在溶劑蒸發(fā)后每個(gè)圓盤含有12.5μg來(lái)自上述富集的鱷梨種子提取物的固體。在與提取物同樣的條件下處理實(shí)驗(yàn)對(duì)照，含有5μL丙酮的圓盤用作陰性對(duì)照，5μL乳酸鏈球菌肽溶液(30mg/ml在無(wú)菌水中)加到圓盤中用作陽(yáng)性對(duì)照，實(shí)現(xiàn)每個(gè)圓盤中乳酸鏈球菌肽剩余含量(residualconcentration)為150μg。所有測(cè)試圓盤置于生物安全柜中約1-2小時(shí)以蒸發(fā)溶劑。按照HealthCanada(FoodDirectorate,2010)官方操作手冊(cè)中描述的方法，制備含有約1-2x108CFU/ml的生孢梭菌(ATCC7955)營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞、分離的天然芽孢或分離的熱激芽孢的約0.1光密度(在600nm)的懸浮液。轉(zhuǎn)移等份的懸浮液(100μL)到含有15ml固體培養(yǎng)基(TPGY培養(yǎng)基)的培養(yǎng)皿中，用無(wú)菌塑料棒涂抹均勻。四個(gè)圓盤(每個(gè)含12.5μg待測(cè)提取物)和兩個(gè)額外的圓盤(一個(gè)溶劑空白對(duì)照和一個(gè)乳酸鏈球菌肽陽(yáng)性對(duì)照)置于單個(gè)平皿中，在37℃厭氧條件下進(jìn)行溫育。36小時(shí)后測(cè)定圓盤周圍的抑制區(qū)域的直徑(厘米)。丙酮和己烷鱷梨種子提取物對(duì)芽孢形成型細(xì)菌生孢梭菌的營(yíng)養(yǎng)細(xì)菌細(xì)胞、天然芽孢和熱激芽孢表現(xiàn)出明顯的抗菌活性(見圖2)。除了己烷提取物對(duì)熱激芽孢表現(xiàn)出比丙酮提取物高約20％的殺芽孢活性之外，丙酮和己烷提取物的活性沒有顯著區(qū)別。丙酮和己烷鱷梨種子提取物都比陽(yáng)性對(duì)照(乳酸鏈球菌肽，150μg)表現(xiàn)出更高的抗菌活性。陽(yáng)性對(duì)照處理(乳酸鏈球菌肽)對(duì)營(yíng)養(yǎng)細(xì)菌細(xì)胞、芽孢和熱激芽孢分別造成1.3、1.0和0.9cm的抑菌區(qū)域。用于獲得粗提物的鱷梨種子一旦被磨碎，可在有氧或無(wú)氧并低于25℃的條件下貯藏至少14天而并不影響對(duì)芽孢形成型細(xì)菌的抗菌活性。因此在富含生物活性化合物的提取物制備前，鱷梨種子可作為整體或粗粉貯藏。實(shí)施例2：與其他植物來(lái)源相比較，鱷梨種子提取物對(duì)芽孢形成型細(xì)菌的營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞和熱激細(xì)菌芽孢的特異活性本發(fā)明的功效可通過(guò)芒果果仁的抗菌粗提物制備物進(jìn)行觀測(cè)，所述制備物已經(jīng)在現(xiàn)有技術(shù)中被報(bào)道為表現(xiàn)出對(duì)芽孢形成型細(xì)菌營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞的抗菌活性(Kabuki等，2000)。按照實(shí)施例1中所述的方法制備鱷梨(Perseaamericana)和芒果果仁(Mangiferaindica)的粗提物，并測(cè)試其對(duì)生孢梭菌的營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞和熱激芽孢生長(zhǎng)的抗菌活性(見表1)。表1：鱷梨種子和芒果果仁提取物對(duì)生孢梭菌(ATCC7955)的營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞和熱激芽孢的抗菌活性。與所期望的相反，只有鱷梨種子提取物對(duì)所測(cè)試的兩種細(xì)菌生理階段(營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞和熱激芽孢)表現(xiàn)出活性。芒果果仁提取物表現(xiàn)出對(duì)芽孢形成型細(xì)菌營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞的抗菌活性，但對(duì)細(xì)菌芽孢或熱激芽孢的生長(zhǎng)沒有活性。因此，本實(shí)施例證實(shí)鱷梨植物化學(xué)物的化學(xué)性質(zhì)對(duì)芽孢形成型細(xì)菌的營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞、芽孢和熱激芽孢生長(zhǎng)的抑制有顯著作用。實(shí)施例3：振蕩對(duì)鱷梨種子丙酮和己烷粗提物抗菌活性的影響類似于實(shí)施例1，通過(guò)膠體研磨機(jī)磨碎鱷梨種子獲得平均半徑為0.5-2mm的顆粒。磨碎的鱷梨種子(50克)與己烷按照原料:溶劑＝1:2(m/v)的比率混合。在25℃下以200rpm振蕩或浸泡混合物24小時(shí)以獲得鱷梨種子粗提物。通過(guò)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(35℃,22英寸汞柱)將粗提物蒸發(fā)至干燥，并將得到的干物質(zhì)稱重。如實(shí)施例1中所述，在丙酮中重新溶解干物質(zhì)至終濃度為2.5mg/ml用于抗菌評(píng)估。生孢梭菌(ATCC7955)因?yàn)槭侨舛舅缶囊阎嫘晕⑸锒挥米鳒y(cè)試微生物。對(duì)營(yíng)養(yǎng)細(xì)菌細(xì)胞、天然芽孢和熱激芽孢的抗菌活性按照實(shí)施例1中的方法進(jìn)行測(cè)定。觀察到振蕩處理對(duì)鱷梨種子己烷提取物針對(duì)營(yíng)養(yǎng)細(xì)菌細(xì)胞、天然芽孢和熱激芽孢的抗菌活性具有顯著效果(圖3)。盡管振蕩提取的干物質(zhì)的收率更高，但與經(jīng)過(guò)振蕩獲得的提取物相比較，未經(jīng)過(guò)振蕩獲得的提取物顯示出更高的抗菌活性。通過(guò)本實(shí)施例我們可以發(fā)現(xiàn)，振蕩提高了對(duì)存于鱷梨種子中的其他非抗菌化合物的提取，因此稀釋了抗菌活性化合物的濃度。因此抗菌的鱷梨種子提取物必須通過(guò)浸漬方式獲得，最好不要振蕩。由于化合物的稀釋，經(jīng)過(guò)振蕩獲得的提取物與陽(yáng)性對(duì)照(乳酸鏈球菌肽，150μg)相比產(chǎn)生相同或更低的抑制區(qū)，所述陽(yáng)性對(duì)照對(duì)營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞、芽孢和熱激芽孢分別顯示為1.3、1和0.9cm。實(shí)施例4：提取時(shí)間和提取溶劑類型(丙酮、乙醇和己烷)對(duì)鱷梨種子粗提物抗菌性質(zhì)的影響用膠體研磨機(jī)磨碎鱷梨種子獲得平均半徑為0.5-2mm的顆粒。磨碎的鱷梨果核(50克)與丙酮或乙醇或己烷按原料:溶劑＝1:2(m/v)的比率混合。在35℃下以200rpm搖動(dòng)混合物24小時(shí)以獲得鱷梨種子粗提物。提取過(guò)程中，分別在0.5、5和24小時(shí)從每種粗提物中收集等份試樣。用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(35℃,22英寸汞柱)將不同提取時(shí)間獲得的粗提物蒸發(fā)至干燥，并將得到的干物質(zhì)稱重。將干物質(zhì)重新溶解于丙酮中至終濃度為2.5mg/ml。生孢梭菌(ATCC7955)用作抗菌測(cè)定中的測(cè)試微生物。對(duì)營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞、天然芽孢和熱激芽孢的抗菌活性(使用圓盤抑制區(qū)測(cè)定法)按照實(shí)施例1中的方法進(jìn)行測(cè)定。為了與在相同時(shí)間間隔內(nèi)使用其他溶劑(丙酮和乙醇)進(jìn)行比較，己烷提取物對(duì)營(yíng)養(yǎng)細(xì)菌細(xì)胞、芽孢和熱激芽孢的抗菌活性看作是100％的抑制作用。對(duì)營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞的抗菌活性的結(jié)果如圖4所示，其表明30分鐘的提取時(shí)間后得到的乙醇提取物與同樣條件下用己烷獲得的提取物相比有完全相同的活性。相反，在30分鐘提取時(shí)間下丙酮提取物僅表現(xiàn)出己烷提取物所觀測(cè)到的抗菌活性的70％，5小時(shí)提取時(shí)間之后數(shù)值達(dá)到己烷提取物所觀測(cè)到的活性80％的最大抗菌活性。因此，本實(shí)施例證實(shí)，因?yàn)楸鸵掖际菢O性溶劑，在測(cè)試條件下增加提取時(shí)間稀釋了生物活性化合物的濃度，和/或使該溶液飽和。此外并且與所期望的相反的是，針對(duì)芽孢形成型細(xì)菌營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞的抗菌化合物性質(zhì)造成使用乙醇比丙酮有更好的回收率(圖4)。提取物對(duì)天然芽孢的抗菌性質(zhì)的結(jié)果如圖5所示；其表明隨提取時(shí)間(0.5-24小時(shí))的增加，使用丙酮或乙醇作為提取溶劑沒有表現(xiàn)出任何差異。乙醇還對(duì)針對(duì)天然芽孢有抗菌性質(zhì)的化合物的提取更具有選擇性。不同提取物對(duì)熱激芽孢生長(zhǎng)的抗菌活性結(jié)果如圖6所示，其表明了不同的趨勢(shì)，在提取時(shí)間為30分鐘時(shí)兩種溶劑(丙酮和乙醇)對(duì)抗菌分子的提取有相同的效率。然而，當(dāng)使用丙酮作為溶劑時(shí)，觀測(cè)到提取物中抗菌分子的濃度隨時(shí)間變化明顯下降，提取時(shí)間從0.5到5小時(shí)，細(xì)菌抑制作用分別從100％降到低于80％，之后活性保持穩(wěn)定。乙醇不像丙酮提取物一樣容易地在提取時(shí)間內(nèi)使目標(biāo)化合物飽和，因此對(duì)于該溶劑，在0.5到5小時(shí)的提取時(shí)間內(nèi)沒有觀察到差異。因此本實(shí)施例證實(shí)了乙醇與己烷一樣對(duì)抗菌化合物的提取有效，所述抗菌化合物對(duì)芽孢形成型細(xì)菌的營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞、天然芽孢和熱激芽孢的生長(zhǎng)具有抑制活性。實(shí)施例5：丙酮鱷梨種子提取物與磨碎的鱷梨種子在庚烷：甲醇雙相不混溶溶劑體系中分級(jí)分離的比較本實(shí)施例中，按照實(shí)施例1所述制備鱷梨種子的丙酮粗提物，并蒸發(fā)至干。從50克磨碎的鱷梨種子中得到的干燥丙酮粗提物直接加到含有兩種不混溶溶劑體系的分離漏斗中，該溶劑體系由100ml庚烷(上相F002)和100ml甲醇(下相F001)組成，用于提取物中含有的極性和非極性化合物的分配(圖7A)。為了進(jìn)行比較，將50克磨碎的鱷梨種子直接加入到還包含100ml庚烷(上相)和100ml甲醇(下相)的不混溶溶劑體系中來(lái)制備第二雙相體系。為了在一步內(nèi)選擇性地提取和分配種子中存在的化合物，將該混合物在35℃下以200rpm振蕩24小時(shí)。隨后，用真空過(guò)濾法將種子從提取物中分離。使該體系的上相(F003)和下相(F004)在分離漏斗中形成，并分別收集，見圖7B。分別用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(35℃,22英寸汞柱)將前述不同相(F001-F004)蒸發(fā)至干，并將得到的干物質(zhì)稱重。將干燥的分離物重新溶解于丙酮中至終濃度為2.5mg/ml，用于后面對(duì)生孢梭菌(ATCC7955)的抗菌活性的評(píng)估。按照實(shí)施例1所述的方法測(cè)定對(duì)營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞、天然芽孢和熱激芽孢的抗菌活性(圓盤抑制區(qū)測(cè)定法)。對(duì)熱激芽孢的圓盤抑制區(qū)結(jié)果顯示，用兩種不混溶溶劑直接提取磨碎的鱷梨種子減少了雜質(zhì)量，雜質(zhì)可移到上相并稀釋活性化合物的作用(圖8)，因此這說(shuō)明了對(duì)抑制芽孢萌發(fā)的化合物進(jìn)行一步分離是一個(gè)更好的選擇。然而根據(jù)對(duì)營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞抑制的抗菌結(jié)果，兩種方法造成類似的結(jié)果，沒有一種方法比另一種更有優(yōu)勢(shì)。因此本實(shí)施例證實(shí)，在所進(jìn)行的對(duì)磨碎種子直接提取和對(duì)干燥的丙酮鱷梨種子提取物分配的兩個(gè)評(píng)估中，抗菌物質(zhì)都被富集于庚烷:甲醇雙相體系的上相中。然而在下相(F002和F004)中也觀測(cè)到殘留的活性，表明上相被活性化合物飽和或所述化合物在兩個(gè)體系的下相中有部分溶解性。因此建立后續(xù)的提取，對(duì)從甲醇下相F002中回收的蒸干的固體再提取；用來(lái)回收殘留抗菌化合物的后續(xù)提取體系(第二雙相不混溶溶劑體系)由乙酸乙酯(100ml)和水(100ml)構(gòu)成。乙酸乙酯相和水相的抗菌活性如圖9所示。上述第二個(gè)雙相不混溶溶劑體系比之前使用的第一個(gè)體系更具極性，并且在下相(主要是水)中沒有發(fā)現(xiàn)殘留的抗菌活性。為進(jìn)一步完成本實(shí)施例，作為上述庚烷:甲醇體系的選擇，還評(píng)估了其他兩個(gè)額外的不混溶溶劑體系如何分配干燥的丙酮鱷梨種子提取物并獲得富含生物活性分子的制備物。通過(guò)使用己烷和甲醇雙相體系，還在己烷上相中回收到抗菌化合物(圖10)。然而，庚烷:甲醇雙相體系被證明對(duì)上相中化合物的回收更有效率，因?yàn)樗@示出遷移到下相的所述化合物更少。通過(guò)使用水雙相體系(用水、鹽和乙醇)進(jìn)行了另外的測(cè)試，以從乙醇粗提物中分離抗菌化合物，并且在主要由乙醇組成的上相中回收到目標(biāo)化合物。實(shí)施例6：皂化對(duì)鱷梨種子的丙酮和己烷提取物的抗菌活性的影響按照實(shí)施例5中所述的方法，使用己烷和甲醇分配鱷梨種子的丙酮粗提物。分離各相，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(35℃,22英寸汞柱)將含有極性較小化合物的富含己烷的上相蒸發(fā)至干。根據(jù)Broutin等(2003)，皂化是獲得生物活性部分的必要步驟，所述生物活性部分包括脂肪醇或萜醇、固醇、生育酚、類胡蘿卜素和葉黃素，它們保留在未皂化部分中并不溶于水。然而本實(shí)施例證實(shí)，本發(fā)明的抗菌化合物不能用同樣的方法獲得，這表明了不同的化學(xué)性質(zhì)。按照Broutin等(2003)并且作了一些修改來(lái)進(jìn)行對(duì)丙酮粗提物和被分配的己烷上相部分的皂化，以回收未皂化部分和選擇性地提取在其中存在的呋喃脂質(zhì)和多羥基化脂肪醇。分別將5克每份的提取物與2.5ml12N的氫氧化鉀和10ml乙醇相混合，然后靜置4小時(shí)。該水-乙醇混合物隨后轉(zhuǎn)移到分離漏斗中，加入17.5ml水，然后加入17.5ml二氯乙烷。振蕩混合物30秒，然后讓混合物分成兩相?；厥沼袡C(jī)相(下相)。重復(fù)此操作6次，將有機(jī)相合并一起并用水洗滌。用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(35℃,22英寸汞柱)將二氯乙烷蒸發(fā)至干，并將得到的干物質(zhì)稱重。將干物質(zhì)重新溶解于丙酮中至終濃度2.5mg/ml。按照實(shí)施例1所述進(jìn)行抗菌和殺芽孢活性測(cè)試(圓盤抑制區(qū)檢測(cè)法)，生孢梭菌(ATCC7955)用作測(cè)試微生物。如圖11所示，只有從丙酮粗提物中提取的未皂化物質(zhì)表現(xiàn)出對(duì)芽孢的圓盤抑制作用，表明用己烷和甲醇對(duì)丙酮提取物的分配消除了未皂化的化合物。有趣地是，從丙酮粗提物中得到的這些未皂化部分比非堿性處理的丙酮粗提物活性更低(圖2)，特別是其針對(duì)細(xì)菌芽孢的抑制活性。丙酮粗提物中未皂化的化合物對(duì)營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞比對(duì)芽孢有更高的特異性。用己烷-甲醇進(jìn)行分配減少了未皂化物質(zhì)對(duì)營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞的活性，表明這些化合物中的一些可能在分配期間遷移到醇類相中。將己烷上相和甲醇下相(丙酮粗提物中的未皂化物質(zhì)在該兩相中分配)的抗菌性質(zhì)與實(shí)施例1中所述的丙酮和己烷粗提物的活性相比較，兩相的抗菌性質(zhì)都明顯較低。因此結(jié)果表明，活性化合物對(duì)堿性處理敏感，或者在皂化處理和隨后的分配步驟期間改變或消除了某些期望的化學(xué)性質(zhì)。因此，不應(yīng)考慮通過(guò)以分離或增加抗菌和殺芽孢活性為目的的皂化步驟來(lái)獲得鱷梨種子活性提取物。實(shí)施例7：鱷梨種子丙酮提取物的分配色譜按照實(shí)施例1所述獲得鱷梨種子的丙酮粗提物并蒸發(fā)至干，然后按照實(shí)施例5所述在庚烷:甲醇雙相體系中進(jìn)行分配。用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(35℃,22英寸汞柱)將含有極性較小化合物的富含庚烷的上相(F001)蒸發(fā)至干，然后注入具有1000ml分離柱的快速離心分配色譜儀BenchScale中，用庚烷和甲醇對(duì)化合物進(jìn)行分級(jí)分離。庚烷被泵入分離柱中并作為固定相(740ml)。隨后將甲醇(移動(dòng)相)以10mL/min的流速泵入分離柱。設(shè)置轉(zhuǎn)速為800rpm。在體系達(dá)到流體動(dòng)力平衡后，將從庚烷:甲醇雙相體系(鱷梨種子丙酮提取物在其中分配)蒸干的上相中得到的濃縮提取物(65ml)注入FCPC中。在前170分鐘內(nèi)，使用甲醇來(lái)洗脫流分，之后用庚烷作為流動(dòng)相洗脫100分鐘。用流分收集器將來(lái)自分離柱出口的流出液按每管10ml收集在試管中。收集各流分的1ml等份試樣用于抗菌和抑芽孢/殺芽孢活性測(cè)試。用高速真空濃縮器將等份試樣蒸發(fā)至干，記錄來(lái)自各流分的固體重量，形成70個(gè)連續(xù)流分集合，終濃度為2.5mg/ml集合。按照實(shí)施例1所述評(píng)定每個(gè)集合對(duì)生孢梭菌的營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞、天然芽孢和熱激芽孢的抗菌性質(zhì)。用高速真空濃縮器對(duì)各流分的剩余體積(9ml)進(jìn)行蒸發(fā)至干，貯藏于-80℃，進(jìn)一步用于化學(xué)鑒定評(píng)估。如圖12所示，抗菌活性存在于分配系數(shù)(Kd)小于0.5(更精確地，Kd值為0.19到0.35之間)的流分中，表明活性化合物在庚烷中的溶解度是在甲醇中的至少2倍。此外，這些流分對(duì)營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞的活性與對(duì)芽孢的活性相比差異輕微，因?yàn)闋I(yíng)養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制物更多地?cái)U(kuò)散至極性較大的流分中。與之前使用純度較低的提取物的實(shí)驗(yàn)相比，通過(guò)FCPC分配提取物增加了期望的抗菌活性(達(dá)到3cm的抑菌區(qū)直徑)，清楚表明有必要去除可能稀釋抗菌化合物濃度的其他植物化學(xué)物(圖12)。與圖2所示的鱷梨種子的己烷和丙酮粗提物的數(shù)據(jù)相比較，一些FCPC流分的抗菌活性增加了至少50％。圖12所示的結(jié)果還證實(shí)，如同圖8，活性化合物對(duì)庚烷相比對(duì)甲醇相有更大的親和力。為了進(jìn)一步表征具有最高活性流分的抗菌活性，測(cè)定其最小抑制濃度(MIC)就非常重要，MIC定義為抑制過(guò)夜培養(yǎng)后的微生物可視化生長(zhǎng)的抗菌劑的最低濃度。與乳酸鏈球菌肽相比，經(jīng)FCPC獲得的Kd為0.3和0.4的流分顯示出對(duì)生孢梭菌的營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞的MIC比對(duì)天然芽孢或熱激芽孢更低(表2)。Kd為0.4的流分對(duì)芽孢生長(zhǎng)抑制的活性幾乎是乳酸鏈球菌肽的2倍，但Kd為0.3的流分的活性是乳酸鏈球菌肽的約15倍。但在熱激芽孢的情況中，乳酸鏈球菌肽與Kd為0.4的流分之間的差異較不明顯，然而仍表現(xiàn)出期望的對(duì)芽孢萌發(fā)的抑制性質(zhì)。表2：通過(guò)對(duì)固體的反相快速離心分配色譜法(RF-FCPC)獲得的流分的最小抑制濃度(MIC)，所述固體回收自按實(shí)施例5所述用于分配鱷梨的丙酮粗提物的雙相體系(庚烷:甲醇)的上相(庚烷)中。*使用50mg/ml的初始母液對(duì)乳酸鏈球菌肽進(jìn)行測(cè)定，鱷梨流分為2.5mg/ml。如本實(shí)施例所示，在上述(反相)條件下經(jīng)FCPC分離(portion)的相同提取物還可用庚烷作為流動(dòng)相(正相)進(jìn)行分配，并且色譜分離的結(jié)果遵循相同的抗菌活性性能(圖13)。因此，F(xiàn)CPC獲得的最初流分比最后流分(更具極性)具有更好的活性，圖13顯示了抗菌活性一直保持存在到分配系數(shù)達(dá)到7.2，表明溶解度在庚烷中是在甲醇中的超過(guò)7.2倍的其他化合物不抑制生孢梭菌營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞或芽孢的生長(zhǎng)。實(shí)施例8：從鱷梨種子的丙酮提取物獲得對(duì)除了生孢梭菌外的其他微生物具有抑制活性的流分的分配色譜法按照實(shí)施例1所述獲得鱷梨種子的丙酮粗提物并蒸發(fā)至干，然后按照實(shí)施例5所述在庚烷:甲醇雙相體系中進(jìn)行分配。用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(35℃,22英寸汞柱)將含有極性較小化合物的富含庚烷的上相蒸發(fā)至干，然后用實(shí)施例7中描述的正相條件將其注入快速離心分配色譜儀中。隨后將從正相FCPC中獲得的流分用于評(píng)價(jià)其對(duì)金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)的抗菌活性。如圖14所示，與極性非常低的抑制生孢梭菌化合物不同的化合物抑制金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)，因?yàn)榕c實(shí)施例7中顯示的生孢梭菌的抑制結(jié)果相對(duì)比，當(dāng)用分配系數(shù)高于7的流分接種圓盤時(shí)，觀測(cè)到針對(duì)這些微生物的圓盤抑菌區(qū)。表3總結(jié)了前述實(shí)驗(yàn)的抗菌結(jié)果，這些結(jié)果獲自對(duì)實(shí)施例1的粗提物、按實(shí)施例5所述分配的提取物和實(shí)施例6中的未皂化流分的評(píng)估。有趣地是，正如觀測(cè)的那樣，與圖14所示富集的CPC流分所觀察到的更強(qiáng)的抑制效果相比較，它們沒有表現(xiàn)出任何對(duì)金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)的抑制效果，并且在對(duì)枯草芽孢桿菌測(cè)試時(shí)顯示出非常低的圓盤抑制區(qū)。表3：不同粗提物對(duì)金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)的抗菌活性的評(píng)估實(shí)施例9：高壓和溫度對(duì)抗菌活性穩(wěn)定性的影響按實(shí)施例1所述獲得鱷梨果核的丙酮粗提物并蒸發(fā)至干。然后如實(shí)施例5中所述使鱷梨經(jīng)丙酮提取的固體在己烷-甲醇雙相體系中分配，隨后通過(guò)乙酸乙酯:水的第二分配體系來(lái)徹底回收存在于第一分配體系(也在實(shí)施例5中有所描述)的下相(甲醇)中的活性化合物。將己烷和乙酸乙酯相分別回收，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(35℃,22英寸汞柱)蒸發(fā)至干。然后將兩相裝至小瓶中，置于300MPa和600MPa(分別為43,511和87,022psi)高液體靜壓(HHP)處理3分鐘和6分鐘。沒有觀測(cè)到高壓處理后的提取物的抗菌性質(zhì)有顯著不同，表明觀測(cè)到抗菌活性的化合物對(duì)HHP處理穩(wěn)定。還通過(guò)在25到100℃的溫度范圍內(nèi)持續(xù)60分鐘來(lái)測(cè)試活性化合物的熱穩(wěn)定性。對(duì)生孢梭菌營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)有活性的化合物(圖15)比對(duì)天然芽孢生長(zhǎng)有抑制活性的化合物(圖16)對(duì)熱處理的敏感性較小。正如圖15所示，參照保持在25℃下未經(jīng)熱處理的對(duì)照提取物的抑制活性，乙酸乙酯提取物和己烷提取物在經(jīng)過(guò)100℃處理60分鐘后對(duì)營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞的抑制活性分別降低了20％和23.5％。熱激芽孢對(duì)經(jīng)熱處理的己烷粗提物和乙酸乙酯粗提物的作用更有抗性；參照保持在25℃下的對(duì)照提取物所觀測(cè)到的抑制活性，上述提取物置于100℃下60分鐘后，對(duì)熱激芽孢的抑制活性降低了50％。實(shí)施例10:生物活性流分中發(fā)現(xiàn)的主要化合物的鑒定如實(shí)施例7中所述，將具有最高圓盤抑制區(qū)的(圖12)、通過(guò)使用反相快速離心分配色譜法(RP-FCPC)獲得的和Kd在0.19到0.35之間的流分混合在一起，構(gòu)成“活性流分集合”。首先將這些流分(13)調(diào)整到同樣的濃度(192.3mg/ml)，取等體積(100μl)的各流分，并用乙醇調(diào)整到終濃度為50mg/ml。圖17顯示存于活性物集合中流分的色譜概況隨其Kd增加的發(fā)展變化。用HPLC級(jí)甲醇將經(jīng)過(guò)蒸發(fā)的各流分的等份試樣調(diào)整到1mg/ml，取2μl注入。使用的分離柱為ZorbaxExtanded-C18(100x3mmd.i.,3.5μm)柱。移動(dòng)相包括100％作為A相的水和100％作為B相的甲醇。所用溶劑梯度如表4所示，經(jīng)6分鐘的柱平衡時(shí)間后，以0.38ml/min流速泵入。檢測(cè)儀波長(zhǎng)設(shè)置為220nm。表4：用來(lái)完成經(jīng)快速離心分配色譜法收集的流分色譜分離的溶劑梯度(A＝水，B＝甲醇)。時(shí)間(min)％A％B0307041585221090240100260100圖17顯示鱷梨抗菌化合物活性物集合的典型色譜圖。色譜圖上標(biāo)示的數(shù)字表示在220nm下有吸收的共有峰，標(biāo)記為化合物1到10，表5顯示其分子量和分子式信息。一些所述化合物之前已經(jīng)在鱷梨組織中報(bào)道過(guò)，可是其中還有一些化合物由于在抗菌流分中被發(fā)明人發(fā)現(xiàn)而作為新的化學(xué)化合物在本文中公開。在大多數(shù)生物活性流分中，諸如1、2、4和11的化合物與化合物7和9相比濃度更低(圖17)。表5：抗菌流分中發(fā)現(xiàn)的化合物的化學(xué)性質(zhì)。a共同名稱,如果有的話實(shí)施例11：富含抗菌化合物的流分的抑芽孢和殺芽孢活性的評(píng)估為了證實(shí)實(shí)施例10中描述的活性流分集合(分配系數(shù)為0.19到0.35)有抑芽孢或殺芽孢的活性，有必要檢測(cè)其最小抑制濃度(MIC)和最小殺菌濃度(MBC)。在一般術(shù)語(yǔ)中，MIC定義為抑制過(guò)夜培養(yǎng)后微生物可視化生長(zhǎng)的抗菌劑的最低濃度。而MBC為阻止微生物在不含抗生素或抗菌劑的新鮮瓊脂培養(yǎng)基上傳代培養(yǎng)后生長(zhǎng)的抗菌劑的最低濃度。在濃度為0.005到2.5mg/ml的范圍內(nèi)測(cè)試活性流分集合，乳酸鏈球菌肽用作對(duì)照。表6顯示，由于活性流分集合的MIC幾乎是乳酸鏈球菌肽MIC的十分之一，所以活性流分集合作為生孢梭菌芽孢生長(zhǎng)抑制物比乳酸鏈球菌肽好得多。根據(jù)Smola(2007)，如果MBC/MIC的比率≤4，則該化合物可被考慮用作殺芽孢劑，并且如果MBC/MIC的比率>4，則它只能作為抑芽孢劑。在本實(shí)施例中，乳酸鏈球菌肽和鱷梨活性流分集合都表現(xiàn)出殺芽孢作用。表6：乳酸鏈球菌肽和分離自鱷梨種子活性流分的集合對(duì)生孢梭菌熱激芽孢生長(zhǎng)的最小抑制濃度(MIC)、最小殺菌濃度(MBC)和MBC/MIC比率。樣本MIC(μg/ml)MBC(μg/ml)MBC/MICa乳酸鏈球菌肽2341561.5活性流分集合19.519.51aMBC/MIC比率≤4顯示殺芽孢活性。MBC/MIC比率>4顯示抑芽孢活性。實(shí)施例12：從生物活性流分中分離的化學(xué)化合物的抗菌活性在本實(shí)施例中，按照先前在實(shí)施例1所述，測(cè)定實(shí)施例10(表5)中描述的相同的分離化合物在0.5mg/ml的濃度下對(duì)生孢梭菌營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞和熱激芽孢生長(zhǎng)以及對(duì)金黃色葡萄球菌、綠膿假單胞菌(P.aeuroginosa)、大腸桿菌和枯草芽孢桿菌營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞的抗菌活性。如表7所示，化合物6(峰6)和persenoneB(峰9A)在對(duì)生孢梭菌進(jìn)行測(cè)試時(shí)，顯示出更高的抗菌性質(zhì)，然后是persenoneA(峰7)。另外，盡管作為已知抗菌劑的乳酸鏈球菌肽以100倍的更高濃度進(jìn)行測(cè)試，但是在所有的生物活性化合物中，只有persin(峰9B)顯示出比乳酸鏈球菌肽還低的活性。由于已經(jīng)報(bào)道乳酸鏈球菌肽能抑制真菌孢子萌發(fā)(Prusky等，1982)，并且在本實(shí)驗(yàn)中它似乎活性最低，因此可以認(rèn)為其他生物活性化合物對(duì)真菌孢子具有更高的活性。表7：圖17中分離的活性化合物對(duì)生孢梭菌(ATCC7955)營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞和熱激芽孢生長(zhǎng)的抗菌活性評(píng)估。特別要注意的是，所有對(duì)生孢梭菌營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞和熱激芽孢表現(xiàn)出最高活性的化合物(表7中報(bào)告的從最高到最低抗菌活性中提及的化合物6、PersenoneB及PersenoneA)都含有C5-C6雙鍵(參見表8)，這讓人意想不到。此外，如果比較persin(化合物9B)和persenoneA(化合物7)的結(jié)構(gòu)，唯一的差別在于persin(化合物9B)中沒有C5-C6雙鍵，在本實(shí)施例中我們證實(shí)了其抗菌活性降低了37.5％。此外，persenoneB(化合物9A)和化合物6之間唯一的結(jié)構(gòu)區(qū)別在于后者還具有C16-C17雙鍵，但它們的抑制活性相同。該觀察結(jié)果還支持以下發(fā)現(xiàn)，C5-C6雙鍵是本文所述化合物能提高抗菌活性所需的結(jié)構(gòu)特征，而且由于C16-C17雙鍵是存在于化合物3中的唯一不飽和鍵，并且化合物3比persin(化合物9B，包含兩個(gè)不飽和鍵，但在C16-C17之間沒有)有更高的活性，因此C16-C17雙鍵也是優(yōu)選的結(jié)構(gòu)特征。表8：鱷梨種子中具有抗菌活性的化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)和共同名稱。大多數(shù)對(duì)生孢梭菌的抗菌化合物(化合物6、PersenoneB和PersenoneA)沒有表現(xiàn)出對(duì)金黃色葡萄球菌、綠膿假單胞菌或大腸桿菌的抑制活性(表9)，但化合物6還顯示出對(duì)枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)的最高抑制活性，其次是persenoneA。由于化合物6是新發(fā)現(xiàn)的化合物，其之前并沒有作為鱷梨的成分被報(bào)道過(guò)，因此沒有關(guān)于其抗菌或任何其他生物活性的在先報(bào)道。之前PersenoneA作為抗真菌劑被報(bào)道過(guò)，但根據(jù)表7的結(jié)果，其抗菌活性特異性針對(duì)芽孢形成型革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌。按實(shí)施例10所述獲得的表現(xiàn)出對(duì)生孢梭菌具有抗菌性質(zhì)(實(shí)施例10)的活性流分集合，在本實(shí)施例中僅產(chǎn)生對(duì)芽孢形成型細(xì)菌枯草芽孢桿菌的抑制性質(zhì)。表9：生物活性化合物和活性流分集合對(duì)枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、綠膿假單胞菌和大腸桿菌營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞的圓盤抑制區(qū)。按實(shí)施例11所述測(cè)定化合物6、PersenoneB(化合物9A)和PersenoneA(化合物7)對(duì)生孢梭菌熱激芽孢萌發(fā)的MIC。如表10所示，上述三種化合物的MIC值為乳酸鏈球菌肽MIC值的1/15-1/30，證實(shí)了它們對(duì)細(xì)菌芽孢的功效。活性流分集合的MIC為19.5μg/ml(實(shí)施例11)，而分離后persenoneA和persenoneB的MIC則降到7.8μg/ml，但是集合內(nèi)PersenoneB的抗菌性質(zhì)并不與其低濃度相對(duì)應(yīng)，這是因?yàn)樗黾想m然含有較少μg的所述化合物但是當(dāng)與其他生物活性分子聯(lián)合時(shí)所述化合物活性有加強(qiáng)的表現(xiàn)。有趣地是，分離化合物僅表現(xiàn)出對(duì)生孢梭菌的抑制芽孢活性，并沒有表現(xiàn)出活性流分集合所觀察到的殺芽孢生物活性(表6)。表10：乳酸鏈球菌肽、化合物6、PersenoneB和A對(duì)生孢梭菌熱激芽孢的最小抑制濃度(MIC)。實(shí)施例13：鱷梨種子提取物與用于控制單核細(xì)胞增多性李斯特菌的冷藏溫度結(jié)合的抗菌活性實(shí)施例10所描述的活性流分集合還表現(xiàn)出對(duì)能在冷凍條件下生長(zhǎng)的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌的冷應(yīng)激營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞(cold-stressedvegetativecell)的抗菌效果，例如單核細(xì)胞增多性李斯特菌。在最適宜單核細(xì)胞增多性李斯特菌生長(zhǎng)的溫度37℃下，富含生物活性acetogenins的鱷梨提取物集合對(duì)該測(cè)試的微生物營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)沒有明顯的抑制作用(表11)。與所期望的相反，我們發(fā)現(xiàn)鱷梨種子提取物集合在冷凍條件下特別有用于抑制單核細(xì)胞增多性李斯特菌的生長(zhǎng)。而且，表12說(shuō)明當(dāng)測(cè)定本發(fā)明分離的鱷梨acetogenins對(duì)單核細(xì)胞增多性李斯特菌營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)的抗菌活性時(shí)，具有C5-C6雙鍵這一期望特征的化合物可用于控制冷凍條件下貯藏的食品和生物基質(zhì)中的單核細(xì)胞增多性李斯特菌。表11：鱷梨種子提取物與貯藏低溫結(jié)合的對(duì)單核細(xì)胞增多性李斯特菌營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)的抗菌活性。表12：分離的鱷梨化合物與冷藏結(jié)合對(duì)單核細(xì)胞增多性李斯特菌營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)的抗菌活性。實(shí)施例14：富集的鱷梨提取物中抗菌化合物的定量表7所述的活性流分集合(實(shí)施例10)中存在的抗菌化合物濃度如圖18所示。PersenoneA占活性流分集合干重的36.32％，persenoneB僅占0.20％，化合物6的量最低(0.05％)。似乎混合物中的其他組分沒有影響PersenoneA的抑制活性，因此沒有必要更進(jìn)一步的純化。表13顯示針對(duì)生孢梭菌的大多數(shù)生物活性化合物(化合物6、PersenoneB和PersenoneA)在新鮮鱷梨果肉和種子中具有非常近似的濃度，PersenoneA濃度最高。本實(shí)施例的信息是有重大意義的，因?yàn)槿绻锘钚曰衔镆泊嬖谟诠庵?，那么它們可容易地從果?shí)的其他部分獲得。本實(shí)施例還證實(shí)了人類在吃這種水果時(shí)就可按實(shí)現(xiàn)其抗菌活性所需要的濃度來(lái)獲得生物活性分子；因此建立它們?cè)谑称?、醫(yī)學(xué)和美容領(lǐng)域的商業(yè)潛能。表13：新鮮鱷梨果肉和種子中化合物6、PersenoneB和PersenoneA的濃度(ug/g鮮重)。已經(jīng)如上詳細(xì)描述了本發(fā)明的各種實(shí)施方案，應(yīng)理解的是，上文所說(shuō)的發(fā)明不限于以上說(shuō)明書中描述的具體內(nèi)容，因?yàn)榭赡艽嬖谄湓S多顯然的變化，而不脫離本發(fā)明的精神或范圍。參考文獻(xiàn)列表Adikaram,N.K.B.,Ewing,D.F.,Karunaratne,A.M.,Wijeratne,E.M.K.1992.Antifungalcompoundsfromimmatureavocadofruitpeel(不成熟鱷梨果皮中的抗真菌化合物).Phytochemistry.31:93-96.AOACOfficialMethod966.04SporicidalActivityofDesinfectants(消毒劑的殺芽孢活性).Revised2002.Barattaetal.1998.Chemicalcomposition,antimicrobialandantioxidantactivitiesoflaurel,sage,rosemary,oreganoandcorianderessentialoils(月桂、鼠尾草、艾菊、牛至和芫荽精油的化學(xué)組成、抗菌和抗氧化活性).J.Essent.OilRes.10(6):618-627.Beltran,J.B.U.andBonaventura,J.S.Useofcationicpreservativeinfoodproducts(陽(yáng)離子防腐劑在食品中的應(yīng)用).US7,862,842B2.Jan4,2011.Bevilacqua,A.,Sinigaglia,M.,Corbo,M.R.2008.Alicyclobaci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