本發(fā)明涉及一種單質粒系統(tǒng)的CRISPRi載體及其制備方法。
背景技術：
：基因沉默技術通過降低基因表達水平改變表型，從而驗證基因的功能，是目前基因功能驗證的重要方法之一。目前，最常用的基因沉默手段主要是RNA干擾(RNAinterference，RNAi)和反義嗎啉代寡核苷酸干擾(Morpholino)。Morpholino是嗎啡啉類似物修飾的反義寡核苷酸，與mRNA前體或與剪切處結合，通過空間位阻特異性抑制翻譯或RNA剪切，實現(xiàn)基因沉默。但該法效應短暫且對成體表型幾乎無影響，只適于生物發(fā)育初期基因功能研究。RNAi是生物體的一種在進化上保持高度保守的、能抵御外源基因或外來病毒侵犯的重要防御機制，是一種由雙鏈RNA誘發(fā)的轉錄后水平的基因沉默現(xiàn)象，廣泛存在于動、植物等各種生物體內，主要用于基因功能分析、基因表達調控、信號傳導、抗病毒、抗腫瘤、發(fā)育機制、發(fā)病機理等的研究。RNAi技術能夠持久的抑制基因的表達，該技術是介導mRNA降解來抑制基因表達，克服了反義嗎啉代寡核苷酸干擾的缺陷，但是該法阻滯效率及準確度較低，阻礙了其發(fā)展。隨著研究的進一步深入，人們發(fā)現(xiàn)當外源基因侵入細菌時，一種成簇而規(guī)律間隔的短回文重復序列(clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats,CRISPR)會將基因片段整合保存，待相同基因片段再次入侵時，CRISPR及其相關蛋白會將該外源基因剪切破壞，這種現(xiàn)象在細菌和古細菌中普遍存在。在細菌和古細菌中，CRISPR是其適應性免疫系統(tǒng)的重要部分。Cas蛋白與crRNA形成復合體，后者以堿基互補配對方式特異性識別外源基因，Cas蛋白發(fā)揮酶活性將其切斷；CRISPR干擾(CRISPRinference,CRISPRi)系統(tǒng)作用機制完全不同于RNAi技術，將Cas9蛋白酶活性去除，復合體僅與目的基因結合而非剪切，直接阻斷編碼區(qū)轉錄。與常用的基因沉默技術相比，CRISPRi技術具有以下突出優(yōu)點:1)與RNAi介導mRNA降解相比，CRISPRi技術直接阻滯DNA轉錄，抑制RNA合成，阻滯級別更高、更準確；2)可對多個靶點同時編輯；3)實現(xiàn)可逆性基因沉默；4)沉默效率較高，載體構建簡單，只需設計目的基因的sgRNA。因此，對CRISPRi技術的研究開發(fā)成為功能基因組學領域的研發(fā)熱點，其將給基因功能研究、基因編輯、建立基因病動物模型、基因治療的發(fā)展帶來新的曙光。麻省理工合成生物學中心的SaraCleto團隊利用CRISPRi技術抑制了谷氨酸棒狀桿菌中的pck與pyk基因表達，減少非目標產物的合成從而提高了目標產物L-賴氨酸與L-谷氨酸在產物中的比例。威斯康辛大學的GinaC.Gordon團隊通過CRISPRi技術抑制藍藻中羧基體相關基因的表達提高了藍藻從大氣中固定二氧化碳的能力，從而提高了藍藻的光合作用效率。上述兩個方案均是采用CRISPRi技術抑制基因的表達，但是其由兩個質粒構建而成，將sgRNA與dCas9蛋白在兩個質粒系統(tǒng)分開表達，需要2次轉化才能完成基因的表達，具有構建過程繁瑣、時間長、效率低的缺陷。技術實現(xiàn)要素：本發(fā)明所要解決的技術問題是克服現(xiàn)有技術的不足，提供一種能夠在一個CRISPR質粒系統(tǒng)中同時表達dCas9和sgRNA，僅需一次轉化即可完成sgRNAscaffold與dCas9蛋白的表達的單質粒系統(tǒng)的CRISPRi載體及其制備方法，該CRISPRi載體構建過程簡單、快速，可大大提高效率。為解決以上技術問題，本發(fā)明采用如下技術方案：本發(fā)明的一個目的是提供一種dCas9載體，所述的dCas9載體的序列如SEQIDNO.6所示，圖譜如附圖2所示。本發(fā)明的另一個目的是提供一種單質粒系統(tǒng)的CRISPRi載體，所述的CRISPRi載體通過將含有sgRNA啟動子和sgRNAscaffold的基因片段重組到經酶切的dCas9載體中獲得。具體地，所述的基因片段還包括酶切位點和重組臂。優(yōu)選地，所述的酶切位點為SpeI酶切位點。具體地，所述的基因片段的序列如SEQIDNO.1所示。具體地，所述的dCas9載體采用SpeI酶進行酶切。具體地，所述的CRISPRi載體的序列如SEQIDNO.2所示。本發(fā)明的第三個目的是提供一種所述的單質粒系統(tǒng)的CRISPRi載體的制備方法，其包括如下步驟：步驟(1)、設計并合成基因片段；步驟(2)、將dCas9載體進行酶切，酶切后，采用瓊脂糖凝膠電泳回收酶切過的dCas9載體；步驟(3)、將所述的基因片段和所述的酶切過的dCas9載體在45～55℃下進行重組反應50～70min得到所述的CRISPRi載體。具體地，步驟(3)中，進行所述的重組反應的反應體系為：本發(fā)明的第四個目的是提供一種單質粒系統(tǒng)的制備方法，其通過將所述的CRISPRi載體轉化到大腸桿菌TOP10F’感受態(tài)細胞中，然后經培養(yǎng)抽取質粒得到所述的單質粒系統(tǒng)。具體地，將所述的CRISPRi載體冷加入到于冰上融化的大腸桿菌TOP10F’感受態(tài)細胞中，混勻，冰浴放置20～40min，然后于40～44℃熱激80～100秒，冰浴1～3min，加入LB培養(yǎng)基，36～38℃恢復培養(yǎng)50～70min，離心后棄去上清，沉淀重懸后均勻涂布氯霉素篩選平板上，于36～38℃培養(yǎng)11～13h，然后挑選單菌落于LB培養(yǎng)基中，放入36～38℃搖床1～2h后，取菌液進行菌檢PCR擴增并測序，將測序結果與設計序列進行比對，確定正確克隆，將正確克隆的菌液抽取質粒，即所述的單質粒系統(tǒng)。由于上述技術方案的實施，本發(fā)明與現(xiàn)有技術相比具有如下優(yōu)點：本發(fā)明利用CRISPRi技術，將dCas9蛋白和sgRNAscaffold構建到一個質粒系統(tǒng)中，實現(xiàn)在一個質粒中同時表達sgRNA和dCas9蛋白。該系統(tǒng)僅需要一次構建、一次轉化即可實現(xiàn)sgRNA和dCas9蛋白的表達，該法過程簡單、高效、快捷，大大簡化質粒構建流程，縮短實驗周期，提高工作效率。附圖說明附圖1為平板上的菌落圖，其中，左圖的平板含氯霉素和不含無水四環(huán)素，菌落呈藍色；右圖的平板含氯霉素和含無水四環(huán)素，菌落呈白色；附圖2為dCas9載體的圖譜。具體實施方式下面結合具體實施例對本發(fā)明做進一步詳細的說明，但本發(fā)明并不限于以下實施例。本發(fā)明中若無特別說明，原料均可市購獲得，方法為本領域的常規(guī)方法。本發(fā)明中的Gibson組裝預混液購自NEB公司的貨號：#E2611S。實施例1：dCas9載體的合成(1)、用常規(guī)基因合成方法合成如SEQIDNO.7～9所示的三個片段；(2)、將這三個片段放到PCR管中，按以下體系加入試劑，并反應；50℃1h4℃∞(3)、然后將反應體系轉化到stbl3感受態(tài)細胞中，然后經后處理得到dCas9載體，其序列如SEQIDNO.6所示，圖譜如附圖2所示。實施例2：1、根據(jù)已知序列設計目標序列：“sgRNA啟動子+酶切位點+sgRNAscaffold表達框”片段，采用常規(guī)基因合成方法合成目標序列。目標序列如SEQIDNO.1所示；其中，重組臂的序列為ACGATATAAGTTGTTGAATTCTAAAGATCT和TTTTTTTGAAGCTTGGGCCCACGAGAGAGA，sgRNA啟動子的序列為TTGACAGCTAGCTCAGTCCTAGGTATAAT，酶切位點的序列為ACTAGT，sgRNAscaffold表達框的序列為GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGC。2、SpeI酶切dCas9載體，反應體系如表1所示，酶切后，瓊脂糖凝膠電泳回收酶切過的dCas9載體。表1組分用量dCas9載體1μgSpeI酶1μl10×SpeIbuffer5μlddH2O補足50μl總體積50μl3、于50℃下反應60min，將合成的“sgRNA啟動子+酶切位點+sgRNAscaffold表達框”片段重組到SpeI內切酶切開的dCas9載體上，并于4℃保存，CRISPRi載體的序列如SEQIDNO.2所示。重組反應體系如表2所示。表24、轉化與涂板將上述重組產物冷加入到于冰上融化的大腸桿菌TOP10F’感受態(tài)細胞中，輕彈管壁數(shù)下混勻，冰浴放置30min。42℃熱激90秒，冰浴2min。加入400～500μLLB培養(yǎng)基，37℃恢復培養(yǎng)60min。5000rpm離心5min后棄去上清，沉淀重懸后均勻涂布氯霉素篩選平板上。于37℃培養(yǎng)12h。5、克隆鑒定：用無菌牙簽挑選單菌落于200μl的LB培養(yǎng)基中，放入37℃搖床1～2h后，取菌液進行菌檢PCR擴增(菌檢與測序引物序列為：F:TCAAAGAGTTGGTAGCTCAG(SEQIDNO.3)；R:ACTCCTGTTGATAGATCCAG(SEQIDNO.4))，菌檢PCR擴增的反應體系如表3所示，擴增程序如表4所示，剩余菌液繼續(xù)放入搖床。6h后將檢到目標大小條帶的菌液送測序4個。測序引物即菌檢引物。將測序結果與設計序列進行比對，確定正確克隆。表3組分用量(μl)菌液3μlF引物1μlR引物1μltaq酶1μl10×taqbuffer3μlddH2O20μldNTPs1μl總體積30μl表46、將正確克隆的菌液抽取質粒，即目標質粒。7、實施例中以LacZ為靶位點設計sgRNA序列，重組到目標質粒上，LacZ-sgRNA序列為(SEQIDNO.5)：AGCTAGCTCAGTCCTAGGTATAATACTAGTAGCGGATAACAATTTCACACGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAAT(其中傾斜部分為重組臂；sgRNA的重組方法同第三步)。8、轉化涂板轉化涂板方法同第四步，平板為氯霉素抗性并添加無水四環(huán)素。9、克隆鑒定克隆鑒定方法同第五步，挑取藍色單克隆菌檢并測序。菌檢與測序引物同第五步。10、將測序鑒定正確的菌液在含氯霉素，+/-無水四環(huán)素的平板上劃線：可見在不含無水四環(huán)素的平板上菌落呈藍色，在含有無水四環(huán)素的平板上菌落呈白色，說明LacZ基因被CRISPRi系統(tǒng)抑制。以上對本發(fā)明做了詳盡的描述，其目的在于讓熟悉此領域技術的人士能夠了解本發(fā)明的內容并加以實施，并不能以此限制本發(fā)明的保護范圍，且本發(fā)明不限于上述的實施例，凡根據(jù)本發(fā)明的精神實質所作的等效變化或修飾，都應涵蓋在本發(fā)明的保護范圍之內。當前第1頁1 2 3