本發(fā)明涉及生物技術(shù)分析方法領(lǐng)域，具體涉及實時鑒定兩代大豆產(chǎn)品轉(zhuǎn)epsps基因的引物組和探針以及檢測大豆產(chǎn)品是否含轉(zhuǎn)epsps基因的方法。

背景技術(shù)：

第一代轉(zhuǎn)epsps基因大豆(GTS40-3-2)于90年代研發(fā)成功并商業(yè)化種植，我國從2004年至今批準該大豆進口用作原材料加工；第二代轉(zhuǎn)epsps基因大豆(MON89788)于2008年至今被我國批準進口用作原材料加工。第一、二代轉(zhuǎn)基因大豆產(chǎn)品中epsps基因序列不完全相同，只有81％的同源性。采用以前的方法或標準只能鑒定第一代轉(zhuǎn)epsps基因大豆而不能鑒定第二代轉(zhuǎn)epsps基因大豆。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是：提供一種實時鑒定兩代大豆產(chǎn)品轉(zhuǎn)epsps基因的引物組和探針以及檢測大豆產(chǎn)品是否含轉(zhuǎn)epsps基因的方法，主要解決現(xiàn)有技術(shù)不能實時鑒定大豆產(chǎn)品中第二代轉(zhuǎn)epsps基因的問題。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：

實時鑒定大豆產(chǎn)品轉(zhuǎn)epsps基因的引物組和探針，所述探針的序列為：5’-FAM-TCATCGAGCCGATCATGACGCG-TAMARA-3’；

所述引物組包括上游引物和下游引物，所述上游引物和下游引物的序列分別如下：

上游引物：5'-ACACGCCCGGCATCAC-3'；

下游引物：5'-CTGCAGCATCTTTTCCGTATGA-3'。

在上述基礎(chǔ)上，本發(fā)明還提供了利用鑒定大豆產(chǎn)品轉(zhuǎn)epsps基因的引物組和探針檢測大豆產(chǎn)品中是否含轉(zhuǎn)epsps基因的方法，包括以下步驟：

(1)準備鑒定試劑：25.0μL PCR反應體系、含量為25ng/μL的被測大豆DNA稀釋液2μl，所述25.0μL PCR反應體系包括：2×Taqman Master mix 12.5 μL、含量均為10.0μmol/L的上流引物和下流引物各1.0μl、含量為10.0μmol/L的探針0.5μL、10μL無菌蒸餾水；

(2)將2μl含量為25ng/μL的被測大豆DNA稀釋液加入到25.0μL PCR反應體系的熒光定量PCR儀器上進行擴增反應。

進一步地，所述擴增反應包括以下步驟：

(a)在95℃條件下進行DNA預變性反應，時長為10min；

(b)在95℃條件下進行DNA變性反應，時長為15s；

(c)在60℃條件下退火60s；

(d)循環(huán)步驟(b)～(c)45次。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：

(1)本發(fā)明流程簡單，檢測方式科學合理，操作簡便。

(2)本發(fā)明所設(shè)計的引物組和探針在本發(fā)明設(shè)定的檢測方法下能夠準確實時地鑒定大豆制品中是否含有第一代或第二代轉(zhuǎn)epsps基因，填補了現(xiàn)有技術(shù)只能低準確度地鑒定大豆產(chǎn)品中是否含有第一代轉(zhuǎn)epsps基因，而不能實時鑒定大豆產(chǎn)品中是否含有第二代轉(zhuǎn)epsps基因的空白，為消費者對轉(zhuǎn)epsps基因大豆產(chǎn)品所享有的知情權(quán)和選擇權(quán)提供了有力保障。

(3)本發(fā)明在熒光定量PCR儀器上進行擴增反應時，其結(jié)果顯示，只有第一代或第二代轉(zhuǎn)epsps基因大豆樣品能檢測到熒光信號，而空白對照和其他樣品中均不能收集到熒光信號，顯示本發(fā)明設(shè)計的引物組和探針序列的特異性非常高。

(4)本發(fā)明在進行靈敏度測定時，其結(jié)果顯示，在100％的置信水平下，5個拷貝的epsps基因片段均能被檢出，充分顯示本發(fā)明在100％置信水平下具有極高的靈敏度。

附圖說明

圖1為本發(fā)明檢測大豆產(chǎn)品中是否含轉(zhuǎn)epsps基因方法的框圖。

圖2為采用本發(fā)明設(shè)計的引物組和探針檢測轉(zhuǎn)基因玉米、轉(zhuǎn)基因水稻、第 一代和第二代轉(zhuǎn)epsps基因大豆、轉(zhuǎn)基因油菜以及非轉(zhuǎn)基因玉米、水稻、油菜、大豆試驗材料的結(jié)果示意圖。

圖3為采用本發(fā)明檢測體系中5個拷貝的epsps基因DNA片段結(jié)果示意圖。

圖4為采用本發(fā)明在100％置信水平下重復40次進行靈敏度實驗的結(jié)果示意圖。

具體實施方式

下面結(jié)合附圖說明和實施例對本發(fā)明作進一步說明，本發(fā)明的方式包括但不僅限于以下實施例。

實施例

如圖1所示，本發(fā)明主要針對大豆產(chǎn)品中第一代和第二代轉(zhuǎn)epsps基因進行檢測，具體方法如下：

首先，本發(fā)明設(shè)計了一組引物組和探針，以用于在熒光定量PCR儀器上對大豆產(chǎn)品中DNA進行擴增。所述的探針序列為：5’-FAM-TCATCGAGCCGATCATGACGCG-TAMARA-3’；

所述引物組包括上游引物和下游引物，二者的序列分別如下：

上游引物：5'-ACACGCCCGGCATCAC-3'；

下游引物：5'-CTGCAGCATCTTTTCCGTATGA-3'。

接著，在需要檢測大豆產(chǎn)品中是否含轉(zhuǎn)epsps基因時，主要分為兩個步驟，具體如下：

(1)準備鑒定試劑：25.0μL PCR反應體系、含量為25ng/μL的被測大豆DNA稀釋液2μl，所述25.0μL PCR反應體系包括：2×Taqman Master mix 12.5μL、含量均為10.0μmol/L的上游引物和下游引物各1.0μl、含量為10.0μmol/L的探針0.5μL、10μL無菌蒸餾水；

(2)將2μl含量為25ng/μL的被測大豆DNA稀釋液加入到25.0μL PCR反應體系的熒光定量PCR儀器上進行擴增反應，所述的擴增反應包括以下步驟：

(a)在95℃條件下進行DNA預變性反應，時長為10min；

(b)在95℃條件下進行DNA變性反應，時長為15s；

(c)在60℃條件下退火60s；

(d)循環(huán)步驟(b)～(c)45次。

為了進一步理解本發(fā)明，現(xiàn)用以下實例做進一步闡述：

實例1

如圖2所示，采用本發(fā)明所設(shè)計的引物組和探針對已知的轉(zhuǎn)基因玉米、轉(zhuǎn)基因水稻、第一代和第二代轉(zhuǎn)epsps基因大豆、轉(zhuǎn)基因油菜樣品以及非轉(zhuǎn)基因玉米、水稻、油菜、大豆樣品進行檢測，根據(jù)圖2所示結(jié)果可知，本發(fā)明所設(shè)計的引物組和探針只能檢測出大豆產(chǎn)品中第一代和第二代轉(zhuǎn)epsps基因，特異性極高。

實例2

如圖3和4所示，采用本發(fā)明對體系中含有的5個拷貝epsps基因DNA片段進行測試，測試數(shù)據(jù)如表1所示；在100％置信水平下重復40次采用本發(fā)明對反應體系中含有的5個拷貝epsps基因DNA片段進行測試，測試數(shù)據(jù)如表2所示。根據(jù)圖3所示結(jié)果可知，對體系中含有5個拷貝的epsps基因DNA片段，運用本發(fā)明均能準確的鑒定出，根據(jù)圖4所示結(jié)果可知，對40次重復試驗共40次檢測出epsps基因DNA片段。

表1本發(fā)明方法的靈敏度測試結(jié)果

表2 100％置信水平下本發(fā)明方法的靈敏度(檢測下限5copies)測試數(shù)據(jù)

本發(fā)明還利用所設(shè)計的引物組和探針，并采用本發(fā)明對已知結(jié)果的100個 樣品進行實時鑒定。鑒定數(shù)據(jù)及結(jié)果表3所示：

表3采用本發(fā)明實時鑒定已知結(jié)果的100個樣品(表中陽性為樣品中檢測出第一代或第二代epsps基因)

本發(fā)明在熒光定量PCR儀器上進行擴增反應時，運用本發(fā)明設(shè)計的引物組和探針進行特異性檢測，只有第一代和第二代轉(zhuǎn)基因大豆樣品的epsps基因能檢測到熒光信號，而空白對照和其他樣品中均不能收集到熒光信號，顯示本發(fā)明的引物組和探針序列特異性非常高。采用本方法能夠精準檢測到第一代和第二代轉(zhuǎn)基因大豆中epsps基因。本方法靈敏度測定結(jié)果表明，在100％的置信水平下，5個拷貝的epsps基因片段均能被檢出，充分顯示本發(fā)明在100％置信水平下具有極高的靈敏度。因此，本發(fā)明具備突出的實質(zhì)性特點和顯著進步。

上述實施例僅為本發(fā)明的優(yōu)選實施方式之一，不應當用于限制本發(fā)明的保護范圍，但凡在本發(fā)明的主體設(shè)計思想和精神上作出的毫無實質(zhì)意義的改動或潤色，其所解決的技術(shù)問題仍然與本發(fā)明一致的，均應當包含在本發(fā)明的保護 范圍之內(nèi)。