本發(fā)明屬于高通量測序技術(shù)領(lǐng)域，尤其是涉及一種基于CRISPR/Cas9高通量技術(shù)篩選藥物靶點(diǎn)基因的方法。

背景技術(shù)：

致癌基因和抑癌基因都是癌癥基因治療的潛在靶點(diǎn)，因此其鑒定在癌癥的治療中有著巨大的應(yīng)用前景，目前已經(jīng)針對致癌基因EGFR、Alk等基因開發(fā)出治療癌癥的藥物。但是目前有效的癌癥基因靶向藥物還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足臨床治療的需要?；贑RISPR/Cas9(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/clustered regularly interspaced short palindromic repeats associated protein 9)的大規(guī)模功能基因篩選技術(shù)作為近幾年的基因工程新興技術(shù)，能夠在全基因組層面篩選癌癥相關(guān)基因，從而為癌癥的治療提供藥物靶點(diǎn)候選基因。

目前CRISPR/Cas9 screen技術(shù)只在國內(nèi)外少數(shù)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用，并未推廣。CRISPR/Cas9 screen技術(shù)的關(guān)鍵是保證sgRNA的覆蓋率，因此前期的sgRAN文庫的構(gòu)建的有效性，sgRAN文庫擴(kuò)增的高效性以及病毒包裝的有效性成為問題的關(guān)鍵。目前在國際期刊論文中長出現(xiàn)sgRNA文庫質(zhì)量不高或是后期sgRNA測序sgRNA文庫分布有偏態(tài)性的問題。另外傳統(tǒng)建庫方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力，并且需要大量的PCR酶，經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)也比較大。為解決以上問題，需要一種sgRNA文庫建立、擴(kuò)增、病毒包裝及測序的方法，以保證大規(guī)模癌癥基因靶點(diǎn)篩選的有效性和高效性。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的就是為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷而提供一種基于CRISPR/Cas9高通量技術(shù)篩選藥物靶點(diǎn)基因的方法。

本發(fā)明的目的可以通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)：

一種基于CRISPR/Cas9高通量技術(shù)篩選藥物靶點(diǎn)基因的方法，該方法包括以下步驟：

(1)用電轉(zhuǎn)的方法建立sgRNA文庫：

將合成的sgRNA的oligo片段用PCR擴(kuò)增的方法加接頭，然后用Gibson assembly的方法連接進(jìn)入lentiCRISPRv2質(zhì)粒，用Bio-rad電轉(zhuǎn)儀將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)中，從而獲得sgRNA文庫；

(2)用慢病毒包裝sgRNA文庫：

無菌條件下，培養(yǎng)293FT細(xì)胞，并用轉(zhuǎn)染試劑X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent將Lenti CRISPRv2及另外兩種病毒包裝質(zhì)粒psPAX2和pMD2.G包裝慢病毒；

(3)sgRNA文庫在細(xì)胞中的篩選：

選取合適的病毒量，感染待檢測的癌細(xì)胞系，感染48小時(shí)后，用puromycin篩選2天，所得陽性細(xì)胞收取部分作為對照組，其他細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)至42-46天(優(yōu)選為45天)后收取；

(4)提取篩選所得細(xì)胞及篩選前細(xì)胞的基因組DNA：

用細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，吹打混勻后，加入RNase酶，65℃孵育30分鐘，再加終濃度為10μg/ml的蛋白酶K，55℃孵育過夜，用純化液抽提DNA片段；

(5)富集基因組DNA中的sgRNA：

用限制性內(nèi)切酶對基因組DNA進(jìn)行酶切，37℃反應(yīng)過夜，將酶切后的DNA片段放置在0.8wt％的低熔點(diǎn)瓊脂糖膠中，80V，1小時(shí)電泳，切膠回收1600-2000bp的DNA片段。

(6)sgRNA文庫構(gòu)建與測序：

文庫按照illumina公司的建庫試劑盒說明書構(gòu)建，將建好文庫進(jìn)行Hiseq2000的50SE進(jìn)行高通量測序，結(jié)果進(jìn)行生物信息分析。

在第(1)步驟用電轉(zhuǎn)的方法建立sgRNA文庫前，先進(jìn)行sgRNA文庫設(shè)計(jì)，具體操作為：利用網(wǎng)站http://crisprscan.org和http://www.e-crisp.org在線設(shè)計(jì)感興趣的基因群的sgRNA，針對每種基因設(shè)計(jì)10個(gè)sgRNA。

步驟(1)中，oligo的PCR擴(kuò)增條件為：

步驟(1)中，Gibson assembly的條件為：

步驟(1)中，所述的病毒包裝過程Lenti CRISPRv2、psPAX2、pMD2.G的質(zhì)粒質(zhì)量按照4：3：1的比例轉(zhuǎn)染293FT細(xì)胞；以10cm的培養(yǎng)皿為例Lenti CRISPRv2、psPAX2、pMD2.G的質(zhì)粒質(zhì)量分別為6μg，4.5μg，1.5μg，X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent的量為30μL。轉(zhuǎn)染時(shí)采用懸浮轉(zhuǎn)染的方法。并于之后的48小時(shí)和72小時(shí)收取病毒液。

步驟(2)中利用感染病毒細(xì)胞對puromycin的抗性來檢測病毒感染效率，具體操作為：

在六孔板中培養(yǎng)細(xì)胞至融合度70％，用25μL、50μL、100μL、200μL、400μL的病毒液感染細(xì)胞，取能感染48-52％(優(yōu)選為50％左右)細(xì)胞的病毒量作為合適病毒量進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

步驟(4)中，細(xì)胞裂解液的成分為400μMNaCl、0.2％SDS、2mMEDTA、10mMTris-HCl。

步驟(4)中，所述的純化液指體積比25:24:1的酚、氯仿與異戊醇的混合液。

步驟(5)中，限制性內(nèi)切酶反應(yīng)體系為：50μL中，含有6μg DNA，5μL 10×NEB buffer，限制性內(nèi)切酶EcoNⅠ3μL。

待檢測的癌細(xì)胞系包括肺癌細(xì)胞與肝癌細(xì)胞細(xì)胞系。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)及有益效果：

本發(fā)明對細(xì)胞的篩選過程做了改進(jìn)，利用被感染細(xì)胞的puromycin抗性，用簡便的方法確定了病毒感染效率，確定了病毒MOI值；限制性內(nèi)切酶切方法與高通量方法的結(jié)合，而且能夠降低非特異性PCR擴(kuò)增產(chǎn)生的假陽性，提高了建庫效率；采用懸浮轉(zhuǎn)染包裝病毒的方法大大提高了病毒滴度，轉(zhuǎn)染試劑價(jià)格昂貴，此方法節(jié)約了篩選成本。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。

實(shí)施例1

對乳腺癌細(xì)T47D進(jìn)行藥物基因靶點(diǎn)的篩選。具體方法如下：

(1)sgRNA文庫設(shè)計(jì)：

利用網(wǎng)站http://crisprscan.org和http://www.e-crisp.org在線設(shè)計(jì)感興趣的基因群的sgRNA,針對每種基因設(shè)計(jì)10個(gè)sgRNA。

(2)用電轉(zhuǎn)的方法建立sgRNA文庫

將合成的sgRNA的oligo片段用PCR擴(kuò)增的方法加接頭，然后用Gibson assembly的方法連接進(jìn)入lentiCRISPRv2質(zhì)粒。用Bio-rad電轉(zhuǎn)儀將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)中，從而獲得sgRNA文庫。

(3)用慢病毒包裝sgRNA文庫：

無菌條件下，培養(yǎng)293FT細(xì)胞，并用Roche的轉(zhuǎn)染試劑X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent將Lenti CRISPRv2及另外兩種病毒包裝質(zhì)粒psPAX2和pMD2.G包裝慢病毒。細(xì)胞轉(zhuǎn)染后15小時(shí)換液，并于之后的24小時(shí)和48小時(shí)收取病毒液；

(4)T47D細(xì)胞中篩選sgRNA文庫

選取合適的病毒量，感染T47D，48小時(shí)后，用puromycin篩選2天,所得陽性細(xì)胞收取部分作為對照組，其他細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)至40天后收取。

(5)提取篩選所得細(xì)胞及篩選前細(xì)胞的基因組DNA

用細(xì)胞裂解液A裂解細(xì)胞，吹打混勻后，加入RNase酶，65℃孵育30分鐘，再加終濃度為10μg/ml的蛋白酶K，55℃孵育過夜。用純化液(體積比25:24:1的酚、氯仿與異戊醇的混合液)抽提DNA片段；

(6)富集基因組DNA中的sgRNA

用細(xì)胞裂解液A裂解細(xì)胞，吹打混勻后，加入RNase酶，65℃孵育30分鐘，再加終濃度為10μg/ml的蛋白酶K，55℃孵育過夜。用純化液(體積比25:24:1的酚、氯仿與異戊醇的混合液)抽提DNA片段；

用限制性內(nèi)切酶對基因組DNA進(jìn)行酶切，37℃反應(yīng)過夜，將酶切后的DNA片段放置在0.8wt％的低熔點(diǎn)瓊脂糖膠中，80V，1小時(shí)電泳，切膠回收1600-2000bp的DNA片段；

(7)sgRNA文庫構(gòu)建與測序：

文庫按照illumina公司的建庫試劑盒說明書構(gòu)建，將建好文庫進(jìn)行Hiseq2000的50SE進(jìn)行高通量測序，結(jié)果進(jìn)行生物信息分析。

實(shí)施例2

應(yīng)用于前列腺癌細(xì)胞系LNcap的CRISPR/Cas9應(yīng)用于大規(guī)模篩選癌癥基因靶點(diǎn)的CRISPR/Cas9篩選方法，包括以下步驟：

(1)sgRNA文庫建立：

利用網(wǎng)站http://crisprscan.org和http://www.e-crisp.org在線設(shè)計(jì)與全基因組的sgRNA。sgRNA的載體采用Lenti CRISPRv2。

(2)用慢病毒包裝sgRNA文庫：

無菌條件下，培養(yǎng)293FT細(xì)胞，并用Roche的轉(zhuǎn)染試劑X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent將Lenti CRISPRv2及另外兩種病毒包裝質(zhì)粒psPAX2和pMD2.G包裝慢病毒。按照4：3：1的比例轉(zhuǎn)染293FT細(xì)胞，以10cm的培養(yǎng)皿為例Lenti CRISPRv2、psPAX2、pMD2.G的質(zhì)粒質(zhì)量分別為6μg,4.5μg,1.5μg,X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent的量為30μL。細(xì)胞轉(zhuǎn)染后15小時(shí)換液，并于之后的24小時(shí)和48小時(shí)收取病毒液；

(3)sgRNA文庫在細(xì)胞中篩選：

選取合適的病毒量，感染待檢測的癌細(xì)胞系，感染48小時(shí)后，用puromycin篩選2天,所得陽性細(xì)胞收取部分作為對照組，其他細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)至45天左右后收取。為確定病毒量，要確定病毒的感染效率。發(fā)明利用感染病毒細(xì)胞對puromycin的抗性進(jìn)行檢測。在六孔板中培養(yǎng)細(xì)胞至融合度70％，用50μL、100μL、200μL、400μL、500μL的病毒液感染細(xì)胞，取能感染50％左右細(xì)胞的病毒量作為合適病毒量進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)；

(4)提取篩選所得細(xì)胞及篩選前細(xì)胞的基因組DNA：

用細(xì)胞裂解液A裂解細(xì)胞，吹打混勻后，加入RNase酶，65℃孵育30分鐘，再加終濃度為10μg/ml的蛋白酶K，55℃孵育過夜。用純化液(體積比25:24:1的酚、氯仿與異戊醇的混合液)抽提DNA片段；細(xì)胞裂解液A的成分為400μMNaCl2,0.2％SDS,2mMEDTA,10mMTris-HCl。

(5)富集基因組DNA中的sgRNA

用限制性內(nèi)切酶對基因組DNA進(jìn)行酶切，37℃反應(yīng)過夜，將酶切后的DNA片段放置在0.8wt％的低熔點(diǎn)瓊脂糖膠中，80V，1小時(shí)電泳，切膠回收1600-2000bp的DNA片段；限制性內(nèi)切酶反應(yīng)體系為50μL中：6μg DNA,5μL 10×NEB buffer,限制性內(nèi)切酶EcoNⅠ3μL。

(6)sgRNA文庫構(gòu)建與測序：

文庫按照illumina公司的建庫試劑盒說明書構(gòu)建，將建好文庫進(jìn)行Hiseq2000的50SE進(jìn)行高通量測序，結(jié)果進(jìn)行生物信息分析。

上述的對實(shí)施例的描述是為便于該技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能理解和使用發(fā)明。熟悉本領(lǐng)域技術(shù)的人員顯然可以容易地對這些實(shí)施例做出各種修改，并把在此說明的一般原理應(yīng)用到其他實(shí)施例中而不必經(jīng)過創(chuàng)造性的勞動。因此，本發(fā)明不限于上述實(shí)施例，本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明的揭示，不脫離本發(fā)明范疇所做出的改進(jìn)和修改都應(yīng)該在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。